In Vivo Imaging Systems (IVIS) Détection d&#39;un neuro-invasive virus encéphalitique

Allison Poussard; Michael Patterson; Katherine Taylor; Alexey Seregin; Jeanon Smith; Jennifer Smith; Milagros Salazar; Slobodan Paessler

doi:10.3791/4429

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In Vivo Imaging Systems (IVIS) Détection d'un neuro-invasive virus encéphalitique

DOI:

10.3791/4429

⸱

December 2nd, 2012

Allison Poussard*¹, Michael Patterson*¹, Katherine Taylor¹, Alexey Seregin¹, Jeanon Smith¹, Jennifer Smith¹, Milagros Salazar¹, Slobodan Paessler¹

¹Experimental Pathology, University of Texas Medical Branch

* Ces auteurs ont contribué à parts égales

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Résumé

En utilisant la luciférase et in vivo des systèmes d'imagerie (IVIS) comme un nouveau moyen d'identifier les maladies extrêmes avant de développements cliniques se produire. IVIS nous a permis de visualiser en temps réel l'invasion des virus encéphalitique sur plusieurs jours, en fournissant un modèle de maladie plus précise pour des études futures. Il nous a également permis d'identifier les caractéristiques protecteurs potentiels des antiviraux et des vaccins plus rapidement que les modèles animaux actuellement utilisés. La capacité d'utiliser des animaux individuels sur plusieurs points temporels assure aux besoins des animaux réduits, des coûts et de la morbidité globale pour les animaux utilisés assurer un moyen plus humain et plus scientifique de l'étude des maladies.

Résumé

Avancées modernes dans la technologie d'imagerie encourager le développement et l'affinement de la façon dont la recherche virale est accompli. Initialement proposé par Russel et Burch en 3R Hume (remplacement, réduction, raffinement), l'utilisation de modèles animaux dans la recherche scientifique est sous pression constante afin d'identifier de nouvelles méthodes pour réduire l'utilisation des animaux, tout en améliorant la précision scientifique et de rapidité. Un défi majeur pour les directeurs de Hume cependant, est de savoir comment s'assurer que les études sont exacts, tout en réduisant la morbidité des maladies animales et chiffres globaux. Études sur l'efficacité des vaccins actuellement besoin d'un grand nombre d'animaux afin d'être considéré comme statistiquement significatif et entraînent souvent des taux élevés de morbidité et de mortalité critères d'évaluation pour l'identification de la protection immunitaire. Nous avons utilisé l'imagerie in vivo des systèmes (IVIS) en conjonction avec une enzyme bioluminescente luciole progressivement suivre l'invasion du système nerveux central (SNC) par un riencephalitic virus dans un modèle murin. En général, la maladie progresse relativement lentement, mais la réplication du virus est rapide, en particulier dans le système nerveux central, et peut conduire à une souvent une issue fatale. Suite à l'infection intranasale des souris avec TC83-Luc, une souche atténuée du Venezuela virus de l'encéphalite équine modifié pour exprime un gène de la luciférase, nous sommes en mesure de visualiser la réplication du virus dans le cerveau au moins trois jours avant l'apparition des symptômes cliniques de la maladie. Utilisant invasion du SNC comme un critère clé de la maladie encéphalitique développement, nous sommes en mesure d'identifier rapidement thérapeutique et la protection vaccinale contre TC83-Luc infection avant les symptômes cliniques. Grâce à la technologie IVIS nous sommes en mesure de démontrer le dépistage rapide et précis de la thérapeutique de médicaments et de vaccins, tout en réduisant le nombre d'animaux et la morbidité.

Protocole

1. Préparation des animaux

L'arrivée des animaux: A votre arrivée à l'échelle de l'animal biosécurité 2 (ABSL2) les installations, permettre aux animaux un minimum de 2 jours pour s'acclimater à leur nouvel environnement. Après cette période de repos, inspecter les animaux pour évaluer leur état de santé et l'apparence physique.
1. Lors de l'utilisation rapporteurs fluorescents, il est important de placer tous les sujets animaux sur un régime alimentaire de la luzerne libres de limiter la quantité d'autofluorescence et GI signal de fond.
Rasage animaux: Pour améliorer le signal bioluminescent détecté à partir de la région crânienne lors de l'imagerie, raser les têtes de tous les animaux. Anesthésier les animaux avec un mélange de gaz oxygène vaporisé et l'isoflurane. Une fois que les animaux sont pleinement anesthésiés, utilisez une tondeuse électrique se raser la tête. Une fois terminé avec le rasage, renvoyer les animaux dans leurs cages et d'observer une récupération complète des effets de l'anesthésie.
Bio Medic donnéesL'insertion des systèmes de transpondeur (BMDS) (qui aura lieu après le rasage de la souris alors que les animaux sont pleinement anesthésiés): Pour un moyen moins invasives pour suivre la température d'un implant préprogrammé BMDS sans fil transpondeur voie sous-cutanée dans la région dorsale de chaque souris. Ces transpondeurs permettent d'identifier sans fil et enregistrement de la température. Après l'implantation du transpondeur, appliquer un adhésif tissulaire vétérinaire de qualité de la plaie.
Collection de référence: Avant l'infection, enregistrer une température de référence et le poids de tous les animaux. Prélever du sang pour la réduction de neutralisation sur plaque d'essai (PRNT) l'analyse par rétro-orbitaires (RO) de fond perdu, tandis que les souris sont sous anesthésie. Après prélèvement de sang, vétérinaire pommade oculaire antibiotique pour réduire le potentiel infection bactérienne secondaire. Cette collection de référence devrait être complétée en tenant compte du nombre de fois où les animaux sont placés sous anesthésie à cause du stress sur les souris. Futures collections RO should être complété après l'imagerie, tandis que la souris est toujours sous anesthésie. Le sang prélevé sur un maximum de RO devrait être d'environ 200 pi.
Infection: souris sous anesthésie comme décrit précédemment. Inoculer par voie intranasale à l'aide d'une dose de 5x10 ⁶ à 5x10 ⁷ pfu TC83-luciférase dans un volume total de 40 ul diluée par Phosphate Buffered Saline (PBS) à travers une infection intranasale. Après l'infection, placez la souris au sein de leur cage de logement et d'observer la récupération.

2. Imagerie des animaux

Avertissement: Gardez souris au sein de leur unité de logement, l'enceinte de sécurité biologique (ESB), ou la boîte de confinement XIC à tout moment. Les enceintes de sécurité biologique approuvés pour ce protocole sont de type B1 ou B2 de classe II.

Injecter tous les animaux avec 10 pl par gramme de poids corporel de intrapéritonéale (IP) de la luciférine à une concentration de 15 mg / ml.
1. Les souris ayant reçu Ampligen doivent être injecteIP d à une dose de 12,5 mg de poids corporel / kg lors de l'infection heures après -4 ou 48 h après l'infection en fonction de leur groupe.
Avant l'injection avec la luciférine, séparer les souris en groupes de trois pour assurer un ajustement approprié dans la boîte de confinement XIC-3.
1. Pour toutes les images, utiliser une pommade oculaire / lubrifiant pour empêcher le séchage de la cornée dans toute la procédure.
Ouvrez le logiciel LivingImage et appuyez sur Initialiser pour préparer la boîte d'imagerie; économie d'auto ensemble, le temps d'exposition sur auto (temps d'exposition sur auto est une nouvelle fonctionnalité du logiciel LivingImage 3.2 et plus récent), voir le terrain à C, et le filtre à ouvrir; champ de vue est fondée sur le nombre de souris vous êtes imagerie; filtre et peut être optimisé en fonction des besoins pour des projets d'imagerie.
Assurez-vous que les filtres à charbon air n'ont pas expiré, le réservoir d'oxygène est pleine, l'isoflurane et le réservoir est rempli. Placez de petites bandes de ruban électrique dans le XIC-3 iboîte de consolation qui aide à réduire le déplacement des animaux lors de l'imagerie.
Injecter les souris avec la luciférine IP, comme décrit dans la section 2.1 et sa place dans la chambre d'induction isoflurane (avec couvercle ouvert) pendant 3-5 min.
Après 5 minutes, fermez le couvercle de la chambre d'induction et démarrer le flux de l'isoflurane. L'anesthésique est actionné à environ 3-5% de l'ensemble de débits d'écoulement d'oxygène à environ 2,0 L / min. Une fois complètement inconscient attendre un autre 30 secondes et transférer les souris à la boîte d'isolation XIC-3. S'assurer que le poste de sécurité microbiologique étant utilisée permet le coffre-fort balayage de l'isoflurane que cette procédure implique la perte de l'isoflurane à partir de la chambre d'induction (l'unité IVIS contient ses propres passifs bidons équitable et la boîte de confinement XIC-3 se connecte directement à l'entrée / sortie prises pour assurer contenues flux anesthésique).
1. Transférez les souris basés sur puce / numéro de groupe dans la boîte d'isolation XIC-3 avec le connecteur isoflurane ci-joint und ouvrir. Placez la souris de sorte qu'ils sont énoncés en décubitus sternal avec des têtes délicatement posées sur les rubans adhésifs.
Essuyez la zone de confinement XIC avec les mains éthanol de pulvérisation, et le fond du XIC-3 avec CaviCide, et transférer à la chambre d'imagerie IVIS. Rebranchez l'anesthésie de la zone de confinement fois à l'intérieur de l'unité d'imagerie.
Après 10 minutes après l'injection de luciférine, l'image des souris via le logiciel vivante image.
Suite à l'imagerie initiale avec un filtre ouvert, lancez une DLit 3-Dimensional imagerie utilisant l'analyse de la séquence et la configuration Assistant Image de bioluminescence luciférase de luciole. Ce processus d'imagerie prendra 4-5 min et devrait être achevée dans un champ de vue pertinent pour le nombre de souris souhaités.
1. Ex-vivo analyse est possible autopsie suivante et la collecte du cerveau. Placez le cerveau sur une boîte de Pétri stérile, goutte à goutte 50-100 ul de stock luciférine sur le dessus, et sa place dans l'imaGing boîte.
Finaliser une seconde image ouverte filtre à 15-17 min après l'infection à la fin de l'imagerie DLit. Assurer une analyse de séquence est éteint et le champ de vision et les paramètres de filtre sont retournés à la configuration précédente.

3. Souris de retour et d'analyse de données

Éteignez le vaporisateur isoflurane et le transfert de la zone de confinement XIC retour à l'enceinte de sécurité biologique.
Placez les souris de retour au sein de leur unité de logement, fermer le haut, vaporiser l'extérieur avec un désinfectant approprié et remettez le casier de stockage.
1. Veiller à ce que les souris ont complètement récupéré de l'anesthésie.
Répétez la procédure ci-dessus jusqu'à ce que l'expérience nécessite d'imagerie est terminée.
Désinfecter le BSC, arrêtez l'appareil et transférer toutes les données vers un emplacement en dehors de laboratoire pour une analyse ultérieure.
Analyser les données et de générer des images en 3 dimensions basées sur les résultats IVIS utiliser le logiciel LivingImage.
1. S'assurer que l'image est correctement orientée et l'éclairage / balance des couleurs est réglé. Dans la palette d'outils des options incluent Réglage de l'image, les services correctionnels, Informations sur l'image et les outils de ROI.
2. Utiliser des formes ROI d'identifier les forces de signaux spécifiques sur la base de l'emplacement.
3. Reconstruire la topographie de la surface pour mettre en évidence le corps de la souris, initialiser la reconstruction 3D DLit, et utiliser un ajustement linéaire pour définir la carte d'organes à la reconstruction topographique.
Une analyse plus titrage viral peut être complété par la collecte de sang et les organes. Le titrage dans cette étude a été réalisée par l'homogénéisation du tissu cérébral dans aigles modifié moyenne (MEM). L'homogénat a été dilués en série et nous avons infecté une plaque à 6 puits de cellules Vero pendant 1 heure. Les cellules ont été recouvertes d'une superposition agarose/2xMEM 1,5% et incubées pendant 2 jours à 37 degrés. Les cellules ont été fixées avec 10% de formol pendant 30 min et colorées aveccristal violet.