Génération de rats transgéniques par voie topique<em&gt; In utero</em&gt; L&#39;électroporation et<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescence dépistage

Résumé

Les gènes peuvent être manipulés au cours du développement du cortex ou de l'hippocampe du rat par électroporation in utero (IUE) à E16, pour permettre des modifications rapides et ciblées en matière de connectivité neuronale à des études ultérieures de comportement ou la neuropathologie chez les animaux adultes. Postnatal l'imagerie in vivo pour le contrôle de succès IUE est effectuée par la bioluminescence de l'activation de la luciférase co-transfecté.

Résumé

Électroporation in utero (IUE) est une technique qui permet la modification génétique de cellules dans le cerveau pour étudier le développement neuronal. Jusqu'à présent, l'utilisation de l'IUE pour étudier le comportement ou la neuropathologie dans le cerveau adulte a été limitée par des méthodes insuffisantes pour la surveillance de l'IUE succès de la transfection par des techniques non-invasives chez les animaux postnatales.

Pour la présente étude, des rats ont été utilisés pour E16 IUE. Après l'injection intra-ventriculaire des acides nucléiques dans les embryons, le positionnement des électrodes de la pince était critique pour le ciblage ou l'autre développement du cortex ou de l'hippocampe.

Ventriculaire co-injection et l'électroporation d'un gène de la luciférase a permis la surveillance des cellules transfectées après la naissance, après injection intra-péritonéale de la luciférine dans le P7 direct pup anesthésiés par bioluminescence in vivo, en utilisant un dispositif IVIS spectre avec un logiciel de quantification 3D. gène DISC1 humain de pleine longueur dans le cortex de rat a entraîné une hypersensibilité amphétamine. GFP co-transfectées a pu être détectée dans les neurones post-mortem par microscopie à fluorescence dans cryosections indiquant l'expression des gènes présents à ≥ 6 mois après la naissance.

Nous concluons que l'imagerie par bioluminescence postnatale permet d'évaluer le succès de transfections transitoires avec IUE chez les rats. Enquêtes sur l'influence des manipulations génétiques d'actualité pendant neurodevelopment sur le cerveau adulte et sa connectivité sont grandement facilitée. Pour de nombreuses questions scientifiques, cette technique peut compléter ou même remplacer l'utilisation de rats transgéniques et de fournir une nouvelle technologie pour les neurosciences comportementales.

Introduction

Le développement de l'électroporation in utero de procédé (IUE) qui permet une modulation de l'expression des gènes dans le cerveau en développement, a été percée, car il a permis d'étudier le développement neurologique avec une relative facilité. ^07.01 variations de niveaux d'un gène cible dans l'expression une région spécifique du cerveau au cours du développement embryonnaire et / ou périnatale chez les rongeurs ont été démontrées de façon critique la prolifération neuronale influence, la migration, l'arborisation, et la connectivité. ^8-10

La schizophrénie est une maladie mentale complexe avec des symptômes aigus et chroniques qui ont été liées à des anomalies du développement neurologique ^{11, 12} et donc un grand nombre de gènes candidats identifiés pour la schizophrénie sont étudiés les effets de modulation potentiels sur le développement neurologique, comme par exemple pour le perturbé en schizophrénie -1 (DISC1) gène ^13-15.

Le développement du cerveau est regulated par des facteurs génétiques et de leurs interactions avec l'environnement qui jouent un rôle dans, pré-périodes de développement péri-et post-natales. Un important facteur de risque génétique pour différents troubles du comportement sont les DISC1 ¹⁶ gène. DISC1 fils knockdown à des défauts de migration chez la souris ^{13, 17,} et la manipulation de l'expression de DISC1 dans le cortex en développement par l'IUE a été montré pour influer sur le comportement de souris adultes ^18.

La manipulation de l'expression des gènes du cerveau par IUE présente plusieurs avantages par ¹⁹ rapport à la génération de lignées d'animaux transgéniques. Tout d'abord, l'expression des gènes dans des domaines d'intérêt est obtenue en quelques semaines à plusieurs mois plutôt que plusieurs générations d'élevage de rongeurs transgéniques lignes. Deuxièmement, des mécanismes de compensation au cours du développement précoce qui peut bouclier phénotypes chez les animaux de la lignée germinale ingénierie ²⁰ sont évités. Troisièmement, en ciblant uniquement une population cellulaire spécifique ou une zone spécifique du cerveau, migratiou des différences de prolifération peuvent être directement comparés avec le non-mutant ou contrôlent côté controlatéral si électroporations unilatérales sont choisis. D'autre part, IUE n'a pas la précision de cre / lox moment induit-promoteur-driven d'expression et seulement une sous-population de cellules dans un certain domaine est ciblée qui conduit à une sorte de mosaïque de motif d'expression génique.

Pour de nombreuses applications expérimentales chez les rongeurs adultes, une transfection transitoire d'un nombre limité de cellules dans une région du cerveau peut être suffisante, voire souhaitée, de sorte que le principal avantage de la lignée germinale, les rongeurs transgéniques stables est négligeable. En fait, l'IUE est utile d'examiner si certaines cellules anormalement développés peuvent affecter tout un réseau de cellules ou de circuits. Un autre avantage pourrait être la capacité à démontrer des effets non de cellules-autonome d'un gène en raison de la nature de la mosaïque de la frappe. En outre, la génération de rats transgéniques et knock-out est encore à ses débuts et l'utilisationde l'IUE dans cette espèce pour l'étude des conséquences aberrantes de développement du cerveau est d'un grand intérêt.

Jusqu'à présent, un obstacle majeur à l'aide de l'IUE pour étudier les conséquences de l'intervention dans les animaux que les adultes, c'est le manque de succès de l'électroporation de surveillance. Jusqu'à présent, GFP-co-transfectée dans les neurones fluorescents rats nouveau-nés vivants ne pouvaient pas être détectés par fluorescence sous un microscope binoculaire convenable ou avec l'imagerie de fluorescence du spectre IVIS.

Pour surmonter cet obstacle, on co-transfecté un gène rapporteur de la luciférase et effectué bioluminescence imagerie en temps réel des chiots par trois dimensions (3D) la quantification de la zone du cerveau IUE.

A titre d'exemple pour démontrer l'applicabilité de ce procédé dans une analyse fonctionnelle ultérieure tester la manipulation génétique du développement neurologique, une co-injection de plasmides contenant DISC1 humain, la luciférase, et la GFP dans le ventricule latéral d'embryons de rat ^{3 suivie par électroporation avec une électrode de type brucelles a été effectuée. Bien que les signaux de fluorescence n'a été détectée dans les stades post-natales in vivo, d'un signal de bioluminescence solide dérivé de la luciférine par métabolisme gène de la luciférase a été co-transfecté détectée jusqu'à cinq semaines après la naissance. 3D-mesures de la zone du cerveau a permis de quantifier électroporation lequel chiots avec électroporation insuffisante ou égarés ont été identifiés dès le départ, donc, permettant l'affectation des animaux IUE (gène d'intérêt et brouillés contrôle) à des groupes expérimentaux avec appariés zones du cerveau électroporation de faible variabilité . L'utilisation de rats IUE adultes paradigmes comportementaux a été démontrée comme un exemple de l'utilité de ce protocole.}

Protocole

Toutes les expériences animales ont été autorisées par le responsable Landesministerium für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV NRW; 87-51.05.2010.A301) en conformité avec la législation européenne et nationale.

1. Électroporation in utero

Cette méthode a été décrite en détail dans JoVE pour le rat par Walantus et al. ^3, ainsi que Rice et al. ⁴ et est ici résumée brièvement. Une taille de la portée de chiots 6-8 donne un bon résultat. Il devrait y avoir au moins deux embryons non électroporation afin d'augmenter le taux de survie globale (voir ci-dessous).

1. Préparer l'ADN Mélange qui contient 1,5 ug / ul de plasmide cible (shRNA: pENTR-U6, Invitrogen, Eugene, OR / DISC1 surexpression: pCAX ^21), 0,5 pg / pl luciférase contenant le plasmide (pCAX), 0,5 pg / pl GFP contenant le plasmide (pCAGGS ²²⁾ 1x PBS solution souillé blu lumièree avec Fast Green Dye.
2. Préparer des aiguilles d'injection de tubes capillaires en verre avec une pipette à aiguille extracteur. Et stériliser les instruments chirurgicaux, soit par autoclavage ou incubation avec un désinfectant à base d'alcool (kodan Tinktur forte).
3. Administrer une dose pré-opératoire de la buprénorphine (0,05 mg / kg) 15 minutes avant l'intervention chirurgicale pour un rat enceinte 16 jours après la fécondation (E16). Puis anesthésier l'animal dans une chambre de l'isoflurane.
   1. Après l'anesthésie, de placer le rat en décubitus dorsal sur une table d'opération 37 ° C-chauffé avec le masque de respiration relié au dispositif d'anesthésie, en utilisant de l'oxygène au réglage de 0,4 L / min et de l'isoflurane à 1,8%.
   2. Après le rasage de l'abdomen, désinfecter la zone rasée trois fois avec kodan Tinktur Forte (un désinfectant à base d'alcool).
   3. Couvrir le rat avec des tissus stériles, exposant que le champ d'opération rasée.
4. Effectuer électroporation in utero.
   1. Couper l'abdomen avec un scissor le long de la ligne blanche (~ 2 cm).
   2. Exposer les cornes utérines soigneusement avec un anneau pince.
   3. Prenez soin de garder la paroi de l'utérus humide avec réchauffé PBS stérile pendant toute la chirurgie.
   4. Injecter la solution d'ADN avec une aiguille de verre mince dans l'un des ventricule latéral des embryons.
   5. Placer l'électrode 7 mm autour de la tête de l'embryon. Pour atteindre une population de cellules de couches corticales supérieures, effectuer la IUE à E16 ²³ et positionner l'électrode positive sur l'hémisphère au-dessus du ventricule injecté avec une légère tendance dorsale / latérale. Pour cibler les cellules de l'hippocampe changer le placement de l'électrode positive vers le côté opposé à celui du ventricule latéral injecté avec ou légèrement en direction dorsale (Figure 1).
   6. Effectuer électroporation par cinq 50 impulsions ms à 55 V avec 950 sauts msec avec une onde carrée impulsion électroporateur.
   7. Épargner le premier embryon à la fin vaginale de chaque corne de l'utérus afin d'augmenter til les chances de survie de tous les embryons.
   8. Mettez les cornes de l'utérus de nouveau dans la mère rat.
   9. Stich la paroi abdominale avec un matériau de suture chirurgicale résorbable Vicryl.
   10. Fermer la peau avec le matériau de suture Vicryl ou avec des agrafes de suture.
   11. Placez la mère rat dans la cage de la maison et le garder au chaud pendant 2-3 heures.
   12. Tenez les seuls rats dans leur cage à domicile dans la salle de l'animalerie et nourrir ad libitum. Ils donnent naissance entre E22-24.
   13. Gardez les ratons avec leur mère pendant trois semaines et de les séparer ensuite par sexe.

2. Bioluminescence imagerie en direct de la réaction enzymatique de la luciférase

Cette méthode est utilisée pour analyser la position des cellules transfectées in utero. Co-électroporation ADNc luciférase de luciole est traduit en luciférase active, qui, lors de la métabolisation D-luciférine à oxyluciférine, émet un photon (figure 2 ). La luminescence qui en résulte peut être détectée dans les cerveaux de jeunes rats électroporées positifs dans un spectre IVIS jusqu'à l'âge d'environ 35 jours après la naissance (figure 4).

Dans la présente étude, le dosage de la luciférase et la bioluminescence imagerie a été réalisée à partir de P7. Ce point de temps a été choisie pour permettre la mère et les chiots de récupérer du stress de la naissance. Lorsque l'on travaille d'abord avec les petits à P0, la survie des petits a été durement touchée en ce que les chiots ont été retrouvés morts ou mangés par la mère.

Initialement, les ratons avec électroporation succès sont identifiés par une image 2D-bioluminescence avec un temps d'exposition de trois minutes. Par la suite, les chiots positifs sont utilisés pour créer des images 3D afin de préciser la localisation de la zone électroporation.

1. Diluer le sel de sodium de D-luciférine dans du PBS à une concentration de 15 mg / ml et le stériliser par filtration à travers un filtre à seringue stérile.
2. Peser les chiots.
3. Prenez le chiot dans une main avec l'abdomen sur le dessus et se détendre légèrement l'abdomen. Injecter 10 ul / g de poids corporel d'une solution de luciférine intrapéritonéale. Pour les plus grands et plus agiles, pré-anesthésier les chiots avec l'isoflurane dans la chambre d'induction avant d'injecter le luciférine.
4. Allumez l'afflux isoflurane du système de gaz d'anesthésie XGI-8 dans le spectre IVIS avec 3% d'isoflurane.
5. Mettez le museau de l'animal dans les cônes de nez de verre du système d'anesthésie.
6. Maintenir l'animal dans une position couchée jusqu'à ce qu'il se trouve dans une anesthésie profonde (2-3 min). Puis réduire l'afflux isoflurane à 1,5%.
7. Choisissez une mesure 2D-bioluminescence pour sélectionner chiots positives de toute la portée. Utilisez les paramètres suivants
   
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   1. Définir un CHECkmark sur la photographie à binning moyen et F / Stop à 8, l'appareil prend une photo d'en haut après le début de la mesure.
   2. Filtre d'excitation Set: bloc.
   3. Régler filtre d'émission: ouvert.
   4. Réglez Binning à moyen.
   5. Réglez F / Stop à 1.
   6. Réglez le niveau de l'étape A.
   7. Réglez la luminescence du temps d'exposition à 180 sec.
8. Pour la création d'images 3D afin de mieux quantifier la zone électroporation des chiots positifs, utiliser les paramètres suivants DLIT pour la luciférase de luciole.
   
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   1. Définir une coche sur la photographie, la caméra prend une photo d'en haut après le début de la mesure.
   2. Définir une coche sur la structure, la surface de l'animal est scanné par le SIIV avant la mesure de la bioluminescence.
   3. Usoi suivante filtres d'émission et les paramètres de temps d'exposition jusqu'à l'âge de deux semaines:
      filtre d'émission 1: 590 nm, temps d'exposition de 300 s
      filtre d'émission 2: 600 nm, temps d'exposition de 240 s
      filtre d'émission 3: 620 nm, temps d'exposition de 180 s
      filtre d'émission 4: 640 nm, temps d'exposition de 120 s
      Pour les rats âgés de plus de P20
      filtre d'émission 1: 600 nm, temps d'exposition de 300 s
      filtre d'émission 2: 620 nm, temps d'exposition de 300 s
      filtre d'émission 3: 640 nm, temps d'exposition de 300 s
      
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      En raison de la diminution de la puissance du signal dans les animaux plus âgés, le temps d'exposition est agrandie pour les trois meilleurs filtres d'émission.
   4. Réglez le niveau de l'étape B
   5. Réglez Binning à moyen.
   6. Réglez F / Stop à 1
9. Après la mesure, mar k les rats par un code earhole de les différencier les uns des autres et de les faire correspondre aux images SIIV direct imagerie
10. A la fin de la procédure de mesure, éteignez l'isoflurane afflux et maintenir le rat sur la plaque chauffée pendant quelques minutes avant de le remettre dans sa cage.

3. Analyse de bioluminescence Images

La génération d'images en 3D, des films en 3D et la quantification du volume de la source de signaux est effectué par le logiciel Living de l'image pré-installé sur la IVIS spectre.

1. Génération d'images 3D
   1. Tout d'abord, reconstruire une topographie de surface, donc régler le seuil entre 20-30%.
      
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      een 6 "src =" / files/ftp_upload/50146/50146screen6.jpg "/>
   2. Lancer DLIT reconstruction 3D avec un seuil d'image de 10% pour chaque longueur d'onde.
      
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   3. Créez des films 3D en utilisant le bouton animé dans la barre d'outils 3D.
   4. Choisissez des orientations différentes de l'image 3D, ainsi que des vues de zoom que des cadres clés et appuyez sur 'Enregistrer & #39; bouton, enregistrer le passage d'une position / orientation à l'autre.
      
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4. Essai de comportement

Tests de comportement a été réalisée afin de déterminer si des manipulations génétiques IUE médiation chez le rat peuvent initier effets à long terme qui persistent à l'âge adulte. Dans le présent cas particulier, l'effet de transitoire, unilatérale longueur DISC1 humaine corticale surexpression après IUE a été étudiée en testant locomotion dans un champ ouvert (DE), avec ou sans une faible dose d'amphétamine, comme un test spécifique pour liés à la dopamine comportement ^24. Dans une procédure similaire effectuée par Niwa et al. Chez la souris en utilisant IUE DISC1 effet de choc, les souris IUE mais pas les contrôles ont montré une hypersensibilitéà l'amphétamine ^18.

Les rats qui ont été in utero électroporation avec un vecteur surexprimant DISC1 ont eu lieu dans des conditions de laboratoire avec 12 h de lumière 7 heures-19 heures et ont été nourris ad libitum. A 3 mois, les rats ont subi des tests de comportement.

Pour la quantification de locomotion comme une visualisation des effets de l'amphétamine, un champ ouvert d'un système d'activité Tru balayage situé dans une chambre de sons et de lumière isolé a été utilisé. Ce système mesure le temps de la durée et la distance les mouvements d'animaux, le temps et la distance passées dans la marge ou au centre du champ, ainsi que l'élevage comportement ^25.

1. Le premier jour, l'essai après l'injection de solution saline
   1. Peser les animaux.
   2. Injecter par voie intrapéritonéale 1 ul / g de poids corporel d'une solution saline (PBS 1x).
   3. Juste après l'injection, mettre l'animal dans le champ ouvert et lancer la mesure du système TruScan. Record de 15 min und segmenter les données en 3 x 5 pièces min.
   4. Placez le dos de l'animal dans sa cage.
2. Deuxième jour, essai sur l'injection d'amphétamine
   1. Peser les animaux.
   2. Injecter par voie intrapéritonéale 1 ul / g de poids corporel d'un / ml de solution de 0,5 mg d'amphétamine.
   3. Juste après l'injection mettre l'animal dans le champ ouvert et commencer la mesure du système TruScan. Le registre pendant 15 min et subdiviser les données en trois parties de 5 x min.
   4. Retour à l'animal de sa cage.
3. Analyser la locomotion et le comportement élevage généré par un logiciel spécifique Tru Scan. Créer graphiques avec GraphPad (Prism) et calculer les statistiques par le logiciel SPSS Statistics.

Résultats

La figure 3 montre vivent mesures d'imagerie de trois ratons à P7 après l'injection de 150 mg de luciférine / kg de poids corporel. Les différences d'intensité de signal indiquant la variabilité dans l'efficacité de l'IUE sont visibles. Signaux de bioluminescence fortes ont été enregistrées jusqu'à P36 (Figure 4). Sur la figure 5, la possibilité de définir cortical (Figures 5A et 5C) et de l'hippocampe (Figures 5B et 5D) par électroporation imagerie par bioluminescence sont représentés. Corrélation du signal de bioluminescence (figure 7A) avec son signal de fluorescence après l'enlèvement du crâne (figure 7B) et les cellules GFP-électroporation correspondantes dans le cerveau cryosectioned (figure 8) à P14 sont représentés sur les figures 6-8. Noter, il n'y avait pas détection d'un signal de fluorescence dans des rats vivants à n'importe quel point dans le temps.

tente "> In vivo imagerie par bioluminescence permet discrimination approximative de différentes zones du cerveau électroporées en 2D (Figures 5A et 5B), qui est nettement améliorée grâce au programme de DLIT du logiciel IVIS spectre générant des images 3D (figures 5C et 5D). Dans les exemples représentés , électroporation du cortex préfrontal et l'hippocampe pouvait être distinguée. Il convient de noter que, bien que le but de l'électroporation de l'hippocampe, des cellules progénitrices de la corticale dorsale se trouvant de l'hippocampe peuvent également être touchés (Figure 7).

Rats unilatéralement in utero électroporation avec pCAX vecteur dans le cortex et la suite surexprimant longueur DISC1 humaine ont été étudiés à la fois spontanée et l'hyperactivité induite par l'amphétamine comme des adultes. Rats électroporation avec pCAX-DISC1 étaient hypersensibles à une faible dose d'amphétamine. Ces rats déplacés considérablement more après le traitement de l'amphétamine après l'injection de sérum physiologique, alors que les animaux témoins ne l'a pas (figure 10).

Figure 1. Système de mesure d'électrode pour A) et B électroporation cortex) électroporation hippocampique; vert = injecté à l'intérieur de l'ADN-Mix le ventricule.

Figure 2. réaction de la luciférase.

Figure 3. la mesure de la luminescence de rats P7 après l'injection de 150 mg / kg de poids corporel luciférine; temps d'exposition de 180 secondes; A) chez le rat avec des pas de signal de luminescence; B) rat avec un signal de bioluminescence faible, C) chez le rat avec un fort signal de luminescence.

Figure 4. Ligne du temps des mesures de bioluminescence consécutives de la même rat après injection de 150 mg / kg luciférine démontrant une grande fenêtre de temps où le succès IUE peut être détectée.

. Figure 5 Illustration des différences entre électroporation corticale et hippocampique à P7 A) et B) images 2D;. C) et D) des images en 3D, A) et C) de cortex; B) et D) de l'hippocampe.files/ftp_upload/50146/50146fig5highres.jpg "> Cliquez ici pour agrandir la figure.

Figure 6. Illustration de E16 électroporation de l'hippocampe d'un chiot de rat à P14 A) 2D image de bioluminescence B) Illustration 3D du signal bioluminescence C) disséqué cerveau avec bioluminescence signal D) cerveau avec la GFP signaux épi-fluorescence. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 7. Détail d'une image de fluorescence à partir d'une section de cryo 20 um de la même cerveau de rat P14 électroporation avec la GFP et la luciférase contenant le plasmidevecteur, noyaux coloration avec DAPI; CA1-3 = corne d'Ammon 1-3; DG = gyrus denté; FC = Fasciolarum cinereum.

Vidéo 1. Animation 3D d'un hippocampe électroporation rat à P14.

Figure 8. Amphétamine procédure de test: injection de solution saline premier jour avant le procès de 15 min, 24 heures plus tard amphétamine injection avant l'essai dans la chambre de plein champ.

Figure 9. test de l'amphétamine. Diagramme à barres montrant la distance parcourue (en cm) de l'animal enregistré par un système TrueScan plus de 15 min barres blanches = groupe de contrôle;. Barres grises = groupe surexprimant DISC1; groupe témoin n = 10; DISC1 groupe surexpression n = 11; ANOVA: Geno * p = 0,043 traitement, T-Test pour le sérum de temps total vs ns d'amphétamine = pas de Pcontrol importante = 0,172, pDISC1 = 0,001.

Discussion

Notre étude montre que IUE est adapté pour générer des rats adultes avec des neurones exprimant un transgène dans une zone désignée du cerveau et qui, à la suite de cette intervention, ces animaux présentent des changements de comportement indiquant la fonctionnalité de la manipulation effectuée. Dans cette étude, par exemple, le rat surexprimant DISC1 unilatéralement dans une petite partie du cortex préfrontal ont montré une hypersensibilité à l'amphétamine (figure 9).

Sélection des rats pour la réussite d'électroporation in vivo par imagerie par bioluminescence a été efficace dans le contrôle de la variabilité inhérente de la transfection de cellules IUE et a été appliquée pour générer des groupes avec une zone IUE homogène de faible variabilité inter-sujet pour les enquêtes ultérieures.

Dans cette étude, nous n'avons pas pu sélectionner chiots électroporation de la litière par détection de la fluorescence induite par GFP-co-électroporation chez l'animal nouveau-né, même quandugh en même temps et dans le même animal d'un signal de bioluminescence de la luciférase également co-électroporation n'a pu être détectée après l'injection luciférine (figure 6), et la GFP exprimant neurones étaient encore présents dans le cerveau à l'âge de six mois. Nous en concluons que, chez le rat, la réaction luciférase / luciférine est bien adapté pour différencier les animaux avec des cerveaux électroporées avec succès (Figure 3).

Le contrôle quantitatif de succès IUE se rapporte à la force du signal de bioluminescence qui est mesurée par les chiffres de photons à l'intérieur de la même durée d'exposition (figure 3) et correspond à l'activité enzymatique de la luciférase co-exprimés. Petits signaux de bioluminescence sont détectables par 100-200 chiffres de photons, et, à un rayonnement de ~ 1x10 ⁴ photons / sec / cm ² / spectacle stéradian 1000-2000 cellules GFP-taché à l'histologie dans le 6 mois cerveau de rat. Le disp signal le plus élevéétaient posées un éclat de jusqu'à ~ 5x10 ⁶ photons / sec / cm ² / stéradian et ~ 64 000 chefs d'accusation.

Dans la souche de rat Sprague Dawley utilisé, nous avons observé un affaiblissement du signal de bioluminescence longitudinalement avec l'âge et le signal a disparu au-delà de l'âge de P35 (Figure 4). À ce stade, nous ne savons pas si l'une ou l'autre transitoire, expression à base de vecteur plasmide de luciférase diminue, ou si le signal de bioluminescence affaiblit raison de l'augmentation massive du cerveau, ou les deux sont les causes pour le signal en voie de disparition. Pour le test fonctionnel présent dans les rats adultes, la sélection pour les études comportementales était simplement faite sur la base de l'emplacement du signal, mais pas par bioluminescence la force du signal.

Même si la surveillance de la bioluminescence quantitative 3D a permis la différenciation entre les différents domaines électroporation (figure 5), son exactitude a été limitée pour les cellules situées dans la dime de profondeurnsion du cerveau. figure 6 montre un exemple d'une électroporation de l'hippocampe où la mesure de la bioluminescence dans le 2D et le 3D image indique un bon positionnement de l'électroporation. Dans le cerveau post-mortem disséqué, un signal GFP-fluorescence a été détecté à environ la même position que le signal de bioluminescence, ce qui indique un ciblage correct de l'hippocampe. Mais histologie montre également que les cellules dans le cortex dorsal de l'hippocampe ont été la cible (Figure 7). Ceci indique que le test de bioluminescence est un outil utile pour détecter, chiots IUE positifs et aussi d'avoir une idée de la zone électroporation, mais, en fin de compte, l'imagerie ne peut pas remplacer l'autopsie histologie exactement localiser les cellules positivement ciblées.

Notre démonstration indique promesse pour l'application de la technologie IUE pour générer manipulations ciblées subtiles de régions corticales du cerveau ou de l'hippocampe pour simuler aberrances en cmigration ortical ou autres défauts qui peuvent influer sur le développement neurologique de l'animal adulte. Alors que l'électroporation bilatérale ²⁶ a l'avantage d'un effet probable plus grande sur le comportement, il est aussi plus la mortalité des embryons. Électroporation unilatérale a été choisie afin de comparer les deux hémisphères avec un comme un contrôle interne, ainsi que pour montrer que même manipulation IUE dans un unilatérale, petite région est suffisante pour changer les comportements. Changements IUE-induits de la connectivité ou de l'architecture entre les neurones peuvent donc être induits sans évoquer une lésion et le match requise de la région-à-être IUE manipulé avec le test de comportement approprié dépend de la question scientifique.

Dépannage

Taille de la portée réduite Il existe plusieurs suggestions concernant l'augmentation de la survie des petits IUE. Tout d'abord, l'utilisation de très minces tubes capillaires en verre lors de l'électroporation de manière à minimiser Lesio tissulairen est recommandé. Deuxièmement, ne pas électroporer le premier embryon à la fin vaginale de chaque corne de l'utérus: mort du premier-né embryon augmente les chances d'un abandon de toutes les autres embryons. Troisièmement, après la naissance, les rats mères tuent souvent partie de leur progéniture à cause du stress périnatal. Afin de réduire le stress supplémentaire, ne pas commencer par l'imagerie en temps réel juste après la naissance, mais d'attendre sept jours.

Détection GFP-fluorescence des chiots

Une semaine après la naissance, aucun signal de fluorescence, soit en utilisant la fluorescence binoculaire en direct l'imagerie microscopique ou l'imagerie de fluorescence avec le SIIV spectre (les modes d'épifluorescence et transfluorescence; GFP excitation / émission: 465/520 nm et 500/540 nm). Il est possible que les deux, la transmission limitée de courte longueur d'onde d'excitation et d'émission de lumière à travers les tissus comme le crâne et le bruit de fond élevé d'autofluorescence de la peau prévenir en utilisant la fluorescence sous la described conditions chez le rat. Comme le montre la figure 6, le signal de la luciférase dans l'animal vivant peut également être détectée dans le cerveau disséqué (sans crâne) et là, également un signal de fluorescence est détectable (Figure 6D).

La différenciation de la bioluminescence dans les zones du cerveau étroitement espacés

Même dans l'illustration 3D de l'emplacement de la zone de bioluminescence ne peut être prédit à 100%. En particulier les cellules au-dessus ou au-dessous de la zone prévue peuvent également être ciblés accidentellement et transfectées. La position exacte doit être contrôlée par l'autopsie (fluorescence) histologie (voir Figure 7).

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent name
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Invitrogen	14190-250	without calcium, without magnesium
D-luciferin, sodium salt	SynChem OHG, Germany	BC218	CAS number: 103404-75-7 substrate for firefly-luciferase
Fast Green FCF	Sigma Aldrich, USA	F7258-25G	CAS: 2353-45-9
D-Amphetamine	Sigma Aldrich, USA	A 5880	CAS: 51-63-8
kodan Tinktur forte	Schülke Mayr GmbH, Germany	104 005
Material / product
Glass capillaries	Sutter Instrument	Novato, California, USA	borosilicate glass O.D.:1 mm, I.D.: 0.78 mm
Needle Pipette Puller	David Kopf Instruments	Tujunga, California, USA
Tweezer electrode	Nepa Gene CO., LTD.	Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan	7 mm in diameter platinum disc electrodes (CUY650P7)
Surgical Scissors - sharp	Fine Science Tools	Heidelberg, Germany	Straight, 12 cm (14002-12)
Ring Forceps	Fine Science Tools	Heidelberg, Germany	2.2 mm ID, 3 mm OD (11021-12)
Square wave pulse electroporator (CUY21SC)	Nepa Gene CO., LTD.	Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan	(CUY21SC)
Vicryl surgical suture material	Ethicon	Norderstedt, Germany	3-0; 2 Ph. Eur;
Wound Clip Applicator	Fine Science Tools	Heidelberg, Germany	Reflex 9 mm (12032-09)
Syringe filter	VWR	Darmstadt, Germany	0.45 μm cellulose acetate
IVIS Spectrum	Caliper Life Science / PerkinElmer	Waltham, MassachusettsUSA
XGI-8 Gas Anesthesia System	PerkinElmer	Waltham, Massachuset tsUSA
Open-field	Coulbourn Instruments	Allentown, USA	(40 x 40 x 39 cm)
Tru Scan activity system	Coulbourn Instruments	Allentown, USA
Table of recipes Number Buffer name Content Comments 1 DNA-Mixture for DISC-1 overexpressing 1.5 μg/μl pCAX humanDISC-1, 0.5 μg/μl pCAX-luciferase, 10x PBS (10 %) Fast Green Dye (0,5 %) add H2O 100 μl of the mixture are enough for ~5 IUE 2 DNA-Mixure for control 0,75 μg/μl control shRNA1, 0,75 μg/μl control shRNA2, 0.5 μg/μl pCAX-luciferase, 0.5 μg/μl pCAGGS-GFP 10x PBS (10 %) Fast Green Dye (0,5 %) add H2O 100 μl of the mixure are enough for ~5 IUE 3 Fast green Dye 10 mg/ml Fast Green FCF in ddH2O 4 D-luciferin solution 15 mg/ml D-luciferin, sodium salt in PBS 5 Amphetamine solution 0.5 mg/ml D-Amphetamine in PBS