ARN-seq Analyse des transcriptomes de thrombine traitée et de contrôle de l&#39;homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires

Dilyara Cheranova; Margaret Gibson; Suman Chaudhary; Li Qin Zhang; Daniel P. Heruth; Dmitry N. Grigoryev; Shui Qing Ye

doi:10.3791/4393

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ARN-seq Analyse des transcriptomes de thrombine traitée et de contrôle de l'homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires

DOI:

10.3791/4393

⸱

February 13th, 2013

Dilyara Cheranova¹, Margaret Gibson¹, Suman Chaudhary¹, Li Qin Zhang¹, Daniel P. Heruth¹, Dmitry N. Grigoryev¹, Shui Qing Ye¹

¹Children's Mercy Hospital and Clinics, School of Medicine, University of Missouri-Kansas City

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Résumé

Ce protocole présente une procédure complète et détaillée à appliquer ARN-seq, une puissante technologie de l'ADN de la prochaine génération de séquençage, de transcriptomes profil de l'homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires avec ou sans traitement thrombine. Ce protocole est généralisable à différentes cellules ou des tissus affectés par différents réactifs ou états pathologiques.

Résumé

La caractérisation de l'expression des gènes dans les cellules via la mesure des niveaux d'ARNm est un outil utile pour déterminer comment la machinerie transcriptionnelle de la cellule est affectée par des signaux externes (traitement médicamenteux, par exemple), ou comment les cellules diffèrent entre un état sain et un état pathologique. Avec l'avènement et le raffinement continu de la technologie de l'ADN de la prochaine génération de séquençage, séquençage de l'ARN (ARN-seq) est devenue une méthode de plus en plus populaire de l'analyse du transcriptome de cataloguer toutes les espèces de transcriptions, de déterminer la structure de la transcription de tous les gènes exprimés et à quantifier les niveaux d'expression de l'évolution de l'ensemble total de transcrits dans une cellule donnée ^1,2, tissu ou organisme. ARN-seq remplace progressivement les puces à ADN comme une méthode pratique pour l'analyse du transcriptome, car il a les avantages de profilage d'un transcriptome complet, offrant une donnée de type numérique (nombre de copies de la transcription) et ne comptez sur aucune séquentielle génomique connueCe ^3.

Ici, nous présentons un protocole complète et détaillée à appliquer ARN-seq pour transcriptomes profil de l'homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires avec ou sans traitement thrombine. Ce protocole est basé sur notre étude publiée récemment intitulé «RNA-seq révèle transcriptome Novel des gènes et de leurs isoformes de l'homme dans les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires traités par la thrombine," ^4, dans lequel nous avons réussi a effectué la première analyse complète du transcriptome de l'homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires traité avec de la thrombine en utilisant l'ARN-seq. Elle a abouti à des ressources sans précédent pour de nouvelles expérimentations afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la thrombine dysfonction endothéliale dans la pathogénie des maladies inflammatoires, le cancer, le diabète et les maladies coronariennes, et fournit de nouvelles pistes potentielles pour cibles thérapeutiques pour ces maladies.

Le texte descriptif de ce protocoleest divisé en quatre parties. La première partie décrit le traitement de l'homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires avec la thrombine et d'isolement d'ARN, analyse de la qualité et de quantification. La deuxième partie décrit la construction de bibliothèques et de séquençage. La troisième partie décrit l'analyse des données. La quatrième partie décrit un essai de validation par RT-PCR. Les résultats représentatifs de plusieurs étapes clés sont affichés. Conseils utiles ou les précautions à stimuler le succès dans les étapes clés sont fournis dans la section Discussion. Bien que ce protocole utilise de l'homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires traitées avec de la thrombine, elle peut être généralisée à transcriptomes de profil dans les deux cellules de mammifères et non mammifères et dans les tissus traités avec différents stimuli ou des inhibiteurs, ou pour comparer les transcriptomes dans des cellules ou des tissus entre un état de santé et un état de maladie.

Protocole

Un organigramme décrivant ce protocole est affiché à la figure 1.

1. Le traitement des cellules avec de la thrombine, RNA, évaluation de la qualité et la quantification de l'ARN

Culture cellules humaines endothéliales microvasculaires pulmonaires (HMVEC-LBL) à 90-100% de confluence dans des plaques 6 puits en milieu EGM-2 avec 5% de FBS, des facteurs de croissance et des antibiotiques (Lonza, chat # CC-3202).
Changer médias pour les médias famine (0% de FBS) 30 min avant le traitement avec de la thrombine.
Traiter les cellules avec 0,05 U / ml de thrombine ou de quitter traitée comme un contrôle pendant 6 heures à 37 ° C et 5% de CO _2.
Isoler l'ARN total des cellules traitées et témoins en utilisant le kit Ambion mir Vana selon les instructions du fabricant.
Évaluer la qualité de l'ARN avec une Experion eucaryote StdSense puce ARN selon le protocole standard sur la station Experion électrophorèse (Automated= "_blank"> Www.bio-rad.com).
Quantifier l'ARN en utilisant une méthode standard spectrophotométrique.

2. Construction Bibliothèque et de séquençage

Utilisez 1 ug d'ARN totaux de haute qualité par échantillon comme produit de départ.
Pour construire la bibliothèque, suivez la procédure standard d'Illumina (protocole # 15008136 Rev A). Dans ce protocole, deux séries de poly (A) ARNm contenant les sélections sont effectuées pour enlever ARNr de minimiser le séquençage ARNr.
Évaluer la qualité des bibliothèques à l'aide d'une puce ADN Experion 1K selon le protocole standard sur la station Experion électrophorèse automatique ( www.bio-rad.com ).
Quantifier la bibliothèque en utilisant qPCR: Utiliser une bibliothèque qui a déjà été séquencé par une courbe standard et des amorces spécifiques pour les adaptateurs ligaturés. Utiliser une gamme de dilutions des bibliothèques inconnus (c.-à 1:100, 1:500 et 1:1000). Exécutez l'acco qPCRrding au protocole Sybergreen MM et calculer la concentration de matière d'origine de chaque bibliothèque.
Diluer les stocks de bibliothèque à 10 nM et conserver à -20 ° C jusqu'au moment de pôle une cellule d'écoulement.
Lorsque vous êtes prêt à se regrouper une cellule d'écoulement, dégeler la plaque réactif CBOT dans un bain d'eau. CBOT est un instrument Illumina utilisée pour simplifier le processus de génération de cluster.
Laver l'instrument CBOT.
Dénaturer les bibliothèques: Mélanger 13 ul 1x TE et 6 ul de 10 uM bibliothèque et, sur le côté du tube, ajouter 1 ul de NaOH 1 N (fourni par Illumina). Vortex, centrifuger et incuber à température ambiante pendant 5 min et placer les bibliothèques dénaturées sur la glace.
Diluer les bibliothèques: Diluer les bibliothèques dénaturés avec un tampon d'hybridation pré-réfrigéré (HT1, fourni par Illumina) en combinant 996 ul HT1 et 4 pl dénaturé bibliothèque pour une concentration finale de 12 heures. Placez les bibliothèques dénaturées et dilué sur la glace.
Inverser chaque rangée de tubes de la plaque CBOT,faire en sorte que tous les réactifs sont décongelées. Centrifuger la plaque, enlever / percer les joints bandes et charger sur le CBOT.
Aliquote de 120 ul dilués et bibliothèques dénaturées à un tube de bande, étiqueté 1-8. Ajouter 1,2 ul diluée, bibliothèque dénaturé contrôle PhiX (à partir de Illumina) dans chaque tube comme un pic en contrôle. Vortex et centrifuger les tubes et les charger sur le CBOT dans le bon sens (tube n ° 1 à droite).
Chargez une cellule d'écoulement et le collecteur sur le CBOT.
Terminer le flux de vérifier et de commencer la course de clustering.
Après la course est terminée, vérifiez distribution de réactifs à travers toutes les voies. Prenez note de toutes les anomalies. Soit commencer l'exécution de séquençage immédiatement ou stocker la cellule d'écoulement dans le tube muni à 4 ° C.
Décongeler le séquençage par synthèse (SBS, Illumina) réactifs.
Chargez les réactifs aux endroits appropriés sur les plateaux de réactifs, en veillant à ne pas toucher les autres réactifs après avoir touché le mélange clivage.
L'utilisation d'un pascellule d'écoulement n-séquençage (celle qui a été séquencé précédemment), prime les lignes de réactifs à deux reprises.
Bien nettoyer la cellule d'écoulement séquençage avec EtOH à 70% et Kimwipes, suivie d'EtOH à 70% et du papier pour objectif. Inspectez la cellule d'écoulement pour d'éventuelles traces. Re-nettoyez-le si nécessaire.
Charger la cellule d'écoulement sur le séquenceur et effectuer un écoulement de vérifier que l'étanchéité entre le collecteur et la cuve à circulation est serré.
Lancer le cycle de séquençage.
Évaluer les mesures de qualité (par exemple, la densité du cluster, les grappes passent filtre, Q30, intensité) dès qu'ils sont disponibles pendant la course.
Contrôler l'intensité tout au long de la course.
Après 101 cycles sont terminés, effectuez la chimie de redressement pour terminer la deuxième lecture: Décongeler les réactifs finaux jumelés et le tampon seconde lecture Incorporation (ICB, une composante de l'réactifs SBS, Illumina) et charger les réactifs.
Continuer le long de séquençage, l'évaluation de 2 ^ème lecture d'intensité, un Q30nd mesures de qualité d'autres que l'on avance l'exécution.

3. Analyse des données

Utilisez la dernière version de CASAVA (Illumina, actuellement 1.8.2) pour convertir les fichiers d'appel de base (. Bcl) des fichiers à fichiers. Fastq, la mise en fastq-cluster-comptage à 0 pour assurer la création d'un fichier unique fastq pour chaque échantillon . Décompressez les fichiers fastq pour l'analyse en aval.
Effectuez un alignement fin jumelé avec les dernières versions de TopHat (1.4.1) ^5, qui aligne ARN-seq lit de mammifères de taille des génomes en utilisant l'ultra haut débit aligneur à court de lecture (Bowtie, 0.12.7) ⁶ et samtools (0,1. 17) ^7. Samtools met en œuvre divers utilitaires pour le post-traitement des alignements au format SAM. Le transcriptome humain de référence peuvent être téléchargés à partir iGenomes ( www.illumina.com ). En cours d'exécution TopHat, nous avons utilisé tous les paramètres par défaut, y compris l'option de type bibliothèque fr-unstranded (par défaut).
Noustion de la CuffDiff programme, une partie des boutons de manchette (1.3.0) ⁸ progiciel, comparez les cellules traitées par la thrombine dans les cellules contrôles pour éliminer les transcrits des gènes différentiellement exprimés dans l'ancienne base de référence sur le transcriptome humain. Cette comparaison détecte l'expression différentielle des transcrits connus. Utilisez Microsoft Excel pour visualiser le résultat sous forme de tableau. En exécutant le programme Boutons de manchette, nous avons utilisé tous les paramètres par défaut. Ces transcrits du gène avec FPKM <0,05 et p> 0,05 sont filtrés.
Pour détecter les nouvelles isoformes, exécutez Boutons de manchette sans transcriptome de référence. Comparer les fichiers de transcription échantillon de référence à l'aide du génome Cuffcompare et tester l'expression différentielle avec Cuffdiff combinées en utilisant les fichiers de transcription thrombine comme le génome de référence pour une analyse et les fichiers combinés de contrôle de transcription que le génome de référence pour une analyse secondes. Utilisez Microsoft Excel pour visualiser le résultat sous forme de tableau. Encore une fois, thostranscrits du gène électroniques avec FPKM <0,05 et p> 0,05 sont filtrés. Après cette étape, les enquêteurs peuvent choisir de télécharger une liste des transcriptions nouvellement signalés sur le site UCSC Genome Browser ( http://genome.ucsc.edu/ ) pour vérifier leur validité par une inspection manuelle.
Présenter des listes de gènes différentiellement exprimés à Ingenuity Pathway Analysis (IPA, www.ingenuity.com ) pour la caractérisation des gènes et les voies affectées par le traitement thrombine. Dans cette étape, les enquêteurs peuvent choisir d'utiliser ceinture ( http://compbio.mit.edu/cummeRbund/ ), un package R qui est conçu pour faciliter et simplifier la tâche d'analyser Boutons de manchette ARN-seq sortie, pour aider à gérer, visualiser et d'intégrer toutes les données produites par une analyse Cuffdiff.

4. Validation des résultats par RNA-Seq quantitative en temps réel-PoChain Reaction lymerase (qRT-PCR)

Effectuer totale isolement d'ARN à partir de la thrombine et de contrôle traités par HMVEC-LBL cellules, l'ARN et d'évaluation de la qualité de quantification d'ARN décrit dans les stades 1,4 à 1,6.
Générer ADN complémentaire de 1 ug d'ARN totaux de chaque échantillon avec SuperScript III du premier volet Kits de synthèse RT système, suivant les instructions du fabricant (Invitrogen, 18080-051).
Effectuer qRT-PCR sur une analyse Applied Biosystems VIIa 7 Real-Time System PCR en utilisant Taqman-on-Demand oligonucléotides conçus pour la détection des CUGBP, Elav-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor -associated factor 1 (TRAF1, Hs01090170_m1) et β-actine (ACTB, Hs99999903_m1). Chaque échantillon a eu un modèle équivalent à 5 ng d'ARN total. Mesurer la quantification en utilisant la méthode DDCT et normaliser la β-actine. Chaque essai a été effectué sur au moins trois biologique répétitions.