Profilage Glycan des polymères végétaux de la paroi cellulaire en utilisant Microarrays

Isabel E. Moller; Filomena A. Pettolino; Charlie Hart; Edwin R. Lampugnani; William G.T. Willats; Antony Bacic

doi:10.3791/4238

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Résumé

Une technique appelée C Omprehensive M Icroarray P (COMPP) pour la caractérisation des glycanes paroi cellulaire végétale est décrit. Cette méthode combine la spécificité des anticorps monoclonaux dirigés contre des épitopes définis glycane-avec une plate-forme puces à ADN miniature analytique permettant le dépistage de l'apparition glycane dans un large éventail de contextes biologiques.

Résumé

Parois des cellules végétales sont des matrices complexes de glycanes hétérogènes qui jouent un rôle important dans la physiologie et le développement des plantes et de fournir les matières premières pour les sociétés humaines (par exemple, les industries du bois, du papier, du textile et de biocarburants) ^1,2. Cependant, la compréhension de la biosynthèse et la fonction de ces composants reste difficile.

Glycanes parois cellulaires sont chimiquement et conformation diverse en raison de la complexité de leurs blocs de construction, les résidus glycosylés. Ces liens forment en des positions multiples et diffèrent en structure cyclique, la configuration anomérique ou isomérique, et en plus, sont substitués par un réseau de résidus de sucre non. Composition Glycan varie en cellule et / ou types de tissus ou même des sous-domaines d'une seule cellule paroi ^3. En outre, leur composition est également modifiée au cours du développement ^1, ou en réponse à des signaux environnementaux ^4.

En exprocessus de 2.000 gènes ont des parois cellulaires végétales sont des matrices complexes de glycanes hétérogènes été prévus pour être impliqués dans la biosynthèse de la paroi cellulaire et la modification glycane dans ⁵ Arabidopsis. Cependant, relativement peu de gènes de biosynthèse ont été fonctionnellement caractérisé ^4,5. Approches de génétique inverse sont difficiles parce que les gènes sont souvent exprimés de façon différentielle, souvent à des niveaux faibles, entre les types de cellules ^6. En outre, des études mutants sont souvent entravées par la redondance génique ou les mécanismes compensatoires pour assurer la fonction appropriée paroi cellulaire est maintenu ^7. Ainsi, de nouvelles approches sont nécessaires pour caractériser rapidement la diversité des structures des glycanes et de faciliter approches de génomique fonctionnelle de biosynthèse de la paroi cellulaire et la compréhension de modification.

Les anticorps monoclonaux (Acm) ^8,9 ont émergé comme un outil important pour déterminer la structure des glycanes et la distribution des plantes. Ceux-ci reconnaissent distInTC épitopes présents dans les principales catégories de glycanes parois cellulaires végétales, y compris les pectines, les xyloglucanes, les xylanes, les mannanes, les glucanes et arabinogalactanes. Récemment, leur utilisation a été étendue à des expériences de criblage à grande échelle pour déterminer l'abondance relative des glycanes dans un large éventail de plantes et types de tissus simultanément ^9,10,11.

Nous présentons ici une méthode de dépistage basé sur un microréseau glycane appelé complète Microarray Polymer profilage (COMPP) (figures 1 et 2) ^10,11 qui permet de multiples échantillons (100 sec) pour être contrôlés au moyen d'une plate-forme de puces à ADN miniaturisé avec le réactif réduit et des volumes d'échantillon. Les signaux de place sur la puce peuvent être formellement quantifié pour donner données semi-quantitatives sur glycane épitope événement. Cette approche est bien adaptée à suivre l'évolution des glycanes dans des systèmes biologiques complexes ¹² et fournissant un aperçu global de la composition de la paroi cellulaire en particulier lorsque les connaissances antérieures of ce n'est pas disponible.

Protocole

1. Collection de tissus et de préparation

Prélever 100 mg de poids frais des tissus végétaux (un minimum de 10 mg de poids sec) dans au moins trois exemplaires pour chaque tissu d'intérêt. Les étapes suivantes décrivent la préparation de matériau de paroi cellulaire des tissus végétatifs. Dans le cas des tissus de réserve, non désiré par voie enzymatique de l'amidon est enlevé avant de procéder à l'extraction des polymères pariétaux comme décrit précédemment ^13.
Homogénéiser les échantillons en une fine poudre avec de l'azote liquide à l'aide d'un Qiagen TissueLyser II, avec 24 jeux d'adaptateurs de tubes et 3 mm de tungstène carbure de perles (30 Hz, 2 x 30 sec). Alternativement, si seulement quelques échantillons sont en cours de traitement, un mortier et un pilon est utilisé.
Transférez les homogénats dans 10 ml tubes coniques en plastique.
Préparer matériau de paroi cellulaire d'un lavage des homogénats de 10 ml 80% v / v d'éthanol à température ambiante et vigoureusement vortex pendant 2 min.
Centrifuger les échantillons à 3500 xg et éliminer le surnageant. Répétez l'éthanol à 70% se lave au moins trois fois ou jusqu'à ce que le surnageant soit clair, en particulier pour les tissus contenant de la chlorophylle.
Effectuer un lavage final avec de l'acétone à 100% et laisser les pastilles contenant des résidus insolubles dans l'alcool (AIR) sécher à l'air pendant la nuit.
Les échantillons d'air à tamis avec une maille de 0,4 mm ² pour obtenir une poudre fine et homogène et à enlever supérieure, mal particules broyées qui restent un certain temps dans l'homogénat.
Peser un échantillon de 10 mg AIR dans des microtubes contenant chacun un verre de 3 mm perle pour faciliter le mélange des échantillons.

2. Extraction des glycanes paroi cellulaire

Les pectines et les polymères associés aux pectines sont extraites à partir des échantillons en ajoutant 500 ul de 50 uM (pH 7,5) CDTA à chaque échantillon.
Vortex brièvement les tubes pour assurer le solvant est en contact avec le matériau d'échantillon, puis mélanger à l'aide du TissueLyser pendant 3 heures à 8 Hz.
Centrifuger les échantillons à 12.000 xg, soigneusement reMove les surnageants et conserver à 4 ° C.
Laver granulés dans 1 ml d'eau désionisée pour diluer et éliminer tout reste de solvant, vortex et centrifuger à 13000 x g. Répétez cette étape sans perturber le culot et éliminer tout le liquide des tubes avant de passer à l'étape suivante.
Réticulation glycanes sont successivement extraits du reste de la paroi cellulaire culot avec 500 ul de NaOH 4M avec 0,1% p / v NaBH4, en utilisant la même procédure décrite aux étapes de 2,1 à 2,4 pour l'extraction CDTA. NaBH ₄ est ajouté pour réduire l'aldéhyde (ou céto) à l'extrémité réductrice des polysaccharides à un alcool en empêchant ainsi la base de polysaccharides pelage.
Après centrifugation, les surnageants sont à nouveau retiré, stocké à 4 ° C, et les pastilles lavées deux fois dans de l'eau désionisée avant de procéder à l'extraction suivante.
En option, des polymères résiduels, tels que la cellulose sont extraites avec 500 ul cadoxen (31% v / v 1,2-diaminoethane avec 0,78 M CdO) en utilisant la même procédure que celle décrite dans les étapes de 2,1 à 2,4. Sinon, dans l'absolu teneur en cellulose dans des pastilles restantes peuvent être déterminées en utilisant des tests acétique / nitrique (voir Discussion).

3. Microarrays d'impression

Surnageants de centrifugation contenant extrait polymères pariétaux à 13.000 xg pour éliminer toute matière particulaire.
Charger 50 ul de chaque échantillon dans un puits 384 du polypropylène plaque de microtitration en utilisant un schéma pré-établi sur mesure où les échantillons sont disposés selon le type de tissu et le type d'extraction.
Diluer la paroi cellulaire échantillon de polymère dans une série 0, 5 et 25 × dilution en série avec de l'eau déminéralisée.
Des paramètres tels que la hauteur de broche, la collecte et le temps, et les étapes de lavage sont fixés sur le logiciel contrôlant le puces à ADN.
L'humidité de la chambre de l'impression est contrôlée à 60% pour éviter l'évaporation de l'échantillon.
Le travail d'impression est démarré en utilisant LabNEXT logire et un programme qui correspond à la mise en microréseau.
Le robot utilise les repères de canaux capillaires pour imprimer des solutions de l'échantillon sur la plaque 20 x 20 cm membrane de nitrocellulose qui est fixé à une plaque plane dans la machine. Chaque endroit sur le tableau contient 15 nl de solution et est imprimé en trois exemplaires.
Puces identiques sont imprimées côte à côte sur la membrane et les couper en des tableaux individuels après le travail d'impression est terminée.
Dans chaque expérience, les tableaux peuvent être modifiés afin de tenir compte des échantillons plus ou moins, les dilutions ou réplique.

4. Sondage de puces Glycan

Après l'impression, bloquer les puces individuelles dans 5% p / v lait écrémé en poudre dissous dans un tampon phosphate salin (MPBS) à température ambiante pendant 2 heures afin de réduire la liaison non spécifique.
Biopuces de sondes avec des anticorps monoclonaux spécifiques de la paroi cellulaire des épitopes glycane pendant 2 heures dans MPBS. La majorité des ANTIB monoclonalodies contre glycanes parois cellulaires sont disponibles commercialement auprès de trois sociétés; Biosupplies ( www.biosupplies.com.au ), Services Carbosource ( www.carbosource.net ) et PlantProbes ( www.plantprobes.net ).
Inclure un témoin négatif, une puce à ADN incubées avec MPBS seulement et aucun anticorps primaire.
Laver les puces à 3 fois dans du tampon phosphate salin (PBS) pendant 5 min pour éliminer la liaison non spécifique.
Sondez les puces avec un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) dans MPBS pour 2 heures. D'anticorps monoclonaux dirigés contre les plus glycanes paroi cellulaire nécessitent anti-souris ou anti-rat Anticorps secondaires.
Répétez les étapes de lavage 3 fois avec du tampon PBS pendant 5 min pour éliminer la liaison non spécifique.
Développer les puces à l'aide de chromogène (3,3-diaminobenzidine) ou chemiluminecent (luminol) substrats.

5. Quantification

Après le développement, analyser les puces individuelles à l'aide d'une haute résolution (1200 dpi) scanner de bureau et enregistrer les images en négatifs, les fichiers TIFF 16 bits (figure 3).
Calculer l'intensité intégrale de chaque point à l'aide du logiciel de traitement d'image Xplore (LabNEXT) équipé d'un outil automatisé grille. L'intensité de la tache solidaire est dérivée de la somme des pixels dans la zone entourant chaque point de grille.
Les données de la grille pour chaque puce à ADN est exportée sous forme de fichier txt et ne peut être importé manuellement dans une feuille de calcul Excel pour l'analyse. Un outil en ligne ( http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/ ) a été développée pour traduire automatiquement et traiter des données à partir de fichiers txt individuels.
L'intensité de la tache intégrale est moyennée sur l'impression répétitions et des dilutions pour obtenir une place «moyennel'intensité de la «valeur pour chaque échantillon (Figure 2). Alternativement, les signaux correspondants sur place à une seule valeur de dilution de la matrice sont utilisées pour quantifier l'abondance relative de épitope glycane pour chaque échantillon.
Les intensités relatives place moyennes entre les différents échantillons sont présentés comme un heatmap (figure 4) en utilisant des outils de mise en forme conditionnelle dans Excel HeatMapper ou en ligne ( http://bar.utoronto.ca/welcome.htm ). Les données pour chaque type d'anticorps est corrigée à 100 et une valeur de coupure de 5% est prélevée pour supprimer un signal de fond et de faux positifs.