La perfusion intravasculaire de carbone d&#39;encre noire permet une visualisation fiable des vaisseaux cérébraux

Mohammad R. Hasan; Josephine Herz; Dirk M. Hermann; Thorsten R. Doeppner

doi:10.3791/4374

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Résumé

Analyse de l'anatomie vasculaire cérébral des rongeurs joue un rôle important dans la recherche sur l'AVC expérimental. Dans ce contexte, la perfusion intravasculaire avec du latex coloré a été considéré comme un outil standard pour plusieurs années. Cependant, cette technique implique des limitations techniques distinctes, qui nuisent à sa reproductibilité. Nous décrivons ici une méthode simple pour visualiser les vaisseaux cérébraux de façon reproductible. Injection d'un mélange de deux encres noires de carbone disponibles dans le commerce par le biais des résultats du myocarde du ventricule gauche dans le remplissage adéquat des vaisseaux cérébraux avec visualisation à contraste élevé. Nous avons appliqué avec succès cette technique pour identifier les points anastomotiques entre les territoires vasculaires cérébraux de souris avec différents fonds génétiques. Nous avons finalement témoigner que ce nouveau procédé et simple pour la coloration navire peut être combiné avec du chlorure de triphényltétrazolium (TTC) coloration - un outil largement utilisé pour observer et analyser volumes d'infarctus chez la souris.

Résumé

La structure anatomique des vaisseaux cérébraux est un facteur déterminant pour l'hémodynamie du cerveau ainsi que la gravité des blessures à la suite lésions ischémiques. Le système vasculaire cérébral répond dynamiquement aux différents états physiopathologiques et elle présente des différences considérables entre les souches et dans des conditions de manipulations génétiques. Essentiellement, une technique fiable pour la coloration vaisseaux intracrâniens est indispensable pour étudier la pathogenèse de l'AVC ischémique. Jusqu'à tout récemment, un ensemble de techniques différentes ont été utilisées pour visualiser la vascularisation cérébrale, y compris l'injection de résine de faible viscosité, araldite F, de la gélatine mélangée avec divers colorants ¹ (c.-à-rouge carmin, encre de Chine) ou en latex avec ² ou sans ³ du noir de carbone. Perfusion de latex composé blanc à travers l'aorte ascendante a été d'abord rapporté par Coyle et Jokelainen ^3. Maeda et al. ² ont modifié le protocole en ajoutant carbon encre noire pour le composé de latex pour un meilleur contraste de visualisation des vaisseaux après une perfusion saline du cerveau. Cependant, la perfusion inefficace et un mauvais remplissage des navires sont souvent vécu en raison de la viscosité élevée du composé de latex ^4. Par conséquent, nous avons décrit une technique simple et rentable en utilisant un mélange de deux encres de carbone commercialement disponibles noir (CB1 et CB2) pour visualiser la vascularisation cérébrale de façon reproductible ^5. Nous avons montré que la perfusion avec CB1 CB2 + dans les résultats de la souris, la coloration des vaisseaux cérébraux significativement plus petits à une densité plus élevée par rapport à la perfusion latex ^5. Ici, nous décrivons notre protocole d'identifier les points anastomotiques entre la partie antérieure (ACA) et les artères cérébrales moyennes (MCA) pour étudier les variations des navires dans les souris de différentes origines génétiques. Finalement, nous démontrons la faisabilité de notre technique dans un modèle transitoire ischémie cérébrale focale chez la souris en combinant CB1 +Coloration navire CB2 médiée par coloration TTC à des degrés divers de lésions ischémiques.

Protocole

1. Animaux

Des expériences ont été réalisées selon les directives du NIH pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et approuvé par les autorités locales. Pour toutes les expériences, C57BL6 / J souris de type sauvage, apolipoprotéine ^{- / -} (ApoE KO) et SV129 souris (12-16 semaines, 26-30 g de poids corporel, 5-6 animaux par groupe expérimental) ont été utilisés.

2. Coloration des vaisseaux cérébraux avec du latex coloré

Préparer un mélange de 25 ul encre de carbone noir (Herlitz, Allemagne) avec 0,5 ml de composé de latex (Pébéo, France) dans un rapport 1:20 dans un tube PE et faites chauffer le mélange à 37 ° C dans un bain-marie. Recueillir le mélange dans une seringue 2 ml munie d'une aiguille de 28-30G avant que l'animal anesthésié.
Dissolvez 50 mg de poudre de chlorhydrate papavarine dans 1 ml de solution saline normale stérile. Recueillir la solution dans une seringue à insuline. Casser l'aiguille d'une autre seringue à insuline stérile. Placer cette aiguille à l'extrémité d'un c 20m PE10 tube. Maintenant fixer ce tube PE10 sur l'aiguille de la seringue contenant la solution de chlorhydrate d'insuline papavarine à être injecté dans la veine fémorale pour assurer un remplissage convenable et vasodilatation des vaisseaux.
Préparer deux autres seringues à insuline contenant chacun 1 ml de solution saline. Seringues à insuline permet une libération lente du fluide injecté à un endroit précis. Toutefois, en raison de la viscosité élevée de latex, de remplacement des seringues de 1 ml avec aiguilles amovibles plus larges devraient être utilisés.
Prendre toutes les seringues et les instruments stérilisés dissection proches de la phase d'exploitation. Étendre une feuille de drapier chirurgicale autour de la phase d'exploitation. La phase d'exploitation devrait être suffisamment éclairée et d'un microscope opératoire peut être utilisé si nécessaire.
Maintenant, mesurer le poids du corps d'une souris C57BL6 / J puis induire une anesthésie avec l'isoflurane 5% vaporisé dans 70% de N ₂ O et 30% d'O _2. Continuer anesthésie avec de l'isoflurane 1% vaporisé. Après POSITIONNEMENT bong de la souris sur le dos et les branches de fixation, d'évaluer la profondeur de l'anesthésie. Ensuite, couper la peau au-dessus de la veine fémorale gauche et localiser la veine. Insérez l'extrémité pointue de l'aiguille placée sur le tube PE10 et injecter lentement une solution de chlorhydrate papavarine à un taux de 100 pi par min (50 poids corporel mg / kg).
Après l'injection, couper la cavité abdominale et percer la membrane. Couper les côtes pour exposer le cœur sans endommager ou ecchymoses il. Fixez le aorte thoracique descendante avec une pince hémostatique. Faites une coupe nette sur l'oreillette droite pour permettre au sang veineux s'écouler. Injecter 2 ml de solution saline dans le ventricule gauche, suivie par l'injection du latex coloré manuellement avec une légère pression sur 18-20 sec. Utiliser les seringues pré-remplies l'une après l'autre. Éviter d'injecter des bulles.
Après l'injection de latex, de laisser l'animal pendant 5 min. Décapiter l'animal et retirez avec précaution l'ensemble du cerveau. Prenez bien soin de ne pas blesser l'architecture des navires et cortex tout en enlevant les os du crâne et des méninges. Placez le cerveau dans une boîte de culture cellulaire de 60 mm contenant 6-8 ml de PFA à 4% pour prendre une photo. Placez une règle de mesure sous la parabole transparente. Prenez des photos avec un grossissement 25x de la dorsale et la face ventrale du cerveau avec une caméra fixée dans le microscope opératoire. Les photos doivent être prises à un angle de 90 ° entre la boîte de Pétri et l'objectif du microscope afin de quantifier la distance d'origine.
Répétez la procédure dans un autre animaux 4-5.

3. Coloration des vaisseaux cérébraux avec mélange d'encres noir de carbone

Pour comparer les résultats de latex à base de coloration vasculaire cérébral avec notre protocole, préparer un mélange de 100 pi de Herlitz Stempelfarbe d'encre (CB1) avec 900 pi de Pelican Scribtol encre Schwarz (CB2) dans un tube de 1,5 ml EP. Préparer deux tubes PE pour obtenir un volume total de 2 ml de mélange de CB1 et CB2 dans un rapport de 1:9. Recueillir le mélange dans deux seringues à insuline séparées (1ml chacune). Reboucher les seringues et les placer dans un bain d'eau à chauffer à 37 ° C. Recueillir 2 ml de solution saline dans un autre seringues à insuline deux et placez-les dans un bain d'eau aussi bien.
Anesthésier l'animal et répétez la même procédure que celle décrite précédemment pour l'injection de chlorhydrate de papavarine. Suite à l'injection de 2 ml salaine dans le ventricule gauche, injecter un mélange de 2 ml d'encres noir de carbone à la place du latex coloré. Effectuer les injections à la main avec une légère pression sur 18-20 sec par ml. Fixez le aorte thoracique descendante avant les injections.
Sacrifier l'animal, retirez le cerveau et prendre des photos.
Pour préservation à long terme du cerveau, mettre le cerveau en PFA à 4% durant la nuit suivie d'une incubation avec du saccharose avec une concentration progressivement croissante jusqu'à ce que le cerveau flottant submerge totalement (5% puis 15% puis 30%). Cerveaux des animaux perfusés avec du latex coloré peut aussi être conservé de la même manière.
Effectuez l'procédure dans un autre animaux 4-5. Pour comparer la différence de l'anatomie vasculaire cérébral dû à bagage génétique différent ou souches, répéter le protocole en nombre égal de ApoE KO et SV129 souris, respectivement.
Pour étudier l'anatomie vasculaire dans des conditions ischémiques, induire une ischémie cérébrale focale transitoire pendant 45 min ou 90 min selon un protocole standard de l'occlusion intraluminale de la MCA sous anesthésie profonde (une description détaillée de l'opération dépasse le cadre de cet article, le lecteur est renvoyé à Doeppner et al., 2010). A la fin de la période de reperfusion prévu (1 jour ou 5 jours), effectuer la coloration vasculaire avec CB1 CB2 + uniquement les encres et tacher le cerveau entier avec une solution à 2% TTC à 37 ° C pendant 5-10 min pour identifier le volume de l'infarctus . TTC est réduit en formazan coloré en rouge par les enzymes mitochondriales (en particulier le succinate déshydrogénase). Après coloration TTC, les taches des tissus métaboliquement actifs profonde en rouge lorsque le tissu infarci reste unstainie et apparaît en blanc en raison de dysfonctionnements enzyme mitochondriale et dénaturé. Recueillir des images de la même manière que décrit ci-dessus.

4. Etude des Territoires vasculaires cérébraux

Pour analyser l'anatomie des vaisseaux cérébraux, des images de la surface dorsale du cerveau, soit colorées avec du latex coloré ou CB1 CB2 + encres peuvent être analysées avec le logiciel ImageJ (un logiciel Java domaine public utilisé pour le traitement d'images et l'analyse). Brains perfusés avec du latex coloré peut présenter des degrés variables de coloration navire situé sur la face dorsale, tandis que CB1 CB2 + perfusion tacher tous les navires sur les deux faces ventrales et dorsales.
Ouvrir un fichier image avec le logiciel ImageJ. Identifier tous les points anastomotiques entre l'ACA et le MCA. Un point d'anastomose est défini comme le lieu où le diamètre de la cuve est plus étroit ou la moitié de la distance entre les points les plus proches de ramification de l'ACA et les branches MCA, respectivement ^2. ^{Tracez une ligne imaginaire (ligne anastomotique) en marquant les points anastomotiques avec l'aide d'outil de dessin en ligne segmentée et le plugin "Dotted Line".}
Définition de l'échelle en mm. Mesurez la distance entre la ligne anastomotique et la ligne médiane de 4 mm caudale du pôle frontal du cerveau en utilisant l'outil de dessin en ligne droite et «mesure» de l'outil. Faites de même à 6 mm caudalement du pôle frontal. Analyser les images 3-4 par animal et calculer la valeur moyenne. Comparer les valeurs entre les différents groupes d'animaux pour identifier la variation de l'anatomie vasculaire cérébral. En C57BL6 / J animaux, la ligne anastomotique entre l'ACA et le MCA peut être retracée plus proche de la ligne médiane de 4 mm à 6 mm de caudale du pôle frontal. Souris KO ApoE présentera pas de différence significative à cet égard. Au contraire, dans SV129 souris la ligne anastomotique se situera mm plus loin et parallèle à la ligne médiane à la fois à 4 mm et 6 caudale du pôle frontal.
Pour analyser l'anatomie vasculaire in des conditions ischémiques, effectuer les mêmes calculs mentionnés ci-dessus. Identifier la frontière infarctus que la marge de tissu de couleur rouge et blanc représentant métaboliquement active et le tissu nécrotique du tissu non coloré, respectivement. Mesurer la distance de la bordure de la ligne médiane du myocarde à 4 mm et 6 mm à partir du pôle caudal frontal du cerveau. Récupérer la valeur moyenne à partir d'images 3-4 par animal. Comparer les résultats entre les périodes d'ischémie reperfusion et différente.