Ex vivo d'imagerie en temps réel de simples divisions cellulaires dans neuroépithélium de souris

Résumé

Ici, nous développons les outils nécessaires pour Ex vivo Imagerie en temps réel à tracer des divisions cellulaires simples dans la souris E8.5 neuroépithélium

Résumé

Nous avons développé un système qui intègre l'imagerie en direct de marqueurs fluorescents et des tranches de culture du neuro-épithélium embryonnaire de la souris. Nous avons profité de lignées de souris existants pour la cellule génétique lignée de traçage: une ligne Cre inductible par le tamoxifène et une ligne de journaliste exprimant Cre DsRed lors de la recombinaison Cre-médiation. En utilisant un niveau relativement bas du tamoxifène, nous étions capables d'induire la recombinaison dans un petit nombre de cellules, ce qui permet de suivre les divisions cellulaires individuels. En outre, nous avons observé la réponse transcriptionnelle à Sonic Hedgehog (Shh) de signalisation utilisant un Olig2-eGFP transgénique ligne ^1-3 et nous avons suivi la formation des cils en infectant la tranche cultivé avec le virus exprimant le marqueur de cils, SSTR3-GFP ^4. Afin d'image à l'neuroépithélium, nous avons récolté embryons à E8.5, isolé du tube neural, fixé la tranche de neurones dans des conditions de culture appropriées dans la chambre de formation d'image et réalisée en accéléré imagerie confocale. Notre exvivo méthode imagerie en temps réel permet de tracer des divisions cellulaires simples pour évaluer la chronologie relative de la formation des cils primaires et la réponse Shh d'une manière physiologiquement pertinents. Cette méthode peut être facilement adapté en utilisant des marqueurs fluorescents distinctes et fournit le terrain, les outils permettant de surveiller le comportement des cellules in situ et en temps réel.

Protocole

souris adultes sont euthanasiés par dislocation cervicale mécanique. Toutes les procédures d'animaux ont été approuvés par le IACUC et le Comité de biosécurité de l'Université Emory.

1. Embryon Generation

1. Cross tamoxifène Cre inductible ligne, CAGGCreER, et la ligne de journaliste dsRedCre (Tg (CAG-Bgeo,-DsRed * MST) 1Nagy) (Figure 1) ^5,6. Pour suivre la chronologie relative de la réponse Shh dans les cellules filles, croix CAGGCreER et DsRed ligne avec le Olig2-eGFP BAC souris transgéniques (Tg (Olig2-EGFP) EK23Gsat) (Figure 1) ^7,8.
2. Dissoudre le tamoxifène dans l'éthanol à 100%, et d'effectuer une injection intrapéritonéale de 2,5 mg de tamoxifène par 40 g de poids corporel des femelles gravides à 6,5 embryonnaire (E6.5) pour induire l'expression Cre et l'étiquetage DsRed dans un petit sous-ensemble de cellules.
3. 48 heures plus tard disséquer embryons, d'identifier les embryons positifs DsRed utilisant le microscope à fluorescence, les transférer à la boîte de culture et observateurse divisions cellulaires simples lors de l'imagerie ex vivo (voir ci-dessous).

2. Whole embryon de souris Culture

1. Disséquer E8.5 embryons en milieu de lavage préchauffé contenant DMEM/F12 (1:1) complété avec 10% de sérum de veau nouveau-né et 1% de pénicilline / streptomycine (P / S) ^9.
2. Directement après dissection, place embryons sur ° étage de chauffage 37 ° C sous le microscope fluorescent et d'identifier que la GFP et / ou DsRed positive (voir ci-dessous).
3. Transfert jusqu'à 2 embryons dans une goutte 500 ul de milieux de culture pré-équilibrée contenant 50% sérum de rat d'un mâle Sprague-Dawley et 50% DMEM/F12 (1:1) sans rouge de phénol additionné de L-glutamine et 1% des 1 M HEPES dans NaCl 0,85% et P / S ^9.
4. Appliquer une couche mince (0,1 cm) d'huile minérale légère équilibrée sur le moyen pour éviter l'évaporation et le transfert de la boîte de culture contenant les embryons à la 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur.

3.Infection virale

1. Afin de cils de l'étiquette dans le neuroépithélium, ajouter 5-10 pi de SSTR3-GFP lentivirus, environ 2 millions de virions, à une baisse de 500 ul équilibrée de milieu de culture contenant un embryon E8.5.
2. Après 18 heures de culture, de transférer l'embryon infecté dans quelques gouttes de milieu de lavage pour laver le virus et préparer tranche du tube neural.

4. Neural Tube Slice Préparation pour l'imagerie en direct

1. Disséquer tube neural de l'embryon E8.5 en milieu de lavage préchauffé en utilisant une taille de micro-couteau 0.025 mm, sur un 1% d'agar plat enduit.
2. Placez le neural face ventrale du tube isolé dans une goutte 150 ul de milieu de culture équilibrée sans rouge de phénol sur le mm enduit plat à fond de verre poly-L-lysine 35.
3. Mettez de petites quantités d'un mélange 1:1 en 100% pur de la vaseline et la cire de bougie fondue (bougie d'IKEA) autour du tube neural monté, et appuyez doucement par une étroite bande de lamelle de verre afin d'immobiliser l'échantillon.
4. Couvrir le plat avec une couche mince (~ 0,1 cm) d'huile minérale légère équilibrée (Figure 2).

5. Vivre Imaging and Time-lapse microscopie confocale

1. Placez le plat sous le Nikon A1R Laser Microscope inversé confocal équipé d'une chambre environnementale qui régule la température, réglé à 37 ° C et 5% de CO _2.
2. Utilisez 60x objectif à immersion d'huile d'enregistrer GFP cils étiquetés et cellules positives DsRed, tandis que l'utilisation de l'objectif à immersion d'huile 40x pour surveiller Olig2-GFP et des cellules positives DsRed.
3. Ouvrez le logiciel NIS Elements pour mettre en place les conditions d'imagerie time lapse. Chaque 10 min acquérir z piles allant jusqu'à 25 um avec un espacement de 1,5 um (40x) et jusqu'à 8 pm avec un espacement de 0,4 um (60x objectif). Utilisez 488 et 561 nm les longueurs d'onde d'excitation et le canal transmis si nécessaire. Acquérir des images à 512 x 512 taille. Mettre en place plusieurs régions définies par l'utilisateur de intEREST pour effectuer un enregistrement en même temps.
   Exposition optimale à la puissance du laser et de la luminosité de l'image a été ajusté par l'utilisation intensité du laser bas (jusqu'à 11% pour mCherry 561; jusqu'à 4,5% EGFP 405/488), vitesse de balayage 1, ligne moyenne 2 et la taille du trou d'épingle (61 um pour dsRED; 28,1 um pour Olig2; 72 um pour SSTR3GFP; 61,3 um pour dsRED et SSTR3GFP; 58 um pour dsRED et Olig2). L'utilisation de reporters fluorescentes codées génétiquement nous a permis de détecter la luminosité avec une puissance laser de faible.
4. Analyser les données enregistrées en utilisant un logiciel 3D Imaris de reconstruction.

6. Immunofluorescence

1. Fixer des embryons ou des tubes neuraux isolés dans du paraformaldéhyde 4% / 0,1 M de tampon phosphate sur la glace (4 ° C) pendant 1 heure dans un plat en verre.
2. Lavez échantillons 2 h dans du PBS sur la glace (4 ° C) (variation PBS quelques fois) et de mettre en saccharose à 30% / 0,1 M de tampon phosphate au cours de la nuit ou jusqu'à ce que les embryons évier.
3. Intégrer dans l'OCT, gel sur la glace sèche et le ranger dans -80 ° C. Perform sectionner le cryostat (10 mm).
4. Laver les lames pendant 10 min dans une solution de lavage contenant 1% de sérum de mouton inactivés par la chaleur et de 0,1% de Triton X-100 dans du PBS.
5. Diluer anticorps primaires dans la solution de lavage à la suite de concentrations: Rat monoclonal anti-DP (5F8), 1:200; lapin anti-Arl13b 1:1500 sérum et anticorps monoclonal de souris anti-Arl13b 01h05 (295B/54); lapin anti-Olig2 1:300; anticorps monoclonaux de souris Pax6, chut et Nkx2.2-all 01h10 et de lapin polyclonaux Ki67 1:500. Ajouter environ 150 pi par diapo dans chambre humidifiée plat, couvrir avec du parafilm pour éviter le dessèchement et laisser sur la nuit à 4 ° C.
6. Laver les lames dans une solution de lavage à trois reprises, à 20 min à chaque fois à la température ambiante.
7. Diluer anticorps secondaire Alexa Fluor 488, 568, 350 dans les solutions de lavage à 1:200 concentration. Utilisez Hoechst 1:3,000 ou TO-PRO-3 1:500 pour colorer les noyaux. Ajouter 150 ul par diapositive, laisser 1 heure à température ambiante en chambre humide abri de la lumière.
8. Laver les lames dans la solution de lavage two fois, 30 min à chaque fois à la température ambiante.
9. Mont glisse dans 80% ProLong réactif et vue anti-fade or dans les 24 heures.

Résultats

Ici, nous avons effectué ex vivo l'imagerie en direct de divisions cellulaires simples dans le neuroépithélium souris E8.5. Pour marquer les cellules individuelles, nous avons provoqué la recombinase Cre dans un sous-ensemble de cellules contenant une ligne de journaliste Cre celle exprimée DsRed lors de la recombinaison ^5,6 (figure 3A). Ainsi, 48 heures plus tard, nous avons pu observer des divisions cellulaires simples pendant ex imagerie in vivo ...

Discussion

Notre système ex vivo nous permet d'observer directement divisions cellulaires uniques dans le neuroépithélium développement en temps réel. À titre d'exemple, nous avons examiné les divisions cellulaires dans le tube neural embryonnaire de la souris et surveillés soit la formation cil ou réponse Shh. Nous avons confirmé nos résultats d'imagerie (n = 24) ont été cohérents avec les résultats des sections fixes (n = 178) indiquant notre technique fournit des données ph...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J	Jackson Laboratory	005438
Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd	MMRRC,	010555-UCD
CAGGCreER	Jackson Laboratory	003724
Tamoxifen	Sigma	T5648
DMEM/F12 (1:1)	GIBCO	21041-025
Newborn calf serum	Lonza	14-416F
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Rat Serum SD male	Harlan Bioproducts	4520
1M Hepes	BioWhittaker	17-737E
L-Glutamine	GIBCO	21041-025
Light mineral oil	Sigma	M8410
Sstr3-GFP lentivirus	Emory Viral Core
Micro-knife, size 0.025 mm	Electron Microscopy Sciences	62091
35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish	MatTek	P35GC-0-10-C
100% Petroleum Jelly	Kroger	FL9958c
A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope	Nikon
NIS Elements software	Nikon
Imaris 3D software	Bitplane AG	Imaris 7.2.3
OCT	Tissue-Tek	4583
Cryostat	Leica	CM1850
Heat-inactivated sheep serum	Invitrogen	16210-072
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151
Parafolmaldehyde	Sigma	P6148
Phosphate Buffer	Lab made
Rat monoclonal anti-RFP (5F8)	Chromotek	110411
Rabbit anti-Arl13b serum	NeuroMab
mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5	NeuroMab
Rabbit anti-Olig2	Chemicon	AB9610
Mouse monoclonals Pax6	Developmental Hybridoma Bank	Pax6
Mouse monoclonalsShh	Developmental Hybridoma Bank	5E1
Mouse monoclonals Nkx2.2	Developmental Hybridoma Bank	74.5A5
Rabbit polyclonal Ki67	Abcam	AB15580
Alexa Fluor 488	Molecular Probes	A11029
Alexa Fluor 568	Molecular Probes	A11031
Alexa Fluor 350	Molecular Probes	A11046
H–chst	Fisher	AC22989
TO-PRO-3	Invitrogen	T3605
ProLong Gold anti-fade reagent	Invitrogen	P36934