Super-resolution Imaging Division de la machinerie bactérienne

Résumé

Nous décrivons une méthode de super-résolution d'imagerie pour sonder l'organisation structurelle de la FtsZ torique bactérienne, un appareil essentiel pour la division cellulaire. Cette méthode est basée sur des analyses quantitatives de photoactivées localisation de microscopie (PALM) images et peut être appliquée à d'autres protéines du cytosquelette bactérien.

Résumé

La division cellulaire bactérienne nécessite l'assemblage coordonné de plus de dix protéines essentielles à midcell ^1,2. Au cœur de ce processus est la formation d'une superstructure en forme d'anneau (O-ring) par la protéine FtsZ au plan de ^3,4 division. Le Z-ring se compose de plusieurs protofilaments FtsZ simple brin, et de comprendre l'agencement des protofilaments à l'intérieur de l'O-ring donnera un aperçu du mécanisme de Z-anneau de montage et de sa fonction en tant que générateur de ^5,6 vigueur. Cette information est resté inaccessible en raison des limites actuelles de la microscopie par fluorescence et par microscopie électronique conventionnelle. Microscopie à fluorescence conventionnelle est incapable de fournir une image à haute résolution de l'O-ring en raison de la limite de diffraction de la lumière (~ 200 nm). Electron cryotomographic imagerie a détecté dispersés dans les petites protofilaments FtsZ C. cellules crescentus ^7, mais est difficile à appliquer à des cellules plus grandes telles queE. coli ou B. subtilis. Nous décrivons ici l'application d'une méthode de super-résolution microscopie à fluorescence, microscopie Localisation photoactivé (PALM), pour caractériser quantitativement l'organisation structurelle de l'E. coli O-ring ^8.

PALM offre à la fois l'imagerie à haute résolution spatiale (~ 35 nm) et un étiquetage spécifique pour permettre une identification sans ambiguïté des protéines cibles. Nous avons étiqueté FtsZ avec la protéine fluorescente mEos2 photoactivable, qui passe du vert fluorescence (excitation = 488 nm) au rouge fluorescence (excitation = 561 nm) lors de l'activation à 405 nm ^9. Au cours d'une expérience PALM, simples FtsZ-mEos2 molécules sont activées stochastiquement et les positions correspondantes barycentre des molécules individuelles sont déterminées avec une précision <20 nm. Une image de super-résolution de l'O-ring est ensuite reconstruite par superposition des positions des centroïdes de tous détectés FtsZ-mEos2 molécules. <p class = "jove_content"> En utilisant cette méthode, nous avons constaté que l'O-ring a une largeur fixe de ~ 100 nm et est constitué d'un faisceau lâche de protofilaments FtsZ qui se chevauchent les uns avec les autres en trois dimensions. Ces données fournissent un tremplin pour d'autres études sur les changements du cycle cellulaire dépendant de la ¹⁰ Z-ring et peut être appliquée à d'autres protéines d'intérêt.

Protocole

1. Préparation des échantillons

1. Inoculer milieu LB avec une seule colonie de la souche JB281 [BW25113 / pJB042 (P _Lac: FtsZ-mEos2)]. Cultivez la nuit dans un shaker à 37 ° C.
2. Diluer la culture 1:1000 dans M9 ⁺ minimes médias [sels M9, glucose 0,4%, 2 mM MgSO _4, 0,1 mM CaCl _2, acides aminés et vitamines MEM] et passer à la phase mi-log _(DO600 = 0.2 à 0.3) en présence de chloramphénicol (150 ug / ml) à température ambiante (RT).
3. Provoquer la culture avec 20 uM d'IPTG pendant 2 heures (voir note n ° 1).
4. Culture culot dans microcentrifugeuse (8.000 rpm, 1 min) et remettre ....

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Résultats

Illustré à la figure 3Aiv est un bidimensionnelle, de super-résolution de rendu de l'anneau Z-générée à partir de la méthode d'imagerie PALM décrit ci-dessus. Ci-dessous, nous résumons les informations qualitatives et quantitatives qui peut être obtenu de leur part.

Qualitativement, nous avons observé que l'O-ring est une structure irrégulière qui adopte plusieurs configurations (bande unique ou d'un arc hélicoïdal) qui ne sont pas distinguée.......

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Discussion

Images PALM contiennent des informations sur compte molécules et fonctions au sein d'une cellule, ce qui permet une analyse détaillée de la répartition et l'agencement des molécules de protéines cibles qui est difficile à obtenir par d'autres moyens. Ci-dessous, nous présentons les précautions qui doivent être prises pour en extraire des informations quantitatives précises tout en maintenant la pertinence biologique des images PALM. Nous explorons également les informations qui peuvent être obte.......

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom de réactif / Matériel	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
50 x MEM acides aminés	Sigma	M5550
100 x MEM Vitamines	Sigma	M6895
IPTG	Mediatech	46 à 102-RF
Paraformaldéhyde 16%	Electron Sciences Micrsocopy	15710-S
GTG Agarose SeaPlaque	Lonzo	50111
50 perles d'or nm	Microsphères-Nanosphères	790113-010
FCS2 imagerie Chambre	Bioptechs
Adaptateur étape	ASI	I-3017
Microscope inversé	Olympe	IX71
NA 1,45, 60x Objectif	Olympe
IXON EMCCD caméra	Andor Technology	DU897E
488-nm laser saphir	Cohérent
561-nm laser saphir	Cohérent
Laser CUBE 405-nm	Cohérent