La protéine plate-forme de production complexe MultiBac à l'EMBL

Résumé

complexes de protéines catalysent les fonctions cellulaires essentielles. Caractérisation fonctionnelle et structurale détaillée de nombreux complexes essentielles nécessite la production recombinante. MultiBac est un système cellulaire baculovirus / insecte particulièrement adaptées pour l'expression de protéines eucaryotes et de leurs complexes. MultiBac a été mis en œuvre comme une plate-forme en libre accès, et les procédures d'exploitation normalisées développés afin de maximiser son utilité.

Résumé

La recherche en protéomique a révélé la complexité impressionnante de protéomes eucaryotes de détail sans précédent. Il est maintenant une notion communément admise que les protéines dans les cellules existent surtout pas comme des entités isolées, mais exercent leur activité biologique en association avec de nombreuses autres protéines, chez l'homme dix ou plus, formant des lignes d'assemblage dans la cellule pour la plupart, sinon toutes les fonctions vitales. ^{1 , 2} Connaissance de la fonction et de l'architecture de ces assemblages multiprotéiques nécessite leur disposition dans une qualité supérieure et en quantité suffisante pour une analyse détaillée. La rareté des nombreux complexes de protéines dans les cellules, en particulier chez les eucaryotes, interdit leur extraction à partir de sources indigènes, et nécessite la production recombinante. Le système de vecteur d'expression de baculovirus (BEVS) s'est avérée particulièrement utile pour produire des protéines eucaryotes, dont l'activité repose souvent sur le traitement post-traductionnelle que d'autres systèmes d'expression couramment utilisés peuvent souventpas en charge. ³ BEVS utiliser un baculovirus recombinant dans lequel le gène d'intérêt a été inséré à infecter des cultures de cellules d'insectes qui à leur tour produisent la protéine de choix. MultiBac est un BEVS qui a été particulièrement adaptée pour la production de complexes protéiques eucaryotes qui contiennent de nombreux sous-unités. ⁴ A condition sine qua non pour une production efficace de protéines et de leurs complexes sont des protocoles robustes pour toutes les étapes d'une expérience d'expression qui peut idéalement être mis en œuvre procédures d'utilisation normalisées (SOP) et suivie également par des utilisateurs non spécialistes avec une relative facilité. La plate-forme MultiBac au Laboratoire européen de biologie moléculaire (EMBL) utilise SOP pour toutes les étapes d'une expérience d'expression de complexes multi, à partir de l'insertion des gènes dans un génome baculoviral ingénierie optimisé pour les propriétés de production de protéines hétérologues à l'analyse à petite échelle de la protéine spécimens produits. ^5-8 La plate-formeest installé dans un mode libre accès à l'EMBL de Grenoble et a soutenu de nombreux scientifiques du monde universitaire et de l'industrie pour accélérer les projets de recherche complexes protéiques.

Introduction

L'activité biologique est contrôlé par des assemblages de protéines et d'autres biomolécules qui agissent de concert pour stimuler les fonctions cellulaires. Parmi les exemples notables comprennent les machines qui transcrit l'information héréditaire contenue dans l'ADN en ARN messager. Chez l'homme, plus de 100 protéines sont réunis dans un processus défini et réglementé pour transcrire les gènes, formant de grands complexes multi avec 10 et plusieurs sous-unités dont l'ARN polymérase II et les facteurs généraux de transcription tels que TFIID, TFIIH et autres. ⁹ D'autres exemples sont l' ribosome, constitué de plusieurs protéines et des molécules d'ARN, qui catalyse la synthèse des protéines, ou le complexe de pore nucléaire qui est responsable de la navette biomolécules à travers l'enveloppe nucléaire chez les eucaryotes. Une dissection architectural et biochimique détaillée de la quasi-totalité des machines multi dans la cellule est essentiel de comprendre leur fonction. L'élucidation de la structure de procaryotes et eukarribosomes yotic, par exemple, constituent des événements de cachet donnant un aperçu sans précédent dans la façon dont ces machines macromoléculaires exercent leurs fonctions désignées dans la cellule. ^10,11

Les ribosomes peut être obtenue en qualité et en quantité suffisante pour une étude détaillée de la purification de la matière endogène à partir de cellules en culture, en raison du fait que jusqu'à 30% de la masse cellulaire se compose de ribosomes. ARN polymérase II est déjà moins abondante par des ordres de grandeur, et plusieurs milliers de litres de culture de levure ont dû être traitées pour obtenir une vue atomique détaillée de ce complexe essentiel au cœur de la transcription. ¹² L'écrasante majorité des autres complexes essentiels sont toutefois présents dans des quantités beaucoup plus faibles dans les cellules natives, et ne peuvent donc pas être purifiés de manière adéquate à partir de sources d'origine. Pour rendre ces complexes accessibles à l'analyse structurale et fonctionnelle détaillée nécessite la production hétérologue en utilisant te recombinantchniques.

Production de protéines recombinantes a eu un impact majeur sur la recherche en sciences de la vie. De nombreuses protéines ont été produites par recombinaison, et leur structure et leur fonction disséqués à haute résolution. Programmes de génomique structurale ont profité de l'élucidation de ces génomes de nombreux organismes pour s'attaquer au répertoire de produits de gènes d'organismes entiers en mode haut débit (HT). Des milliers de structures de protéines ont ainsi été déterminés. À ce jour, le système le plus prolifique utilisée pour la production de protéines recombinantes a été E. coli, et de nombreux systèmes d'expression ont été développées et affinées au fil des ans pour la production hétérologue dans cet hôte. Les plasmides hébergeant une multitude de fonctionnalités pour permettre la production de protéines dans E. coli remplir catalogues entiers de fournisseurs commerciaux.

Toutefois, E. coli a certaines limites qui la rendent impropre à produire de nombreuses protéines eucaryotes et en pcomplexes protéiques articulaires avec plusieurs sous-unités. Par conséquent, la production de protéines dans des hôtes eucaryotes est devenu de plus en plus la méthode de choix au cours des dernières années. Un système particulièrement bien adapté pour produire des protéines eucaryotes est le système de vecteur d'expression de baculovirus (BEVS) qui s'appuie sur un baculovirus recombinant portant les gènes hétérologues pour infecter des cultures de cellules d'insectes cultivées en laboratoire. Le système MultiBac est un BEVS plus récemment mis au point qui est particulièrement adaptées pour la production de complexes protéiques eucaryotes avec de nombreux sous-unités (Figure 1). MultiBac a été introduite en 2004. ¹³ Depuis son introduction, MultiBac a été constamment affiné et rationalisé pour simplifier la gestion, améliorer la qualité de la protéine cible et généralement rendre le système accessible à des utilisateurs non spécialistes de la conception des procédures d'exploitation normalisées efficaces (SOP). ⁴ MultiBac a été mis en place dans de nombreux laboratoires du monde entier, en acAdemia et de l'industrie. A l'EMBL à Grenoble, les programmes d'accès transnationaux ont été mis en place par la Commission européenne pour fournir une formation spécialisée sur la plateforme MultiBac pour les scientifiques qui souhaitent utiliser ce système de production pour faire avancer leurs recherches. La structure et la fonction de nombreux complexes protéiques qui n'étaient jusque-là pas accessible a été élucidée à l'aide d'échantillons produits avec MultiBac. ⁴ Dans la suite, les étapes essentielles de la production MultiBac sont résumées dans les protocoles qu'ils sont en opération à l'installation MultiBac à l'EMBL de Grenoble.

Protocole

1. Tandem recombineering (TR) pour créer des constructions d'expression multigénique

1. Planification de la stratégie de co-expression. approche de conception pour insérer vos gènes d'intérêt en donneurs et accepteurs. Sous-modules physiologiques potentiels de votre complexe doivent être regroupés sur accepteurs et donneurs spécifiques. Utilisez module de multiplication composée de endonucléase Homing (HE) - paires BstXI de combiner des cassettes d'expression sur différents donateurs et des plasmides d'accepteurs ^7,8 Créer toutes les constructions pertinentes in silico et valider la stratégie complètement avant de procéder à des travaux expérimentaux.. Par exemple, des gènes d'intérêt doivent être vérifiés ne contiennent pas de SE ou d'autres sites de restriction et la présence de cadres de lecture ouverts (ORF correctes) doit être validée. Pensez à commander des gènes synthétiques optimisés pour les insectes usage des codons de la cellule et la structure secondaire de l'ARNm pour améliorer les niveaux de production de protéines ainsi que la suppression de toute exiHE sites à partir des gènes d'intérêt piquer. Pensez à placer des étiquettes de purification basé sur les données de la littérature sur N-ou flexibles ou exposés extrémités C-terminales des protéines de vos choix. Envisager d'appliquer des stratégies de polyprotéine qui visent à produire plusieurs sous-unités protéiques dans votre complexe si les quantités relatives de protéines individuelles doivent être contrôlés en raison de problèmes de stœchiométrie dans le complexe. ⁴ Préparez détaillées "How-To" documents (cahier de laboratoire électronique est recommandé) contenant toutes les mesures expérimentales prévus du projet menant à la construction multigénique complète (s). Créer des fichiers électroniques des plasmides fusionnés Cre-loxP par exemple en utilisant le logiciel Cre-ACEMBLER qui peut être téléchargé à partir de la page d'accueil Berger groupe ( multiexpression_technologies www.embl.fr/multibac/ / cre-acembler ).
2. Insérez vos gènes d'intérêt dans certains bailleurs de fonds etAccepteurs en utilisant des enzymes de restriction et la ligase, ou encore en utilisant des méthodes indépendantes de ligature en suivant des protocoles publiés ^5,6,14. Si vous avez accès à une manipulation de liquides poste de travail et si vous prévoyez un grand nombre de constructions doit être généré ( par exemple pour des approches combinatoires) considèrent l'utilisation de scripts robotique développés et mis en œuvre par le groupe Berger (Figure 2). ^14,15 Si une manipulation de liquides poste de travail n'est pas disponible, le mode manuel en utilisant microplaques permet l'insertion d'un gène dans un HT comme la mode.
3. Les contraintes imposées par la nécessité de contrôler la stoechiométrie des sous-unités exprimées peuvent se matérialiser. Dans le cas des niveaux d'expression déséquilibre stoechiométrique de sous-unités individuelles d'un complexe protéique, envisager d'appliquer des stratégies de la polyprotéine de conjoindre plusieurs sous-unités de votre complexe et une protéase spécifique (par exemple le tabac etch virus NIa protéase) au seul grand ORF espacés de sles sites protéolytiques particulières d'intervention. ^4,8 considérer co-exprimant un ou plusieurs polypeptides, avec des cassettes d'expression simples si vous avez un très grand complexe avec de nombreuses sous-unités et largement allant des poids moléculaires de sous-unités individuelles. Considérez co-exprimant plusieurs gènes codant pour la même protéine dans une polyprotéine ou plusieurs cassettes d'expression identiques si cette protéine est caractérisée par faible rendement de production. ^4,13
4. Validez toutes les constructions donneur et accepteur clonés par cartographie de restriction (éventuellement en haut débit) et le séquençage. Procéder à fusionner combinaisons donneur-accepteur par Cre-loxP recombinaison pour produire les constructions d'expression multigénique de choix. Valider plasmides de fusion accepteur-donneur purifiée par cartographie de restriction, utiliser des séquences électroniques créés par Cre-ACEMBLER ou des programmes similaires comme référence.
5. Stocker donateurs purifiés et validé, des accepteurs et des fusions donneur-accepteur à -20 ° C ou -80 ° C. Archive plasmids et leurs séquences (Microsoft Excel, Filemaker, autres) avec soin pour un usage ultérieur.

2. Multigénique Composite baculovirus production, l'amplification et le stockage

1. Intégrer les vecteurs de transfert de multigéniques le génome baculoviral MultiBac en se transformant en cellules DH10 hébergeant le génome viral et les fonctionnalités requises pour Tn7 transposition. Notez que le génome baculoviral MultiBac peut être préchargé avec des gènes d'intérêt particulier (YFP marqueur, accompagnateurs, etc) dans son propre site LoxP (conçu dans le génome distal du site de fixation Tn7) par une in vivo Cre réaction précédant Tn7 intégration. ¹³ Après Tn7 transposition, les cellules avec baculovirus composite contenant les gènes d'intérêt sont sélectionnés par criblage bleu / blanc (succès Tn7 résultats de transposition en perte d'α-complémentation de la β-galactosidase, par conséquent, les colonies ayant correct Tn7 transposition restent blanches sur sélectif uneplaques gar contenant X-gal) et le génome est préparé par lyse alcaline et de l'éthanol / précipitation à l'isopropanol. ^5,6
2. La transfection et la production de virus initial. Plaque de culture tissulaire à 6 puits lieu dans hotte stérile. De Sf21 culture de cellules d'insecte log-de phase, semence aliquotes de cellules dans les puits et transfectées par l'ajout du génome baculoviral purifiée et un réactif de transfection mélangés dans un milieu de culture tel que décrit. ⁶ récolte de virus initial après 48-60 heures en retirant les médias ( de haute qualité, faible titre virus V _0, typiquement de 3 ml par puits). Supplément milieux frais et essais pour la production de protéines (et, si un marqueur YFP est présent, par fluorescence) après encore 2-3 jours. ^6,7
3. Amplification du virus, faible MOI régime. Utilisez V ₀ virus d'infecter 25-50 ml de cellules en phase log (densité cellulaire <1x10 ⁶ cellules par ml) dans un petit (100-250 ml) Erlenmeyer shaker flacons agitéssecoueurs sur des plates-formes orbitales (Figure 3). Compter les cellules et diviser chaque h 24 jusqu'à ce que les cellules cessent de doublement (prolifération arrestation). Suivre un régime faible MOI (multiplicité d'infection à savoir le nombre de particules virales par cellule): Les cellules doivent doubler (au moins) une fois (MOI <1), sinon répéter l'expérience avec un petit volume de V ₀ ajouté. Normalement, 3 ml de V ₀ sont utilisés pour infecter 25 ml de cellules d'insecte Sf21 à une densité de 0.5x10 ⁶ cellules / ml. Cela est essentiel pour prévenir préjudiciable sur-amplification et l'auto-suppression de virus qui peut entraîner la perte des gènes hétérologues d'intérêt. Récolte V ₁ virus (25-50 ml) après 48-60 heures par granulation cellules et enlever le support contenant le virus. Supplément par des milieux frais et essai pour YFP et la production de protéines en éliminant les cellules 1x10 ⁶ toutes les 12 ou 24 heures, la granulation et la validation de la production de protéines et de signal de la protéine marqueur (YFP). ⁶ Amplifier virus (àV ₂₎ plus loin si des volumes plus importants d'expression visent à en infectant jusqu'à 400 ml de cellules dans 2 L shaker flacons avec V ₁ virus respect de ce qui précède bas régime MOI (cellules doivent doubler au moins une fois après l'infection par V _1). Rigoureusement tester la production de protéines et de signal de protéine de marquage pendant l'amplification afin d'éviter l'accumulation des virus défectifs ne contenant plus les gènes d'intérêt. Culots cellulaires d'utilisation ^5-7 accumulant à chaque amplifications étape déjà pour l'établissement de protocoles de purification pour le complexe de protéine d'intérêt exprimée.
4. Stockage BIIc du virus de la production. Nous vous recommandons fortement de stocker virus V ₂ comme le virus de la production en utilisant le BIIc (B aculovirus-i nfected i nsect c aunes) méthode, pour empêcher toute modification (par exemple la perte du gène d'intérêt) du virus recombinant et de préserver une forte expression niveaus ¹⁶ cellules infectées Pellet 24 heures après l'arrestation de prolifération est observée -. A ce stade les cellules contiennent des particules virales complètes, juste avant qu'ils seraient libérés (par bourgeonnement) dans les médias. Retirez les médias et des aliquotes de gel de le culot cellulaire dans de l'azote liquide et conserver indéfiniment. ^7,16

3. la production de protéines et de traitement en aval

1. Infectant les grandes cultures (R) et le suivi YFP. Utilisez V _1, V ₂ ou portions BIIc congelés pour infecter les grandes cultures cellulaires pour les cycles de production (typiquement 400 ml dans des flacons 2 L). Adhérer à bas régime MOI (régler le volume du virus utilisé pour l'infection tels que la culture infectée double au moins une fois). Agrandir volumes de culture infectés si nécessaire selon le nombre de flacons de se multiplier. Si protéine marqueur YFP est présent, retirer à intervalles cellules 1x10 ⁶ définies, granulés et lyse des cellules et de suivre l'évolution du signal YFP jusqu'à atteindre un plateau indintoxicantes production maximale de protéines recombinantes. YFP niveaux peuvent être mesurés dans un lecteur de plaques à puits norme 96 capable d'enregistrer des signaux de fluorescence (par exemple Tecan Spectrafluor). Récolte des cellules à ce stade. culots cellulaires de conserver à -20 ° C (à court terme) ou -80 ° C (à long terme).
2. La lyse des cellules et le fractionnement. Lyse des cellules par votre méthode préférée de choix, adaptés aux exigences de votre protéine (gel-dégel, ultrasons, presse française, et autres). ^5-7 cytosol Fractionner et noyaux et à vérifier la présence de vos protéines d'intérêt. Développer des protocoles de purification basé sur les résultats afin de simplifier la purification des protéines. Envisager d'appliquer les procédures de trempage pour extraire vos protéines de la fraction nucléaire dans des conditions de KCl élevés si vos protéines se trouvent dans le noyau. ^7,18
3. La purification des protéines (micro-échelle, à grande échelle). Notez que souvent de petits volumes (10 ou 25 ml) de culture cellulaire sont suFFICIENT pour obtenir des culots de cellules pour la purification de quantités substantielles de vos protéines d'intérêt en raison des niveaux généralement élevés ou très élevés production de protéines hétérologues dans les systèmes cellulaires baculovirus / insecte (souvent 10-100 mg de protéine par litre culture et plus). En conjonction avec micro-purification (plaques à puits multiples, les méthodes micro-pointes, système GE Healthcare ÄKTAmicro, d'autres), il est possible d'obtenir des données biochimiques et de l'activité et souvent aussi quantité suffisante de protéines et de complexes souhaités pour nanolitre échelle cristallisation à haut débit (HTX ). Envisager d'utiliser la purification par affinité de métal (Clonetech Takara TALON, résines Qiagen NiNTA métalliques chélateurs) et un oligo-histidine (6-10 résidus) tag sur les sous-unités exposées de votre protéines complexes pour faciliter la purification, en liaison avec l'échange d'ions et chromatographie d'exclusion de taille en petits volumes en utilisant par exemple le ÄKTAmicro ou une petite machine de purification de volume similaire (Figure 4 ). D'autres étapes de purification d'affinité et d'échange (IEX) étapes ion en plus de la purification d'affinité avec des étiquettes oligo-histidine ou d'autres balises (choisir de la TPS, MBP, le CBP, autres) peut et doit être considéré, selon les propriétés biochimiques des protéines des intérêts et des préférences individuelles. Considérez marquage plus d'une sous-unité avec des marqueurs d'affinité pour améliorer l'efficacité de purification. Concentrez vos complexes protéiques purifiés et établir des protocoles de stockage telles que le gel avec ou sans glycérine. Élaborer des critères de contrôle de qualité qui peuvent être appliquées en standard (tests d'activité, des tests biochimiques et biophysiques) pour évaluer les variations de lot à lot de vos protéines purifiées.

Résultats

Co-expression forte de protéines hétérologues obtenus par le système MultiBac est illustré à la figure 1d (sondes prises 48 heures après l'infection d'une culture de cellules en suspension). Les bandes de protéine surexprimée est clairement perceptible dans l'ensemble extrait cellulaire (SNP) et le lysat clarifié (SN). La qualité et la quantité de la matière protéique produite est souvent suffisante pour permettre la détermination de la structure des complexes de protéines, t...

Discussion

Vidéo instantanés sur les figures 2 et 3 illustrent l'ensemble du processus de production assistée par robot à partir d'ADNc d'expression multigénique construit tout le chemin à l'infection des cultures de cellules d'insectes pour la production de protéines. Nouveaux réactifs (plasmides et virus) et les protocoles robustes ont été développés pour permettre une conduite en s'appuyant sur SOP. L'ensemble du pipeline a été mis en œuvre comme une t...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bluo-Gal	Invitrogen	15519-028 (1 g)
Tetracycline	Euromedex	UT2965-B (25 g)	1,000X at 10 mg/ml
Kanamycine	Euromedex	EU0420 (25 g)	1,000X at 50 mg/ml
Gentamycine	SIGMA	G3632 (5 g)	1,000X at 10 mg/ml
IPTG	Euromedex	EU0008-B (5 g)	1,000X at 1M
Cre-recombinase	New England BioLabs	M0298
X-Treme GENE HP transfection reagent	Roche	06 366 236 001
Hyclone SFM4 Insect	Thermo Scientific	SH 30913.02
6-well plate Falcon	Dominique Dutscher	353046
2 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357507
5 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357543
10 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357551
25 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357535
50 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357550
50 ml tube Falcon	Dominique Dutscher	352070
15 ml tube Falcon	Dominique Dutscher	352096
1.8 ml cryotube Nunc	Dominique Dutscher	55005
100 ml shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211917
250 ml shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211918
500 ml shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211919
2 L shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211921
Certomat Orbital Shaker + plateau	Sartorius	4445110, 4445233
Liquid nitrogen tank dewar 35 L	Fisher Scientific	M76801
Biological Safety Cabinet Faster	Sodipro	FASV20000606
Optical Microscope	Zeiss	451207
Sf21 Insect cells
Hi5 Insect cells	Invitrogen	B855-02
Tecan freedom EVO running Evoware plus	TECAN
10 μl conductive tips (black),	TECAN	10 612 516
200 μl conductive tips (black)	TECAN	10 612 510
disposable trough for reagents, 100 ml	TECAN	10 613 049
twin.tec PCR plate 96, skirted	Eppendorf	0030 128.648
96 well V bottom, non sterile	BD falcon	353263
96 deepwell plate color natural, PP)	Fisher	M3752M
PS microplate, 96 well flat bottom	Greiner	655101
96 deepwell plate	Thermo scientific	AB-0932
24 well blocks RB	Qiagen	19583
DpnI restriction enzyme	NEB	R0176L	20 U/uL
NEBuffer 4 10X	NEB	B7004S
2X phusion mastermix HF	Finnzyme	ref F-531L
2X phusion mastermix GC	Finnzyme	ref F-532L
DGLB 1.5X	homemade		7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF
High DNA Mass Ladder for e-gel	Life Technologies	10496-016
Low DNA Mass Ladder for e-gel	Life Technologies	10068-013
E-gel 48 1% agarose GP	Life Technologies	G8008-01
Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit	Macherey Nagel	740 708.24
PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract	Macherey Nagel	740 707.2
Gotaq green master mix	Promega	M7113
T4 DNA polymerase, LIC-qualified	Novagen	70099-3
DTT 100 mM	homemade
Urea 2 M	homemade
EDTA 500 mM pH 8.0	Homemade
LB broth (Miller) 500 g	Athena ES	103