La délétion de gènes dans le génome entier<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Par PCR à haut débit

Résumé

Une échelle du génome unique efficace méthode de mutation du gène a été établie à l'aide Streptococcus sanguinis Comme organisme modèle. Cette méthode a réalisé via PCR à haut débit recombinantes et des transformations.

Résumé

Transposon mutagenèse et un seul gène suppression ya deux méthodes appliquées dans inactivation du gène du génome entier dans ^1,2 bactéries. Bien mutagenèse par transposon prend moins de temps, moins coûteux, et ne nécessite pas l'information du génome terminée, il ya deux faiblesses de cette méthode: (1) la possibilité d'une mutants disparates dans la bibliothèque mixte mutant qui contre-sélectionne les mutants où la concurrence est diminué; et (2) la possibilité d'inactivation partielle de gène par lequel les gènes ne sont pas entièrement perdent leur fonction après l'insertion d'un transposon. Analyse par deletion seul gène peut compenser les inconvénients liés à la mutagenèse par transposon. Pour améliorer l'efficacité de l'ensemble du génome délétion du gène unique, nous essayons de mettre en place une technique à haut débit pour l'ensemble du génome délétion du gène unique à l'aide sanguinis Streptococcus comme organisme modèle. Chaque délétion du gène construire dans S. sanguinis génome est conçu pour comporter 1Kb en amont du gène ciblé, le gène aphA-3, codant pour la protéine de résistance à la kanamycine et le 1-ko aval du gène ciblé. Trois ensembles d'amorces F1/R1, F2/R2 et F3/R3, respectivement, sont conçues et synthétisées dans un format de plaque à 96 puits pour PCR des amplifications de ces trois composantes de chaque suppression construire. R1 et F3 amorces contiennent 25-pb des séquences qui sont complémentaires de régions de la aphA-3 du gène à leur extrémité 5 '. A grande échelle amplification par PCR du gène aphA-3 est effectuée une fois pour toutes les constructions de deletion création d'un seul gène. Le promoteur de gène aphA-3 est initialement exclu de réduire au minimum l'effet potentiel polaire de cassette kanamycine. Pour créer les constructions de deletion du gène à haut débit amplification par PCR et la purification sont effectuées dans un format de plaque à 96 puits. Un amplicon PCR recombinante linéaire pour chaque délétion du gène sera constitué par quatre réactions PCR en utilisant l'ADN polymérase haute fidélité. Le expon initialephase de croissance préférentiel de S. sanguinis cultivées en bouillon Todd Hewitt supplémenté avec 2,5% de sérum de cheval inactivé est utilisé pour augmenter la compétence pour la transformation de la PCR recombinante constructions. Sous cette condition, jusqu'à 20% de S. sanguinis cellules peuvent être transformées en utilisant ~ 50 ng d'ADN. Sur la base de cette approche, 2.048 mutants avec un seul gène de suppression ont finalement été obtenus à partir des gènes chez S. 2270 sanguinis l'exclusion des quatre ORF du gène entièrement contenue dans d'autres ORF de S. SK36 sanguinis et 218 gènes potentiels essentielles. La technique sur la création de constructions de deletion du gène est un débit élevé et pourrait être facile à utiliser dans l'ensemble du génome délétions de gènes uniques pour toutes les bactéries transformables.

Protocole

1. Conception Primer

1. Les amorces sont conçues à l'aide de scripts maison basé sur le S. séquence du génome sanguinis SK36. Trois ensembles d'amorces, F1/R1, F2/R2, F3/R3 et sont conçus pour l'amplification de la séquence 1-kb en amont du gène cible, la résistance aphA-3 du gène codant pour la kanamycine (Km ^r), et la protéine ³ 1 -kb de séquence en aval du gène cible, respectivement (figure 1). Parmi ces amorces, F1 et R3 sont conçus à l'aide de la suite ePrimer3 EMBOSS de programmes ( http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html ) pour amplifier des régions flanquantes en amont ou en aval de la cible gène. Amorces spécifiques de gènes, R1 et F3, sont conçus en fonction de la 5 'et 3' des séquences du gène cible. R1 et F3 amorces contiennent les séquences d'adaptateur 25-BP à leur extrémité 5 'qui sont complémentaires de la aphA-3gène. Les températures de fusion de chacune des amorces ont été conçues pour être aussi proche que possible de 60 ° C pour permettre l'utilisation d'une température de recuit uniforme pour toutes les réactions de PCR en format de 96-puits.
2. F1, R1, R3 F3 et les amorces sont synthétisées dans des plaques 96 puits sur la base d'un ordre des gènes. Chaque plaque contient un type d'amorces dans l'ordre même gène. Diluer les amorces en plaque de 96 puits d'amorce de travail à une concentration finale de 10 pM pour l'amplification PCR à l'aide d'une pipette multicanaux.

2. À haut débit amplification par PCR et purification

1. Pour amplifier à haut débit de 1 kb en amont ou en aval de la cible S. gènes sanguinis, assembler un mélange cocktail PCR sur de la glace dans un tube conique de 15 ml contenant 1640 pi ddH ₂ O, 250 pi 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 200 ul de 10 mM de dNTP mélange, 100 ul de 50 mM MgSO _4, 100 pi de 10 ng / ul S. l'ADN génomique SK36 sanguinis et 10 pl Platinum Taq ADN polymerase de haute fidélité et de transfert 23 ul du mélange dans chaque puits de plaque de 96 puits PCR à l'aide d'une pipette multicanaux. Transférer 1 ul de chaque F1 et R1 (ou F3 et R3) à partir de 10 uM de travail plaques d'amorces pour la plaque PCR en utilisant une pipette multicanaux. Sceller la plaque PCR et l'amplification à 94 ° C pendant 1 min et 30 cycles de 94 ° C pendant 30 secondes, 54 ° C pendant 30 secondes et 68 ° C pendant 1,5 min.
2. Préparez 1% gel d'agarose contenant du bromure d'éthidium à 48 puits multicanal chargement pipette raccord. Mélanger 4 ul produit PCR avec 1 pi de tampon de chargement 5xDNA sur plaque de 96 puits et de charger les échantillons sur un gel d'agarose à l'aide d'une pipette multicanaux 10 pi. Exécuter électrophorèse à 135 V pendant 30 min. Examinez la bande sur un gel de la documentation en vertu UVP et d'analyse.
3. Purifier produits de PCR par 96 PureLink kit de purification PCR en utilisant la centrifugation conformément aux instructions du fabricant. Pour l'élution de l'ADN, ajouter 40 ul stériles ddH ₂ O pour le bien de la bROUVER plaque.
4. Choisir au hasard plusieurs amplicons purifiés sur la plaque d'examiner les concentrations d'ADN en utilisant un spectrophotomètre NanoDrop. Ajuster la concentration d'amplicons sur la plaque à ~ 10 ng / ul.
5. Un plasmide contenant la cassette kilomètres ^r est digéré par EcoRI comme matrice de PCR. Le plasmide digéré est purifié par le kit QIAquick PCR purification et l'ADN plasmidique linéaire est ajustée à la concentration finale d'ADN à 10 ng / ul. Monter 25 ul de mélange amplicon km cassettes ^r dont 16,4 ul O ddH _2, 2,5 pi 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 ul de 10 mM de dNTP mélange, 1 ul de 50 mM de Mg SO _4, 1 pl de 10 uM F2, 1 pl de 10 R2 uM, 1 pi d'ADN plasmidique linéaire et 0,1 ul fidélité Platinum Taq ADN polymérase haute. Effectuer une amplification PCR à 94 ° C pendant 1 min, et 30 cycles de 94 ° C pendant 30 sec, 55 ° C pendant 30 s et 68 ° C pendant 1 min. Examiner le produit de PCR par électrophorèse sur gel d'agarose 1%. Poola majeure partie de l'amplicon km cassettes ^r de 10 individus PCR purifié par le kit QIAquick PCR purification. Ajuster la concentration amplicon à 10 ng / ul.
6. Pour obtenir le dernier linéaire amplicon de PCR recombinant, trois amplicons PCR sont combinés les uns avec les pl 1 (en des quantités à peu près égales molaire) dans une plaque de PCR ainsi que la matrice de PCR. D'autres composants PCR est ajouté dont 14,4 ul O ddH _2, 2,5 pi 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 ul de 10 mM de dNTP mélange, 1 ul de 50 mM de Mg SO _4, 1 ul de 10 uM F1, 1 pl de 10 uM R3, 0,1 pi d'ADN Platinum Taq polymérase haute fidélité. L'amplification par PCR est effectuée à 94 ° C pendant 2 min, 30 cycles de 94 ° C pendant 30 sec à 55 ° C pendant 30 s et 68 ° C pendant 3,5 min, et enfin 68 ° C pendant 4 min.
7. Examinez le amplicons PCR sur gel d'agarose. Purifier et quantifier les amplicons de PCR comme décrit ci-dessus. Geler les amplicons PCR recombinés à -20 ° C.

3. Comcompétente Préparation des cellules

1. Bouillon Todd Hewitt est préparé, pH ajusté à 7,6 avec du NaOH 10 N, on chauffe à ébullition, puis refroidi à température ambiante et on stérilise à l'aide de polystyrène 0,22 um filtre ^4. Ajouter 300 ul cheval inactivé par la chaleur sérums (concentration finale de 2,5%) à 11,7 ml de bouillon Todd Hewitt dans 15 ml tube conique de rattraper TH + support HS. TH + HS aliquote milieu dans 2 ml et 10 ml dans des tubes.
2. Inoculer 5 ul de stock S. sanguinis SK36 congelé à -80 ° C en 2 TH ml + support HS et incuber la culture d'une nuit avec le plafonnement bien à 37 ° C, accompagnée de pré-incubation de 10 ml-TH + HS tube.
3. Après une nuit, transférer 50 ul culture dans 10 ml TH + HS et incuber le tube à 37 ° C pendant 3 heures (correspondant à DO ₆₆₀ de 0,07 à 0,08), immédiatement à l'aide d'une transformation.

4. Transformation cellulaire et de sélection des antibiotiques

1. Ajouter 2 ul de 70 ng S. sanguinis SK36 compétence peptide stimulant (CSP) et 2 pi linéaire recombinant amplicon de PCR (~ 50 ng) pour tubes Eppendorf de 96 puits à bloc et préchauffer les à 37 ° C. Transfert 330 ul de 3 h-incubé SK36 la culture dans chaque tube. Incuber à 37 ° C pendant 1 heure. Remplacer l'ADN avec O stérile ddH ₂ comme contrôle.
2. Placez le bloc sur la glace et se propager 100 ul de chaque transformation sur bouillon coeur-cervelle (BHI) plaque de gélose avec 500 ug / ml de kanamycine. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 2 jours dans des conditions micro-aérobies.

5. Confirmation mutant et de stockage

1. Pour chaque mutant remplacement, au hasard, relever 2 colonies individuelles, inoculer la colonie dans 5 ml de BHI contenant 500 ug / ml de kanamycine et incuber l'inoculum microaérobie une nuit à 37 ° C. Cryoconservation de chaque culture dans du glycérol 30% à -80 ° C
2. Afin de déterminer si le mutant contenant le gène de remplacement prévu, effectuer une PCR sur colonie pour chaque mutant en utilisant F1 et R3amorces dans plaque de 96 puits PCR. Environ 1-pi culture d'une nuit de colonie individuelle est utilisée en tant que matrice d'ADN dans le 25-pl réaction d'amplification par PCR. La PCR est réalisée à 94 ° C pendant 5 min, 35 cycles de 94 ° C pendant 30 sec, 55 ° C pendant 30 s et 68 ° C pendant 3,5 min, et enfin 68 ° C pendant 4 min.
3. Pour identifier avec précision double bande mutants ou contaminant amplicons PCR, d'examiner l'amplicon PCR par électrophorèse pendant 4 heures sur> 12 cm de long 2% gel d'agarose avec coloration au bromure d'éthidium. Sous cette condition électrophorèse sur gel d'agarose, les amplicons avec ≥ 100 pb différence ont été clairement identifiés. Lorsque des bandes résultant de l'amplification de la cassette de ^r km et le gène de type sauvage sont prévus pour différer par <100 pb, une amorce T1 interne est utilisée pour déterminer si un gène de type sauvage peut être détecté par PCR.
4. Pour confirmer la suppression, les amplicons sont purifiés par PureLink 96 PCR purification kit et séquencé en utilisant l'amorce P1 quise lie à la cassette ^r km. Ne garder que les mutants correctes confirmés par séquençage.

Résultats

Après amplification par PCR en utilisant des amorces F1 et R1, R3 et F3 et, approximativement 1-kb en amont et en aval de chaque S. sanguinis gène ont été obtenus dans le format 96-puits, respectivement (figure 2A). Dans nos conditions de PCR utilisant des amorces conçues et, un produit spécifique a été amplifié à partir de S. sanguinis ADN génomique dans chaque réaction PCR. Ce résultat indique les amorces étaient très spécifiques à la cible de S. sanguinis. ...

Discussion

Pour minimiser les effets possibles polaires du remplacement d'un gène ciblé avec le gène exogène antibiotiques sur les gènes voisins, deux mesures sont prises en amorce initiale de conception. Pour la plupart des gènes délétés, la amorces R1 et F3 sont conçus pour supprimer de la région codante de 6 pb après le codon d'initiation de 30 pb avant le codon stop. Les 30 dernières paires de bases sont conservées pour protéger le potentiel du site de liaison ribosomique utilisé par le gène adjacent e...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primer F2	Integrated DNA Technologies	TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT
Ibid	CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT
Ibid	GATAAACCCAGCGAACCATTTGA
Ibid	GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA
Ibid	GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC
Primer 5 'end_R1_seq	Ibid	GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA
Primer 5 'end_F3_seq	Ibid	GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG
Primer 5 'end_R1p_seq	Ibid	CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC
CSP	Synprep	Séquence: NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH
Invitrogen	11304-102	Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity
EcoRI	New England Biolabs Inc	R0101S
Agar	Bioanalytique américain	AB01185
Agarose	Promega	V3125
BHI	BD Biosciences	237500	Brain Heart Infusion
Sérum de cheval	Fisher Scientific	SH3007403	Sérum de cheval
KM	Fisher Scientific	BP906-5	Kanamycine
TH bouillon	BD Biosciences	249240	Bouillon Todd Hewitt
PureLink 96	Invitrogen	K310096	PureLink 96 PCR purification kit
QIAquick	Qiagen	28106	Kit QIAquick PCR purification
Filtre	Corning	431117	Filtre de 0,22 um polystyrène
Système Anoxomat	Mart Microbiology BV	Anoxomat Mark II
Centrifugeuse de paillasse	Thermo Scientific	75004377	Sorvall Legend RT plus microplaque rotor
UVP LLC	BioDoc-It 210
Incubateur	Fisher Scientific	11-690-625D	Isotemp
Labnet Gel XL	Labnet	E0160	Labnet Gel XL
Microcentrifugeuse	Eppendorf	22621408	Microcentrifugeuse 5415 R
Thermo Scientfic	4661040, 4661020	Finnpipette F1
Thermocycleur	Applied Biosystems Inc	N805-0200	GeneAmp PCR System 9700