Cytométrie de masse: Protocole pour Tuning quotidien et échantillons cellulaires course sur un cytomètre de masse CyTOF

Résumé

Les mesures nécessaires pour la syntonisation par jour et d'optimisation de la performance d'un cytomètre de masse CyTOF sont décrits. Commentaires sur la préparation optimale de l'échantillon et le débit sont discutés

Résumé

Ces dernières années, l'analyse rapide de cellules individuelles a souvent été réalisée en utilisant la cytométrie en flux et des anticorps à marquage fluorescent. Toutefois, la question du chevauchement spectral d'émission des fluorophores a limité le nombre de sondes simultanées. En revanche, le cytomètre de masse nouvelle CyTOF par des couples Sciences DVS un système d'introduction de liquide à cellule unique à un ICP-MS. ¹ Plutôt que de fluorophores, les polymères chélateurs métalliques contenant des isotopes hautement enrichi sont couplés à des anticorps ou d'autres sondes spécifiques ^2-5. En raison de la pureté du métal et de la résolution en masse du cytomètre de masse, il n'existe pas de "chevauchement spectral" des isotopes voisins, et donc pas de nécessité pour les matrices de compensation. De plus, en raison de l'utilisation de métaux lanthanides, il n'y a pas d'arrière-plan biologique et donc pas d'équivalent de l'autofluorescence. Avec une fenêtre de masse couvrant masse atomique 103-203, théoriquement jusqu'à 100 étiquettes peuvent être distingués en même temps. Actuellement, Plus de 35 chaînes sont disponibles en utilisant les réactifs chélateur disponible à partir Sciences DVS, ce qui permet une dissection sans précédent du profil immunologique des échantillons. ^6-7

Inconvénients de la cytométrie de masse comprennent l'exigence stricte d'un isotope métallique séparé par la sonde (pas d'équivalent de la diffusion vers l'avant ou sur le côté), et le fait qu'il s'agit d'une technique destructrice (pas de possibilité de tri de récupération). La configuration actuelle du cytomètre de masse a également un taux de transmission de cellules de seulement ~ 25%, ce qui nécessite un nombre élevé de cellules d'entrée.

Optimal performance quotidienne de l'cytomètre de masse nécessite plusieurs étapes. L'objectif de base de l'optimisation est de maximiser l'intensité du signal mesuré des isotopes métalliques désirés (M), tout en minimisant la formation d'oxydes (+16 M) qui va diminuer l'intensité du signal M et interférer avec un signal désiré à M +16. La première étape consiste à chauffer la machine pour un climat chaud et stable, jeCP plasma a été mis en place. Deuxièmement, les paramètres de débit de gaz actuelle et le maquillage doit être optimisée sur une base quotidienne. Lors de la collecte de l'échantillon, le taux cellulaire maximale événement est limitée par l'efficacité du détecteur et de la vitesse de traitement de 1000 cellules / seconde. Toutefois, en fonction de la qualité de l'échantillon, un taux plus lent cellule événement (300-500 cellules / seconde) est généralement souhaitable de permettre une meilleure résolution entre les événements cellules et donc de maximiser maillots intactes au cours des doublets et des débris. Enfin, un nettoyage adéquat de la machine à la fin de la journée contribue à réduire le signal de fond en raison de métal libre.

Protocole

Tous les échantillons cellulaires pour la CyTOF doivent être fixées et perméabilisées. Cela permet une plus grande entrée de la intercalant d'ADN contenant de l'iridium, et empêche également la lyse des cellules pendant le lavage de l'eau MilliQ et des mesures de remise en suspension immédiatement avant l'injection dans le cytomètre de masse.

1. Démarrage de la cytomètre de masse

1. Ouvrez le logiciel CyTOF. Sélectionnez Configuration de l'instrument. Dans l'onglet Cage carte, allez dans le coin en bas à droite et cliquez sur Chauffe bouton «ON». Allumer le chauffage au moins 15 minutes avant l'heure souhaitée pour laisser suffisamment de temps pour le manteau chambre de pulvérisation pour atteindre 200 ° C.
2. Remplacez le blanc Norm-Ject seringue de 3 ml dans la seringue avec une seringue remplie d'eau fraîche MilliQ.
3. Nettoyage du nébuliseur. Rincer l'nébuliseur en utilisant la seringue et le tube de retirer 5% Citranox 2-3 fois à la fois par le port plus petit d'introduction de liquide et le port de gaz plus important introduction. Répétez rinçage avec de l'eau MilliQ to retirer Citranox résiduelle.
4. Vérifiez pour confirmer que les voyants sur le panneau avant de l'CyTOF sont allumés comme dans la figure 1.

Figure 1. CyTOF voyants du panneau avant démarrage.

5. Ouvrez le robinet de réservoir de gaz argon. Cela devrait provoquer la "ARGON" lumière sur le devant pour l'allumer.
6. Fixez le nébuliseur au maquillage entrée de gaz. Dévissez le make-up raccord de tuyau de gaz et retirez le noir joint torique en caoutchouc et le blanc pièce conique en plastique. Noter la plus large "articulation" sur la tige de mise en place d'orifice de gaz du nébuliseur. Placer le connecteur sur l'orifice d'introduction de gaz. Placer le joint torique noir sur l'extrémité de l'orifice de gaz, et forcer le joint torique passé la plus grande partie de la tige de port. Placer le blanc pièce conique en plastique sur le dessus avec l'extrémité étroite souligné, et le visser sur le tube gaz d'appoint.
7. Fixer le nébuliseur à la tubulure d'introduction de liquide. Soigneusement insérer le tube dans la petite ouverture à l'extrémité du nébuliseur. Il y aura deux arrêts, semblables à se sentir à l'arrêt sur une micropipette. Tout d'abord, appuyez sur jusqu'à ce que vous rencontrer de la résistance de la lumière; la fin du petit tube doit être à la fin de la section droite de verre. Deuxièmement, appuyer plus fort pour forcer la fin de la section droite de verre plus loin dans le raccord et serrez la vis de fixation à sceller. Insérer l'extrémité du nébuliseur dans l'ouverture de blanc dans le chauffe-ballon.
8. Dans l'onglet Contrôleur RFG de la fenêtre de configuration de l'instrument, appuyez sur "Start plasma". Depuis le nébuliseur est déjà inséré, appuyez sur "OK". Le logiciel se mettra en marche le refroidisseur, démarrer le flux de gaz et allumer un plasma. Le détecteur de tension augmentera progressivement. Il y aura une fenêtre pop-up disant "Plasma séquence de démarrage est terminée avec succès" lorsque vous avez terminé, appuyez sur "OK". Nouvel éclairage devrait être sur le panneau avant (Figure 2 >).

Figure 2. Voyants du panneau de CyTOF après plasma enflammé et le démarrage réussi.

9. Mise en marche de la pompe seringue. Dans le coin supérieur droit, appuyez sur le vert bouton "play" pour démarrer la pompe seringue et commencer à verser le liquide à travers le tube et la pulvérisation hors du nébuliseur. Les réglages par défaut sont seringues de 3 ml d'eau. Pour que l'échantillon soit circulant dans la boucle d'échantillonnage, le pousse-seringue doit être changé périodiquement quand il est à court d'eau. Dans la partie supérieure de l'écran, il ya un compteur indiquant la quantité de liquide a coulé sur la pompe à seringue. La pompe à seringue s'arrête lorsque ce compteur atteint "3,000" ou le plongeur atteint la fin de la seringue. Lors du remplissage de la seringue, vous devez cliquez sur "stop" plutôt que le bleu bouton "pause" pour réinitialiser le compteur.

e "> 2. étalonnage quotidien du cytomètre de masse

1. Le cytomètre de masse aura besoin d'environ 20 minutes pour obtenir un chaud, un plasma stable avant l'étalonnage. Le but de l'incrément de fréquence est de maximiser le signal désiré de Tm169 ou Tb159 tout en gardant "Gd155" (oxyde; La139 + O16) signaux de moins de 3% de la valeur supérieure. Cliquez sur le bouton Acquisition Paramètres pour ouvrir la fenêtre des paramètres d'acquisition de données. Dans l'onglet analytes, cliquez sur le tableau périodique pour ouvrir le panneau de sélection des isotopes. Sélectionnez les isotopes présents dans la solution DVS Sciences réglage indiqué dans le manuel, puis cliquez sur "Enregistrer".
2. Cliquez sur les isotopes Par Reading bouton pour ouvrir la Masse (s) Par la fenêtre de lecture. Sélectionnez "impulsions de comptage", et redimensionnez l'axe des y en entrant un nouveau numéro et en appuyant sur "Entrée".
3. Remplissez un vert 1 ml Norm-Ject seringue avec une solution de réglage. Tournez le sélecteur de port à échantillon "LOAD", injecter 450 ul de la solution mise au point, puis tourner le sélecteur sur "INJECT". Dans l'onglet Étalonnage selon la masse de l'Acquisit données ion fenêtre Paramètres, appuyez sur "Exécuter" pour contrôler les masses qui affluent par. Le côté gauche de la fenêtre est plus faible masse, tandis que le côté droit est plus élevée masse. Remarque: il y aura déjà des signaux dans la région TOF 9400-9800, en raison des isotopes de xénon dans le gaz d'argon (figure 3). Attendez jusqu'à ce que la solution de réglage isotopes commencent à apparaître sous forme de traînées de cet écran (figure 4).

Figure 3. Fenêtre de l'onglet masse d'étalonnage, indiquant les niveaux de fond pour les différents isotopes après la solution de lavage et de rinçage à l'eau. La région autour de TOF 9400-9800 correspond aux isotopes de xénon dans le gaz argon, et doit toujours être présent. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Figure 4. Fenêtre de l'onglet masse d'étalonnage, montrant des stries verticales pour divers isotopes en solution réglage DVS. Cliquez ici pour agrandir la figure .

4. Retour à la page Masse (s) Par la fenêtre de lecture et appuyez sur le vert bouton "Play" dans le coin supérieur gauche. Chaque isotope sélectionné à l'étape 2,1 est représentée par une ligne de couleur différente. La valeur par défaut est l'axe des x "Time", en sec. Surveiller les niveaux des différents isotopes jusqu'à ce qu'ils soient stables.
5. Réglage du courant. Dans l'onglet Paramètres de la fenêtre des paramètres d'acquisition de données, sélectionnez "courant" dans le menu déroulant. Commençons = 0, finition = 10 valeur de l'étape = 0,5, temps de stabilisation = 200, et appuyez sur "Enregistrer". Cliquez de nouveau sur l'Masse (s) Par la fenêtre de lecture et appuyez sur Lecture. L'axe des abscisses est maintenant "en cours". Noter le cas des signaux du pic isotopes (figure 5), et r ECORD. Sous l'onglet Configuration du CAD canaux de la fenêtre de configuration de l'instrument, faites défiler vers le bas pour "Current" et entrez la nouvelle valeur. Appuyer sur "Set la valeur actuelle réelle", puis "enregistrer".

Figure 5. Profil de réglage actuel.

6. Réglage du gaz d'appoint. Changer le menu déroulant de «gaz d'appoint." Commençons = 0,55, fin = 0,95 valeur de l'étape = 0,05, temps de stabilisation = 200. Appuyez sauver. Retour à la messe (s) par la fenêtre de lecture et appuyez sur Lecture. L'axe des abscisses est maintenant «gaz d'appoint" débit. Enregistrer lorsque les signaux de la crête isotopes. Observez l'augmentation rapide de la "Gd155" signal vers la fin (figure 6). Revenez à l'onglet Configuration du CAD canaux, faites défiler jusqu'à «gaz d'appoint", et entrez la nouvelle valeur. Appuyer sur "Set la valeur actuelle réelle", puis "enregistrer".

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Figure 6. Make-up profil de réglage du gaz.

7. Taux d'enregistrement désiré isotope vs oxyde. Faire une deuxième injection de 450 pi de solution de tuning. Dans l'onglet Paramètres, sélectionnez "Time" dans le menu déroulant, commençons = 0, fin = 10, valeur du pas = 1, le temps de stabilisation = 200. Appuyez sur "Enregistrer". Cliquez sur "play" en Masse (s) Par la fenêtre de lecture. Après les lignes se sont stabilisés (Figure 7), utilisez le curseur pour lire la valeur dans les cases en haut à gauche pour Tm169 ou Tb159 (valeur supérieure) et aussi le "Gd155" valeur (<3% de la valeur supérieure). Ces valeurs peuvent également être enregistrés dans un fichier de réglage pour référence future.

Figure 7. Mesure des intensités de réglage de solutions de signal après l'optimisation de gaz actuelle et maquillage.

8. Nettoyage de samboucle exemple. Injecter 3 ml d'eau MilliQ à travers la boucle d'échantillon, puis 500 ul de solution de lavage DVS. Surveiller la progression du nettoyage en appuyant sur "Exécuter" dans l'onglet Etalonnage de masse. Lavez jusqu'à ce que l'intensité des raies (figure 4) commence à diminuer, puis suivez par 3 ml d'eau MilliQ et le moniteur jusqu'à ce que le bas des niveaux de fond (figure 3).

3. Des échantillons en cours d'exécution

1. Ouvrez la fenêtre d'acquisition. Les paramètres par défaut: Do Analysis = On-The-Fly, Signal Analyser = double, d'étalonnage comptage double = données. Réduction du bruit est activée. N'importe lequel de ces peuvent être modifiées si nécessaire. Entrez le nom du fichier. Tous les fichiers doivent être enregistrés à l'E :/ / lecteur.
2. Réglage des retards d'acquisition. Il y aura un léger retard dans l'enregistrement des événements cellulaires d'environ 30 secondes en raison de la longueur du tuyau entre la boucle d'échantillonnage et le nébuliseur. Par conséquent, la somme de «retard d'acquisition" et "st détecteurretard capacité »doit être d'au moins 30 secondes. retard stabilité détecteur doit être d'au moins 20 sec.
3. Réglage de l'heure de collecte de données. "Le temps d'acquisition" représente le nombre de secondes que vous voulez exécuter votre échantillon. Remplissage de la boucle d'échantillon entier 450 ul exigerait 600 sec pour terminer. Il est suggéré que 50-100 sec est ajouté à la fin de la durée de fonctionnement afin de minimiser l'échantillon report.
4. La remise en suspension de l'échantillon. Pour réduire au minimum l'accumulation de sels dans la machine, il est suggéré qu'au moins deux lavages dans de l'eau MilliQ être fait à la fin de la coloration des cellules, suivie d'une remise en suspension dans de l'eau MilliQ finale. Le volume d'eau MilliQ utilisé pour remettre en suspension le culot cellulaire varie en fonction du nombre de cellules que vous avez commencé avec la cellule et la récupération après la procédure de coloration entier. Un bon point de départ est 10 ⁶ (départ) les cellules / ml. Après remise en suspension, filtrer à travers un tamis cellulaire pour éliminer les agrégats.
5. Échantillon de départ courir. Entrez un nouveau nom de fichier pour l'échantillon courant. Placez la vanne de boucle d'échantillon sur «LOAD», injecter l'échantillon, revenir à "injecter", puis cliquez sur "Exécuter" dans la fenêtre d'acquisition.
6. Enregistrement des événements cellulaires. Les cellules seront représentés dans la fenêtre aperçu que des collections de marques horizontales dans chaque isotope vertical / marqueur de voie (Figure 8). Alors que le cytomètre de masse peut enregistrer 1000 cellules / sec, une meilleure résolution entre les événements cellulaires est généralement obtenue à 300-500 cellules / sec. Cela correspond à une moyenne de ~ 1 cellule / rafraîchissement de l'écran. Il peut prendre jusqu'à 30 secondes avant que le compteur d'événements cellule commence à monter. Cela est dû à «on-the-fly" traitement des données; aucune informations sur les événements cellule est perdue.

La figure 8. Fenêtre d'acquisition au cours de l'échantillon en cours d'exécution, montrant les lignes horizontales de points correspondant aux éléments associés à trois événements séparés de cellules.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir la figure.

7. Qualité d'événements cellulaires. Avis n'importe quel fond de stries dans chaque canal isotopes, ainsi que le taux d'événements cellule. Le cytomètre de masse reconnaît un «événement cellulaire» comme une certaine augmentation de signal au-dessus de fond, donc le signal de fond en métal libre ou non liée anticorps peut modifier l '«événement cellule" count. En outre, la course cellules à une concentration trop élevée peut causer une augmentation du nombre d'événements doublet. Le fond peut être diminuée par des lavages supplémentaires ou de dilution plus grande cellule. Doublets peuvent être minimisés par une dilution plus grande cellule, au prix de temps d'exécution accrue.
8. Finition échantillon acquisition de données. Lorsque le temps d'acquisition a été atteint, la collecte des données se terminera. Il y aura un peu de retard devant une fenêtre pop-up avec un bouton "OK" apparaît de nouveau, cela est dû à «à la volée» de traitement des données. L'acquisition de l'échantillon peut également être arrêté Prematurely en cliquant sur le bouton "Stop". Dans ce cas, tous les événements cellulaires déjà inscrits seront comptés et transformés en fichiers de sortie.
9. Injection d'au moins 500 pi d'eau MilliQ entre chaque échantillon permet également de minimiser contamination de l'échantillon.

4. Nettoyage de la machine après utilisation

1. La solution de lavage. Après que l'échantillon final est réalisé et la boucle d'échantillon rincé à l'eau, injecter 450 pi de solution de lavage dans la boucle d'échantillonnage. Surveiller la libération de métal libre dans l'onglet Etalonnage de masse de la fenêtre d'acquisition de données des paramètres comme à l'étape 2.8 (figure 9). Lorsque le signal sans métal commence à diminuer, rincer avec 3 ml d'eau MilliQ et surveiller jusqu'à ce que les niveaux de fond sont atteints.

Figure 9. Fenêtre de l'onglet Masse de calibrage, au cours de l'après-cycle de nettoyage avec la solution de lavage DVS. Les stries verticales dans la région TOF sont 9800-11000 anticorps-isotopes étiquette en cours de nettoyage de la machine. Les stries verticales autour TOF 11500 correspondent aux deux isotopes intercalant Ir. Cliquez ici pour agrandir la figure .

5. Arrêter la machine

1. Dans l'onglet Contrôleur RFG de la fenêtre de configuration de l'instrument, sélectionnez "Stop plasma". Lorsque la procédure est terminée, il y aura une fenêtre pop-up vous demandant de retirer le nébuliseur. Appuyez sur "OK". Dans l'onglet Cage carte, éteignez l'appareil. Fermez le robinet de l'alimentation d'argon.
2. Retrait du nébuliseur. Retirer le nébuliseur de la chambre de pulvérisation en tirant doucement vers l'arrière. Dévissez le tuyau d'introduction d'échantillon de 1,6 Step et mettre de côté. Dévissez le make-up de connexion d'introduction de gaz pour desserrer légèrement, puis tirez le nébuliseur hors tension. Laissant le raccord vissé permettra de réduire les chances de lOsing le noir joint torique en caoutchouc et blanc pièce conique en matière plastique.
3. Nettoyage du nébuliseur. Backflush les deux ports du nébuliseur avec Citranox 5% en utilisant la seringue et des tubes comme à l'étape 1.3. Couvrir et conserver au Citranox 5% jusqu'à la prochaine utilisation.

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Résultats

En suivant le protocole ci-dessus doivent accomplir quatre choses. Tout d'abord, permettant échauffement adéquat du temps pour le cytomètre de masse produira une chaude, plasma stable nécessaire pour un signal optimal et la formation de l'oxyde minime. Deuxièmement, lavage adéquat du cytomètre de masse avec de l'eau MilliQ et la solution de lavage DVS (figure 9) aidera à réduire les niveaux de métal d'adsorption à la tubulure et d'autres parties de la machine, en aidant à...

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Discussion

Pour les dernières décennies, la cytométrie en flux par fluorescence a été une méthode bourreau de travail pour l'analyse de cellules uniques, à la fois en termes d'expression de surface et dans des tests fonctionnels. Cependant, les problèmes de chevauchement spectrales des colorants fluorescents a limité le nombre de marqueurs simultanées. Bien que les expériences qui utilisent plus de 12 marqueurs simultanées ont été signalés, le montant de la compensation nécessaire en fait techniquement diff...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
CyTOF TM masse cytomètre	Sciences DVS
Solution de lavage	Sciences DVS	201071	0,05% d'acide fluorhydrique dans de l'eau
Tuning solution	Sciences DVS	201072	0,5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, trace d'acide nitrique
Des billes de polystyrène contenant de l'UE	Sciences DVS	201073	Contient naturelle de l'abondance des isotopes de l'UE; perles fournis à environ 1 million / ml
Multi-lanthanide contenant (La / Pr / Tb / Tm / Lu) - billes de polystyrène	Sciences DVS	Pas encore disponible dans le commerce	Contient naturelle de l'abondance des isotopes de lanthanides cotées
L'acide nitrique (concentré)	Fisher Scientific	A467-500	Optima oligo-métal pur ICP-MS de qualité
Polystyrène à fond rond tube avec crépine cellule-cap-5mL	BD	352235	utilisé pour filtrer des échantillons de cellules avant l'injection
Norm-Ject tuberkulin seringue de 1 ml	Henke Sass Loup	4010-200V0	sans silicone, sans latex
Norm-Ject seringue 3 ml	Henke Sass Loup	4010.000V0	sans silicone, sans latex
De l'eau MilliQ			Eau de 18 MQ pur; ne doivent pas être stockés dans bouteilles en verre ou en plastique qui ont été lavés avec un détergent commercial (en raison de leurs niveaux élevés de présence de baryum).
Citranox	Sigma-Aldrich	Z273236	détergent acide
Gaz argon	Praxair	AR 5.0UH-T	99,999% ultra haute pureté