Capture d'sélectif de 5-hydroxyméthylcytosine partir de l'ADN génomique

Résumé

Décrit un procédé de marquage en deux étapes à l'aide β-glucosyltransférase (β-GT) pour transférer un azide-glucose à 5-HMC, suivie par click chemistry pour transférer un segment de liaison de biotine pour l'enrichissement facile et indépendante de la densité. Cette méthode d'étiquetage efficace et spécifique permet l'enrichissement de la 5-HMC avec un fond extrêmement faible et la cartographie épigénomique à haut débit via séquençage de prochaine génération.

Résumé

5-méthylcytosine (5-mC) constitue ~ 2-8% des cytosines total dans l'ADN génomique humain et affecte une large gamme de fonctions biologiques, y compris l'expression des gènes, le maintien de l'intégrité du génome, empreinte parentale, inactivation du chromosome X, la réglementation des développement, le vieillissement et le cancer ^1. Récemment, la présence d'un 5-mC oxydé, 5-hydroxyméthylcytosine (5-HMC), a été découvert dans les cellules de mammifères, en particulier dans les cellules souches embryonnaires (ES) et de cellules neuronales ^2-4. 5-HMC est généré par l'oxydation du 5-mC catalysée par TET famille du fer (II) / α-cétoglutarate en fonction de dioxygénases ^{2, 3.} 5-HMC est proposé de participer à l'entretien de souches embryonnaires (MES) cellulaire, hématopoïèse normale et les tumeurs malignes et le développement du zygote ^{2, 5-10.} Afin de mieux comprendre la fonction de la 5-HMC, un système de séquençage fiable et simple est essentielle. Séquençage bisulfite traditionnelle ne peut pas distinguer 5-5-console HMC à partir MC ¹¹ 12.

Nous décrivons ici une simple procédure en deux étapes pour l'étiquetage chimique sélective de la 5-HMC. Dans la première étape de marquage, le 5-HMC dans l'ADN génomique est marqué avec un azide catalysée 6-β-glucose par-GT, une glucosyltransférase du bactériophage T4, d'une manière qui transfère le 6-azide-glucose à 5-HMC de l' modifié cofacteur, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). Dans l'étape, biotinylation seconde, une liaison disulfure biotine est fixé au groupe azide par click chemistry. Ces deux étapes sont très spécifiques et efficace, conduisant à compléter l'étiquetage quelle que soit l'abondance de la 5-HMC dans des régions génomiques et en donnant de fond extrêmement faible. Après biotinylation de 5-HMC, les fragments d'ADN 5-HMC contenant sont ensuite sélectivement capturéen utilisant des billes de streptavidine d'une manière indépendante de la densité. Les résultantes 5-HMC-enrichis fragments d'ADN peuvent être utilisés pour les analyses en aval, y compris séquençage de prochaine génération.

Notre marquage sélectif et le protocole de capture confère une sensibilité élevée, applicable à toute source d'ADN génomique avec des variables / 5 diversifiée HMC abondance. Bien que le but principal de ce protocole est son application en aval (., Séquençage de prochaine génération de cartographier la distribution 5-HMC dans le génome), il est compatible avec une seule molécule, en temps réel SMRT (ADN) séquençage, qui est capable de fournir séquençage résolution d'une seule base de 5-HMC.

Protocole

1. La fragmentation ADN génomique

Fragment d'ADN génomique en utilisant sonication à une gamme de taille souhaitée adapté à la plate-forme de séquençage du génome entier. (En général, nous soniquer à ~ 300 pb.) Vérifier la distribution de la taille de l'ADN génomique fragmenté sur gel d'agarose 1% (Figure 1).

2. Préparation de l'ADN

Déterminer les quantités d'ADN à partir basées sur l'abondance de la 5-HMC dans l'ADN génomique. Depuis le 5-HMC niveaux varient considérablement dans différents types de tissus, des quantités d'ADN à partir dépendre des niveaux de 5-HMC des échantillons. S'il vous plaît se référer au tableau 1 pour des exemples.

3. β-GT réaction catalysée (Réaction de transfert de glucose)

1. Mélanger à la pipette le mélange comme indiqué dans le tableau 2 et incuber dans un bain à 37 ° C de l'eau pendant 1 heure.
2. Après incubation, nettoyer la réaction avec QIAquick suppression de nucléotides, utilisant 10 pg d'ADN parcolonne. Éluer avec 30 pl d'eau par colonne et se combinent.

4. La réaction de biotinylation (Cliquez Chimie)

1. Ajouter DBCO-SS-biotine conjugué Peg3-solution de travail (1 mM) dans la solution d'ADN élué (à partir de l'étape 3) à une concentration finale de 150 uM (soit 5 ul de solution de travail pour 30 solution d'ADN ul).
2. Mélanger à la pipette et incuber dans un bain à 37 ° C de l'eau pendant 2 heures.
3. Nettoyer la réaction avec QIAquick suppression de nucléotides. Le volume d'élution idéal totale est de 100 ul.
4. Quantifier la quantité d'ADN récupéré à l'aide spectrophotomètre échelle du microlitre (p. ex., NanoDrop).

5. La capture de 5-HMC ADN contenant

1. Lavez 50 pi de Dynabeads MyOne C1 streptavidine 3 fois avec 1 ml de B & W 1X tampon conformément aux instructions du fabricant. Séparer les billes avec un support magnétique.
2. Ajouter un volume égal de tampon 2X B & W pour le récupéré D biotinyléNA (100 ul) pour les billes lavées.
3. Incuber pendant 15 min à température ambiante avec une légère rotation sur un rotateur.
4. Séparer les billes avec un support magnétique et laver les billes 3 fois avec 1 ml de tampon 1X B & W.
5. Éluer l'ADN par incubation des billes dans 100 ul de fraîchement préparée DTT 50 mM pendant 2 h à température ambiante avec une légère rotation sur un rotateur.
6. Séparer les billes avec un support magnétique. Aspirer l'éluant et la charge sur un Micro Bio-Spin 6 Colonne selon les instructions de fabrication pour enlever la TNT. L'ADN cible est présent dans la solution.
7. Purifier l'ADN élue de l'étape précédente par Qiagen PCR Purification Kit MinElute et éluer l'ADN dans 10 pl de tampon EB. Quantifier l'ADN en utilisant fluorimètre qubit, ou NanoDrop si la concentration est supérieure à 20 ng / ul. L'ADN est prêt pour aval du génome entier de préparation bibliothèque séquençage.

6. Les résultats représentatifs

Si le joint de la qualitéf ADN génomique est élevée, les rendements de récupération typiques après la β-GT et les réactions sont biotinylation ~ 60-70%. Cependant, l'efficacité de captage varient considérablement en fonction des types de tissus différents en fonction des niveaux de 5-HMC des échantillons. En règle générale, l'efficacité de captage de l'ADN génomique du cerveau est d'environ 4-9%, et dans certains cas extrêmes, le rendement peut atteindre jusqu'à 12%. Pour les cellules ES, l'efficacité de captage moyenne est d'environ 2-4%, contrairement à ~ 0,5% pour les cellules souches neurales. La faible efficacité vu jusque là est pour l'ADN génomique à partir de cellules cancéreuses. Tout l'ADN enrichi est prêt pour la prochaine génération de standards protocoles de préparation de la bibliothèque. En outre, l'ADN capturée peut également être utilisé comme matrice pour la PCR en temps réel pour détecter l'enrichissement de quelques fragments d'ADN par rapport à l'entrée, si les amorces liées sont disponibles.

Figure 1. Soniquées homme fragments d'ADN génomique dans1% gel d'agarose. 10 pg d'ADN génomique isolé à partir de cellules iPS humaines dans 120 ul de tampon TE 1X a été soniquée à l'aide d'un dispositif de sonication (Covaris). Après sonication, 2 pl de l'ADN soniqué a été chargé sur un gel d'agarose 1% en utilisant 100 pb de l'ADN marqueur pour comparer les tailles des fragments d'ADN soniqué.

Composant	Volume	Concentration finale
Eau	_ Pl
Tampon de 10 X Réaction β-GT	2 pl	X 1
Jusqu'à 10 mg d'ADN génomique	_ Pl	Jusqu'à 500 ng / pl
UDP-6-N 3-Glc (3 mM)	0,67 ul	100 pM
β-GT (40 uM)	1 pl	2 uM
Le volume total	20 pi

i) Pour l'ADN génomique des tissus (haute teneur en 5-HMC> 0,1%)

Composant	Volume	Concentration finale
Eau	_ Pl
Tampon de 10 X Réaction β-GT	10 pl	X 1
Jusqu'à 20 mg d'ADN génomique	_ Pl	Jusqu'à 500 ng / pl
UDP-6-N3-Glc (3 mM)	Ul 1,33	100 pM
β-GT (40 uM)	2 pl	2 uM
Le volume total	40 pi

ii) Pour l'ADN génomique de cellules souches (médiane 5-HMC contenu ~ 0,05%)

Composant	Volume	Concentration finale
Eau	_ Pl
Tampon de 10 X Réaction β-GT	10 pl	X 1
Jusqu'à 50 mg d'ADN génomique	_ Pl	Jusqu'à 500 ng / pl
UDP-6-N3-Glc (3 mM)	3,33 ul	100 pM
β-GT (40 uM)	5 pl	2 uM
Le volume total	100 pi

iii) Pour l'ADN génomique des cellules cancéreuses (faible teneur en 5-HMC ~ 0,01%)

Tableau 1. Exemples de quantités d'ADN d'entrée et de réactions de marquage utilisant des échantillons avec différents niveaux de 5-HMC par la méthode de marquage chimique sélective.

Échantillon	5-HMC niveau	ADN de départ (pg)	La récupération après l'étiquetage (entrée à billes) (pg)	Rendement de récupération	Pull-down ADN (ng)	Pull-down rendement
Cervelet de souris adulte	0,4%	10	7,5	75%	236	3,1%
Postnatal du cervelet de souris 7 jours	0,1%	11	9	82%	140	1,6%
Souris cellules ES E14	0,05%	60	42	70%	350	0,8%

Tableau 2. Résultats représentatifs à partir de tissus de cerveau de souris et des cellules ES.

Discussion

5-hydroxyméthylcytosine (5-HMC) est une modification présente récemment identifié épigénétique en quantités importantes dans certains types de cellules de mammifères. La méthode présentée ici est de déterminer la distribution du génome entier de 5-HMC. Nous utilisons bactériophage T4 β-glucosyltransférase de transférer une fraction de glucose ouvragée contenant un groupe azide sur le groupe hydroxyle de 5-HMC. Le groupe azide peut être modifié chimiquement avec de la biotine pour la détection, l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom	Entreprise	Catalogue	Commenter
			Réactifs
Le chlorure de sodium 5M (NaCl)	Promega	V4221
0,5 M pH 8,0 acide éthylène diamine (EDTA)	Promega	V4231
1M Trizma de base (Tris) pH 7,5	Invitrogen	15567-027)
HEPES 1M, pH 7,4	Invitrogen	15630
Le chlorure de magnésium (MgCl 2) 1M	Ambion	AM9530G
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Sigma	D8418
Tween 20	Fisher BioReagents	BP337-100
DBCO-SS-biotine conjugué Peg3-	Cliquez sur Outils Chimie	A112P3
1,4-dithiothréitol, ultrapure (TNT) suprapur	Invitrogen	15508-013
QIAquick suppression de nucléotides	Qiagen	28304
Micro Bio-Spin 6 Colonne	Bio-Rad	732-6222
Dynabeads MyOne	Invitrogen	650-01
Streptavidine C1
Qiagen PCR Purification Kit MinElute	Qiagen	28004
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500500
UDP-6-N 3-glucose	Active Motif	55013
			Enzyme
β-glucosyltransférase (β-GT)	New England Biolab	M0357
			Équipement
Dispositif de sonication	Covaris
Centrifugeuse bureau
Bain d'eau	Fisher Scientific
Appareil de gel running	Bio-Rad
NanoDrop1000	Thermo Scientific
Labquake Tube Shaker	Barnstead
Labquake Tube Shaker	Thermolyne
Pied de séparation magnétique	Promega	Z5342
Qubit 2,0 fluorimètre	Invitrogen
			10 Configuration réactif X β-GT tampon de réaction (500 mM HEPES pH 7,9, 250 mM de MgCl 2) 2 X à relier et de lavage (B & W) tampon (10 mM Tris pH 7,5, EDTA 1 mM, NaCl 2 M, 0,02% de Tween 20) .