Synthèse de la Phase-shift nanoémulsions à distributions de taille étroite de vaporisation des gouttelettes acoustique et bulles améliorée échographie médiée par ablation

Résumé

Déphasage nanoémulsions (PSNE) peut être vaporisé en utilisant des ultrasons focalisés de haute intensité pour améliorer chauffage localisé et améliorer l'ablation thermique des tumeurs. Dans ce rapport, la préparation de PSNE stable avec une distribution de taille étroite est décrite. En outre, l'impact de PSNE vaporisé à l'échographie médiée par ablation est démontrée dans des tissus imitant fantômes.

Résumé

Ultrasons focalisés de haute intensité (HIFU) est utilisée en clinique pour l'ablation thermique des tumeurs. Afin de renforcer et d'améliorer chauffage localisé ablation thermique des tumeurs, des gouttelettes de perfluorocarbone enrobage lipidique ont été mis au point qui peut être vaporisé par HIFU. La vascularisation dans de nombreuses tumeurs est anormalement perméable en raison de leur croissance rapide, et les nanoparticules sont capables de traverser les fenestrations et passivement s'accumuler dans les tumeurs. Ainsi, le contrôle de la taille des gouttelettes peut se traduire par une meilleure accumulation dans les tumeurs. Dans ce rapport, la préparation des gouttelettes stables d'une nanoémulsion déphasage (PSNE) avec une distribution de taille étroite est décrit. PSNE ont été synthétisés par sonication une solution lipidique en présence de liquide perfluorocarboné. Une distribution de taille étroite a été obtenu par extrusion des temps PSNE multiples en utilisant des filtres avec des tailles de pores de 100 ou 200 nm. La distribution de taille a été mesurée sur une période de 7 jours en utilisant la diffusion dynamique de la lumière. Polyachydrogels contenant rylamide PSNE ont été préparés pour des expériences in vitro. Gouttelettes PSNE dans les hydrogels ont été vaporisées avec des ultrasons et les bulles résultant renforcée chauffage localisé. Vaporisé PSNE permet un chauffage plus rapide et réduit également l'intensité ultrasons nécessaire pour l'ablation thermique. Ainsi, PSNE devrait permettre d'améliorer l'ablation thermique des tumeurs, ce qui pourrait améliorer les résultats thérapeutiques des traitements HIFU médiées par ablation thermique.

Protocole

1. Préparation de la phase-shift Nanoémulsion (PSNE)

1. Dissoudre 11 mg de DPPC et 1,68 mg DSPE-PEG2000 dans le chloroforme
2. Évaporer le solvant organique pour former un film lipidique sec dans un verre ballon à fond rond
3. Dessécher le film lipidique nuit
4. Réhydrater le film lipidique avec 5,5 ml de tampon phosphate salin (PBS)
5. Thermique en solution dans un bain d'eau à 45 ° C jusqu'à ce film lipidique se dissout, vortex périodiquement
6. Transférer la solution lipidique dans 7 ml fiole
7. Soniquer solution lipidique pendant 2 min à 20% d'amplitude
8. Diviser la solution en deux flacons de 2,5 ml chacun (jeter reste, soit 0,5 ml)
9. Ajouter 2,5 ml de PBS dans chaque flacon
10. Placez chaque flacon dans un 0 ° C bain d'eau glacée
11. Ajouter 50 ul DDFP à chaque flacon
12. Soniquer chaque flacon dans un bain d'eau glacée à l'aide des paramètres suivants: amplitude de 25%, mode pulsé (10 sec on, off 50 sec), 60 sec au total sur le temps
13. Transfer solutions PSNE à 20 ml flacons à scintillation
14. Ajouter 5 ml de PBS dans chaque flacon, résultant dans 10 ml volume final
15. Assemblez directions d'extrusion suivants fournis par le fabricant
    1. Rincez chaque pièce avec de l'eau déminéralisée
    2. Placer le disque de support en acier inoxydable dans le centre de la base de support de filtre
    3. Placer la grille en acier inoxydable sur le dessus du disque de support en acier inoxydable
    4. Aide de pincettes, placer une membrane extrudeuse disque de vidange (jusqu'à côté brillant) sur la maille d'acier inoxydable
    5. Aide de pincettes, placer le filtre extrudeuse (jusqu'à côté brillant) sur la membrane du disque de vidange
    6. Placez soigneusement le petit joint torique sur le filtre et placer le haut et thermobarrel extrudeuse-dessus de la base de soutien
    7. Serrez partiellement chaque écrou à ailettes, puis serrer complètement les écrous à la main-aile en alternance
    8. Branchez l'extrudeuse pourune conduite de gaz d'azote
    9. Pour amorcer l'extrudeuse, une pipette 10 ml d'eau déminéralisée dans le port échantillon du haut, boucher l'ouverture, et serrer la soupape d'aération
    10. Ouvrir lentement la conduite de gaz d'azote pour augmenter la pression, forçant l'échantillon à travers les membranes, et recueillir l'échantillon à partir de la tubulure de sortie
    11. Après utilisation, démonter dans l'ordre inverse, rincer les pièces extrudeuse avec de l'eau déminéralisée, et jeter le filtre à membrane et le disque de membrane de drainage
16. Pour 100 nm seulement gouttelettes, condition préalable PSNE par extrusion 10 fois à travers 200 nm filtre
17. Extruder PSNE 16 fois à travers 100 nm ou 200 nm filtre pour obtenir la distribution de taille étroite

2. Préparation d'hydrogel de polyacrylamide contenant PSNE

1. Préparer une solution BSA 24% en diluant 1,2 g de BSA poudre dans 5 ml d'eau déminéralisée
2. Préparer la solution APS 10% en poudre 0,1 diluée APS g dans 1 ml désionisée water
3. Dans l'ordre suivant, mélanger 2,1 ml solution d'acrylamide, 1,2 ml de tampon Tris, 0,1 ml APS 10%, 4,5 ml d'une solution 24% de SAB, et 3,6 ml d'eau déminéralisée dans la chambre en matière plastique
4. La chaleur à 40 ° C sous vide et le lieu pendant 1 heure
5. Ajouter 480 ul de PSNE et bien mélanger en remuant doucement la chambre en plastique.
6. Ajouter 12 ul de TEMED et placer l'enceinte dans un bain d'eau 12 ° C pendant 2 heures

3. Les résultats représentatifs

Un schéma de l'installation pour des expériences ultrasons avec des fantômes d'hydrogel tissus imitant est illustré à la figure 1. Ce protocole se traduit par des gouttelettes de perfluorocarbone à enrobage lipidique avec une distribution de taille étroite qui sont stables en solution pendant au moins une semaine. La distribution de taille mesurée par diffusion dynamique de la lumière (analyseur 90PIus la taille des particules, la société Brookhaven Instruments, Holtsville, NY) est illustré à la figure 2 pour PSNE extrudé en utilisant 100 et 200filtres nm. Le diamètre PSNE efficace au fil du temps, mesuré par diffusion dynamique de la lumière, est répertorié dans le tableau 1, ce qui démontre que PSNE sont stables pendant au moins une semaine. B-mode de PSNE images avant et après vaporisation dans un hydrogel de polyacrylamide sont présentés dans la figure 3. Également, une lésion formée par 15 secondes de HIFU médiée par chauffage dans un hydrogel de polyacrylamide contenant de l'albumine et PSNE est représenté sur la figure 4. La forme asymétrique de la lésion est le résultat de chauffage prefocal qui se produit en raison de la présence de la bulle nuage dans le trajet des ultrasons. Il est important de noter que le chauffage et la formation prefocal lésion due à la dispersion de bulles peut être minimisé en réduisant la puissance acoustique émise.

Figure 1. Schéma du montage expérimental pour ultrasons expériences avec des tissus mimIcking hydrogels.

Figure 2. Taille distribution de PSNE extrudé à travers 100 nm ou 200 nm filtres, mesuré par diffusion dynamique de la lumière. Les unités de l'axe des ordonnées sont basés sur l'intensité de la lumière diffusée par les particules d'une certaine taille par rapport à l'intensité totale de lumière diffusée par l'échantillon.

La figure 3. Mode B images (a) avant et (b) après vaporisation PSNE dans un hydrogel de polyacrylamide. La flèche indique la zone focale où un nuage de bulles a été formé par vaporisation PSNE.

Images Figure 4. D'polyacrylamide d'hydrogel contenant de l'albumine et PSNE (a) avant et (b) après vaporisation et sonication par HIFU, ce qui démontre la formation de lésions à la suite d'ultrasons induite par chauffage. La fréquence centrale échographie était de 3,3 MHz. Le signal ultrasonore se composait d'un premier 30-cycle, 6,4 W impulsion pour vaporiser PSNE, immédiatement suivie par 15 secondes d'ultrasons en continu à 0,77 W.

Quelques jours après l'extrusion	Extrudé avec filtre à 200 nm		Extrudé avec filtre à 100 nm
	Moyenne Dia. (Nm)	Std. Dev. (Nm)	Moyenne Dia. (Nm)	Std. Dev. (Nm)
1	182,9	4,9	118,0	0,9
7	177,7	2,5	124,8	3,1

Tableau 1. Diamètre moyen et écart-type de PSNE à un et sept jours après l'extrusion de 100 nm et 200 nm filtres.

Discussion

Ultrasons focalisés de haute intensité (HIFU) est utilisée en clinique pour l'ablation thermique des tumeurs. ¹ Pour améliorer chauffage localisé et améliorer l'ablation thermique des tumeurs, des gouttelettes de perfluorocarbone enrobage lipidique ont été mis au point qui peut être vaporisé par HIFU. La vascularisation dans de nombreuses tumeurs est anormalement perméable en raison de leur croissance rapide. ² Ainsi, les nanoparticules sont capables de traverser les fenestration...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom commun	Fabricant	Cat. Nombre	Nom complet / Description
DPPC	Les lipides Avanti, Birmingham, AL, États-Unis	850355P	1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine
DSPE-PEG2000	Les lipides Avanti, Birmingham, AL, États-Unis	880120P	1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy (polyéthylène glycol) -2000] (sel d'ammonium)
DDFP	Fluoromed, Round Rock, TX, USA	CAS: 138495-42-8	Dodécafluoropentane (5 F C 12)
PBS	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	P2194	Tampon phosphate salin
Chloroforme	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	372978	Chloroforme
L'acrylamide	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	A9926	40% d'acrylamide 19:01 / bis-acrylamide
Tampon Tris	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T2694	1M, pH 8, chlorhydrate Trizma et Trizma de base
BSA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	A3059	Sérum-albumine bovine
APS	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	A3678	Solution de persulfate d'ammonium
TEMED	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	87689	N, N, N ', N'-tétraméthyléthylènediamine
			Équipement
Sonicator (3 astuce mm)	Sonics & Materials, Inc, Newtown, CT, USA	Vibra-Cell
Bain d'eau	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	Neslab EX-7
Extrudeuse	Northern Lipids, Burnaby, BC, Canada	LIPEX
Filtres extrudeuse	Whatman, Piscataway, NJ, USA	# 110605 Nuclepore et # 110606
Extrudeuse de vidange disque	Sterlitech Corporation, Kent, WA, États-Unis	# PETEDD25100
Chambre plastique	US Plastic Corporation, Lima, OH, USA	# 55288, 1 3/16 "x1 3/16" x2 7/16 "