L'utilisation des puces à protéines de phase inversée (RPPA) Variation à explorer l'expression des protéines dans les cancers à cellules rénales individuels

Résumé

APPR permet l'expression de la protéine de centaines d'échantillons, imprimés sur des lames de nitrocellulose pour être interrogé simultanément, en utilisant des anticorps marqués par fluorescence. Cette technique a été appliquée pour étudier l'effet de l'hétérogénéité traitement de la toxicomanie au sein de cellules de carcinome rénal clair.

Résumé

Actuellement, il n'existe pas de traitement curatif pour le cancer métastatique rénal à cellules claires, la plus fréquente variante de la maladie. Un élément clé de cette résistance au traitement est pensé pour être la complexité moléculaire de la maladie ^1. Thérapie ciblée telle que l'inhibiteur de tyrosine kinase (TKI)-sunitinib ont été utilisés, mais seulement 40% des patients répondent, avec l'écrasante majorité de ces patients rechutent dans les 1 an ^2. En tant que tel la question de la résistance intrinsèque et acquise en rénaux de cellules de cancer est très pertinente ^3.

Afin d'étudier la résistance aux TKI, avec l'objectif ultime de développer des traitements efficaces et personnalisés, les tissus séquentielle après une période spécifique de la thérapie ciblée est nécessaire, une approche qui a fait ses preuves dans la leucémie myéloïde chronique ^4. Toutefois, l'application d'une telle stratégie dans le carcinome rénal est compliquée par le niveau élevé de both hétérogénéité inter-et intra-tumorale, ce qui est une caractéristique de carcinome à cellules rénales ^5,6 ainsi que d'autres tumeurs solides ^7. Intertumoral hétérogénéité due à des différences transcriptomiques et génétique est bien établie, même chez les patients avec une présentation similaire, le stade et le grade de la tumeur. En outre, il est clair qu'il ya un grand morphologique (intratumorale) l'hétérogénéité des RCC, qui est susceptible de représenter encore plus grande hétérogénéité moléculaire. La cartographie détaillée et la catégorisation des tumeurs RCC par l'analyse morphologique combiné et le classement Fuhrman permet de sélectionner des zones représentatives pour l'analyse protéomique.

L'analyse des protéines à base de RCC ⁸ est attrayant en raison de sa grande disponibilité dans les laboratoires de pathologie, mais son application peut être problématique en raison de la disponibilité limitée d'anticorps spécifiques ^9. En raison de la nature de dot blot des protéines de phase inversée Arrays (RPPA), la spécificité des anticorps doit be pré-validés, comme le contrôle de qualité strict de tels anticorps utilisés sont d'une importance primordiale. Malgré cette limitation, le format dot blot ne permettent la miniaturisation test, ce qui permet l'impression des centaines d'échantillons sur une lame de nitrocellulose seule. Diapositives imprimées peuvent ensuite être analysées d'une manière similaire à l'analyse de l'Ouest à l'utilisation des cibles des anticorps primaires spécifiques et marquées par fluorescence des anticorps secondaires, ce qui permet de multiplexage. L'expression différentielle des protéines dans tous les échantillons sur une lame peut alors être analysés simultanément en comparant le niveau relatif de la fluorescence d'une manière plus rentable et à haut débit.

Protocole

1. Identification de l'hétérogénéité tumorale morphologique et moléculaire

1. Les tumeurs retiré de -80 ° C congélateur et conservés sur de la glace sèche.
2. Diviser en sections de tumeurs environ 1 cm ^3. Mapper la position d'origine de chaque article par rapport à la tumeur et l'autre étiquette avec un nom unique. Conserver les échantillons au cryotubes individuelles à -80 ° C jusqu'à utilisation.
3. Échantillons Manteau en OCT et couper dans un cryostat à -22 ° C.
4. Les échantillons colorés par l'hématoxyline et éosine méthode de contre-coloration.
5. Analyse au microscope des coupes congelées afin de s'assurer qu'ils sont de nature ccRCC, tumeur viable et pour le classement (de bas grade, de haut grade ou mixte basse / haute qualité, difficile de différencier les grades Fuhrman 1 à 4 sur coupe congelée). Figure 1 a et b (H & E coloration de bas grade et de haut mixte).
6. Choisissez jusqu'à 4 échantillons de chaque région morphologiquement différente à l'intérieur de chaque tumeur pour l'extraction des protéines.

2. Extraction des protéines à partir des échantillons tumoraux

1. Couper l'échantillon de tumeur à partir de octobre
2. Lieu 50-75 mg de tissu en tubes de 2 ml avec 990 ul de tampon de lyse [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EGTA (pH 8,5), NaCl 150 mM] complété avec de l'aprotinine (Sigma A6279) (10 mg / ml), cocktail inhibiteur de phosphatase 2 (Sigma, P5716), cocktail inhibiteur de phosphatase 3 (Sigma, P0044) et un cocktail inhibiteur de la protéase (Roche, 11836153001).
3. Ajouter une seule bille d'acier 5 mm dans chaque tube et homogénéiser à 50 Hz pendant 5 min à deux reprises à l'aide d'un TissueLyser, de contrôler le niveau d'homogénéisation après chaque période de 5 min.
4. Transférer l'échantillon homogénéisé dans un nouveau tube de 2 ml avec pipette en laissant la bille d'acier derrière.
5. Ajouter 10 ul de Triton X-100 à chaque échantillon avant centrifugation à 13.000 xg pendant 30 min à 4 ° C.
6. Transfert surnageants de microtubes frais.
7. Déterminer la concentration de protéine en utilisant dosage BCA (Figure 2).
8. Normaliser les concentrations de protéines à 1 mg / ml.

3. Validation d'anticorps

1. Préparer les échantillons de protéines (extrait de lignées de cellules ou de tissus appropriés) pour western blot et exécuté sur un 10% gel SDS-PAGE.
2. Transférer les échantillons sur membrane de nitrocellulose nuit à 4 ° C.
3. Bloquer la membrane dans le tampon Odyssey Li-Cor de blocage (dilué dans du PBS 50:50) pendant 1 heure à température ambiante.
4. Diluer l'anticorps primaire dans le tampon Odyssey Li-Cor de blocage (dilué dans du PBS 50:50) chez les constructeurs de dilution recommandé typiquement de 1 à 1000.
5. Incuber la membrane dans les anticorps primaires pendant la nuit à 4 ° C.
6. Faire une hausse de 0,1% du PBS-Tween 20 (PBS-T, 1 ml de Tween 20 / 1L PBS).
7. Laver la membrane dans du PBS-T à la température ambiante pendant 5 min (x3).
8. Diluer marquée par fluorescence Anticorps secondaires dans le tampon de blocage Odyssey (dilué dans du PBS 50:50) 0,01% de SDS à 1:10,000 dilution (1,5 μl/15 ml).
9. Incuber la membrane dans l'enseignement secondaireanticorps à la température ambiante pendant 45 minutes en agitant doucement - il est important de protéger la membrane de la lumière jusqu'au moment où il a été définitivement balayé.
10. Laver la membrane dans du PBS-T à la température ambiante pendant 5 min (x3), en maintenant la membrane dans l'obscurité.
11. Laver la membrane dans du PBS à la température ambiante pendant 5 min (x3) pour supprimer Tween20 résiduelle, de nouveau en maintenant la membrane dans l'obscurité.
12. Lie membrane plane sur un morceau de papier filtre dans l'obscurité et laisser sécher à l'air - permettant la membrane sécher peut améliorer le signal et réduire le fond, mais le rendre inutilisable pour le décapage et re-poussé.
13. Numérisation de la membrane sur le scanner Odyssey LiCor. Gardez la membrane dans l'obscurité jusqu'à ce que qu'elle a été numérisée.
14. Seulement sélectionner des anticorps qui génèrent une seule bande prédominante au poids moléculaire correct. Figure 3 montre des exemples d'anticorps acceptables et inacceptables pour une utilisation avec RPPA.

4. RPPA Printing

1. Lysats protéiques ont été déposés sur des lames de verre recouvertes de nitrocellulose (Fastslides-Whatman) à l'aide d'un robot spotter MicroGrid II. Les diapositives utilisées contenait 2 tampons sur lesquels les échantillons ont été repérés. Chaque tampon a été repéré avec des échantillons identiques, dans ce cas, 100 échantillons. Autres formats disponibles sont: 1, 8 et 16 lames plaquettes. Plus le nombre de tampons plus le nombre d'échantillons qui peuvent être déposées sur chacun d'eux.
2. Une série de cinq 2-dilutions ont été faites à partir de chaque échantillon et chaque a ensuite été repéré en trois exemplaires (pour un total de 15 points par échantillon).

5. Détection des protéines RPPA

1. Diapositives humides dans le tampon de blocage LiCor excès (dilué dans du PBS 50:50). Incuber à température ambiante pendant 1 heure sur une plate-forme à bascule.
2. Préparer 800 ul d'anticorps primaires dans le tampon de blocage LiCor (dilué dans du PBS 50:50) aux concentrations désirées et garder sur la glace.
3. Monter les lames en soit (i) le clip frame puce uniqueou (ii) la "FastFrame 'quatre porte-lame baie de sorte que l'étanchéité est réalisée entre le tiroir et la chambre d'incubation.
4. Retirez le tampon résiduel des puits et ajouter 600 ul d'anticorps primaire aux puits respectifs.
5. Placer la lame et la chambre dans une boîte scellée humide et incuber sur agitateur nuit à 4 ° C.
6. Faire une hausse de 0,1% du PBS-Tween 20 (PBS-T, 100 pi de Tween 20/100 ml de PBS).
7. Retirer les lames de la chambre froide et retirer délicatement les anticorps primaires de chaque puits.
8. Ajouter 600 ul de PBS-T et laver les lames sur agitateur à température ambiante pendant 5 min (X3).
9. Préparer fluorescence des anticorps secondaires marqués par dilution dans du tampon de blocage Odyssey (dilué dans du PBS 50:50) 0,01% de SDS à 1:2000 dilution (1 pl / 2 ml) dans un premier temps.
10. Éliminer le tampon de puits et ajouter 600 ul par fluorescence des anticorps secondaires marqués dans les puits respectifs. Incuber Anticorps secondaires à la température ambiante pendant 45 minutes en agitant doucement - ilest important de protéger la membrane de la lumière jusqu'au moment où il a été finalement analysés.
11. Retirer Anticorps secondaires de lavage bien et brièvement (x3) dans 600 pi de PBS-T à la température ambiante. Retirer la lame de la porteuse, transférer dans un récipient approprié et laver à l'excès de PBS-T pendant 15 minutes, en gardant la membrane dans l'obscurité.
12. Retirer du PBS-T et de la membrane nouveau lavage avec du PBS à température ambiante pendant 15 min pour éliminer les résidus de Tween-20, à nouveau en gardant la membrane dans l'obscurité.
13. Sécher le Fastslide à 50 ° C four pendant 10 min, puis de numériser sur le scanner Odyssey Li-Cor. Gardez la lame dans l'obscurité jusqu'à ce qu'il ait été numérisés.
14. Numériser la diapositive à 680 nm et / ou 800 nm en fonction de l'anticorps secondaire / anticorps utilisés. Pour deux couleurs de détection utilisez toujours fortement adsorbés croix Anticorps secondaires afin de minimiser la réactivité croisée. Une sélection rigoureuse des anticorps primaires et secondaires est nécessaire pour deux couleurs de détection. Il est primordial de sélection desespèces hôtes différentes (par exemple lapin et la souris) pour les deux anticorps primaires. Ceci permet de discrimination anti-lapin anti-souris et des anticorps secondaires qui sont marqués avec un colorant avec des spectres d'émission faciles à distinguer.
15. Les fichiers images sont enregistrés en tant que fichiers TIFF.. Figure 4 (image de fichiers numérisés).

6. Analyse des données

1. Lancez le logiciel MicroVigene (VigeneTech, Carlisle, MA, USA).
2. Ouvrez fichier image. Tiff contenant l'analyse de la diapositive RPPA.
3. Sélectionnez un fichier modèle prédéfini qui aura une grille de superposer sur l'image de la diapositive RPPA.
4. Cliquez sur Définir régions d'intérêt (ROI) bouton pour ouvrir la grille.
5. Placez la grille sur les taches RPPA. Figure 6a (image de la grille sur l'image).
6. Cliquez sur le bouton Sélectionner tout pour mettre en évidence tout le ROI.
7. Cliquez sur Rechercher tout. MicroVigene sera autommatiquement trouver le ROI, de trouver les endroits, il faut soustraire le fond, enlever la poussière et de quantifier les taches.
8. Cliquez sur le bouton Curve Voir Dilution pour faire apparaître les résultats pour tous les échantillons sur la diapositive RPPA.
9. Cliquez sur Enregistrer les données de dilution.
10. Comme chaque échantillon est imprimé sur les 5 points de dilution en triple chacune, il ya 15 points à analyser, ce qui réduit le risque d'erreurs et améliore la qualité de l'ajustement de la courbe. MicroVigene produit une logistique à 4 paramètres-log modèle "Supercurve" algorithme (figure 6b), qui intègre tous les points pour produire une courbe sigmoïde de l'antigène-anticorps cinétique de liaison. L'hypothèse est que les mêmes anticorps-antigène cinétique de liaison se déroule à chaque point d'échantillonnage, même dans les différents échantillons, ce qui en prenant toutes les taches sur un tableau pour ajuster une courbe de réponse commune peut augmenter la confiance de la ferrure de ^10,11 courbe
    Y = un + ((ba) / (1 + e (c * d-ln (x)))
    où x est la dilution facteur et Y est l'intensité du signal.
    Les échantillons peuvent être analysés relativement à l'aide de la valeur y0, ce qui dans notre analyse correspond à la valeur y au milieu des valeurs de x après la cartographie celles sur le supercurve.
11. Exportez les données dans Microsoft Excel et l'intrigue y0 comme dans la Figure 7.
12. Variance intra-tumorale de protéines a été calculé séparément pour les patients traités et non traités traités dans un cadre ANOVA. Distributions de variance combinant les données de toutes les protéines analysées ont été comparées par un test de Mann-Whitney (MWT). Variations intra-tumorales de différentes protéines ont été comparées par un test F pour lesquels les hypothèses de normalité et d'homoscédasticité ont eu lieu respectivement évaluées à l'aide des Lillefours et des tests Fligner; taux de fausses découvertes (FDR) de correction a été appliquée ^12. L'expression différentielle des protéines entre les échantillons de patients traités et non traités a été testé pour chaque protéine à l'aide de Student-test où la normalité et l'homoscédasticité hypothèses ont été atteints, sinon MWT a été effectué; FDR a été appliqué sur les valeurs du test t et MWT combinés ^12. Signification de l'expression protéique et la variance de corrélation de Pearson pour les protéines ont été estimées en utilisant une approche standard [référence R] et FDR appliquée ^12.

Résultats

Un exemple d'une lame numérisée RPPA peut être vu dans la figure 4 (i) à la fois 680 et 800 voies indiquées nm. Séparer les images de longueur d'onde, la figure 4 (ii) permet à chaque patin de la diapositive à analyser APPR et expression de la protéine individuelle déterminée Figure 4 (iii). Comme on peut le voir à la figure 4 (iii) l'expression de protéines individuelles dans les différents échantillons est unique avec Gelsol...

Discussion

La méthode présentée ici RPPA représente une alternative à haut débit pour la technique de transfert de débit largement utilisé, mais relativement faible ouest de l'analyse des protéines. La méthode permet à des centaines d'échantillons à être semi-quantitativement analysées et comparées simultanément permettant une comparaison directe des protéines clés à travers une large sélection de lignées cellulaires et des échantillons de tissus. Multiplexer avec les espèces différentes d'anti...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue
aprotinine	Sigma	A6279
cocktail inhibiteur de phosphatase 2	Sigma	P5726
cocktail inhibiteur de phosphatase 3	Sigma	P0044
cocktail d'inhibiteurs de protéase	Roche	11836153001
Triton X-100	Triton X-	T8787
Li-Cor tampon de blocage Odyssey	Li-Cor	927-40000
TissueLyser	Qiagen	85600
MicroGrid II robotique spotter	Biorobotique
FastFrame «quatre porte-diapositive baie	Whatman	10486001
Faites glisser FAST - 2-Pad	Whatman	10485317
IRDye 680LT de chèvre anti-IgG de souris	Licor	926-68020
IRDye 800CW de chèvre anti-IgG de lapin	Licor	926-32211