Préparation des liposomes de géant pour l'imagerie et de patch-clamp électrophysiologie

Résumé

La reconstitution de protéines membranaires fonctionnelles dans des liposomes géants de composition définie est une approche puissante lorsqu'elle est combinée avec l'électrophysiologie patch-clamp. Cependant, la production de liposome géant conventionnel peut être incompatible avec la stabilité des protéines. Nous décrivons les protocoles de production de liposomes géants de lipides purs ou des petits liposomes contenant des canaux ioniques.

Résumé

La reconstitution des canaux ioniques dans les membranes lipidiques chimiquement définis pour l'enregistrement électrophysiologique a été une technique puissante pour identifier et d'explorer la fonction de ces protéines importantes. Cependant, les préparations classiques, tels que les bicouches planaires, limiter les manipulations et expérimentations qui peuvent être effectuées sur le canal reconstitué et son environnement membranaire. La structure cellulaire plus comme des liposomes géants permet des expériences de patch-clamp traditionnels sans pour autant sacrifier le contrôle de l'environnement lipidique.

Électroformation est un moyen efficace pour produire des liposomes géants> 10 um de diamètre, qui repose sur l'application de la tension alternative d'un mince film lipidique ordonnée déposée sur une surface d'électrode. Toutefois, depuis le protocole classique appelle les lipides à déposer à partir de solvants organiques, il n'est pas compatible avec les protéines membranaires moins robustes comme les canaux ioniques et doit être modifié. Récemment, protocols ont été développés pour électroforme liposomes géants de petits liposomes partiellement déshydratés, que nous avons adapté à des liposomes contenant des protéines dans notre laboratoire.

Nous présentons ici l'arrière-plan, de l'équipement, les techniques et les pièges de électroformation de liposomes géants de petites dispersions de liposomes. Nous commençons avec le protocole classique, qui doivent être maîtrisées avant de tenter les protocoles les plus difficiles qui suivent. Nous démontrons le processus de déshydratation partielle contrôlée de petits liposomes en utilisant équilibre vapeur avec des solutions salines saturées. Enfin, nous démontrons le processus de électroformation lui-même. Nous allons décrire l'équipement simple et peu coûteuse qui peut être fait en interne pour produire des liposomes de haute qualité, et de décrire l'inspection visuelle de la préparation à chaque étape afin d'assurer les meilleurs résultats.

Introduction

Liposomes géants (souvent appelés vésicules unilamellaires géantes, ou GUVS) ont principalement été utilisées pour étudier la physique et la chimie physique de bicouches lipidiques, y compris les études de déformation bicouche, la coexistence de phase latérale ("rafts"), la fusion de la membrane, etc ^1-4. Elles ont une structure cellulaire grossière comme: coque sphérique de la membrane entourant un intérieur aqueux qui peut facilement être fait différent de celui du tampon aqueux environnant. Ils sont, par définition, ≈ 1-100 m de diamètre, de sorte qu'ils peuvent être visualisés en utilisant une variété de méthodes de microscopie optique. Ils peuvent être fabriqués en utilisant des gradients osmotiques tendue ou la tension appliquée mécaniquement, de sorte que même si généralement doux, leurs propriétés peuvent être manipulées pour une manipulation aisée. En particulier, le contrôle de la "rigidité" du liposome, il est facile de former des plaques "liposome-inscrits" ou excisés pour l'électrophysiologie. Dans le passé, la reconstitution des canaux ioniques a été en grande partie réalisée en plan lipidique bilayers. Maintenant, la capacité à former des plaques de liposomes géants et utiliser le carquois considérable d'outils développés pour l'électrophysiologie classique (microscopie à fluorescence, micropipette aspiration, perfusion rapide et un contrôle de la température, etc) rend liposomes géants de plus en plus attrayant pour les études de reconstitution ^5,6.

Liposomes géants ont été faites par de nombreuses stratégies. En effet, les liposomes géants forment spontanément par un processus de gonflement lors d'un film lipidique séché est réhydraté ^4,7,8. Le désir de préparer plus rapidement plus, les liposomes plus uniformes conduit les chercheurs à d'autres approches, au premier rang desquels électroformation ^1,9. Électroformation s'appuie également sur l'hydratation d'un film lipidique séché, mais accélère le processus par l'application d'un champ électrique oscillant à travers le film lipidique. Le champ est appliqué au moyen de deux électrodes, soit des fils de platine ou de l'indium-étain (ITO) des lames de verre recouvertes, séparés par de l'eau outampon et sur laquelle les lipides sont déposées. En accélérant le gonflement des liposomes, on obtient un rendement plus élevé des grands liposomes. Ainsi, électroformation est devenue la méthode par défaut pour produire des liposomes géants ^4.

Le mécanisme de électroformation n'est pas entièrement comprise, et la plupart des protocoles sont développés de manière empirique (par exemple ^10,11). Néanmoins, nous pouvons en apprendre un peu plus sur ce à quoi s'attendre en tenant compte de la théorie et des résultats empiriques. Il est largement admis que électroformation se produit en conduisant flux électro-osmotique de tampon entre les bicouches lipidiques individuels empilés dans le film lipidique déposé ^10,11. Couplage électrostatique aux fluctuations thermiques des bicouches lipidiques est probablement aussi impliquée ^12. Ces hypothèses prédisent qualitativement limites supérieures de la fréquence du champ électrique et de la force qui peut être utilisé ^10,12. En particulier, il est prévu que les solutions à haute conductivité ( ie solutions salines physiologiques) réduisent les forces électrohydrodynamiques qui peut engager la électroformation liposome ^12. Taux d'écoulement électro-osmotique diminuent généralement avec l'augmentation de la concentration en sel et sont fréquemment atteint un sommet à une certaine fréquence d'oscillation du champ électrique (par exemple, bien que dans une géométrie différente, Green et al. ^13). Ainsi, les intensités de champ supérieures et des fréquences plus élevées sont raisonnables pour des solutions à haute conductivité, dans les limites de ^10.

Toutefois, les protéines membranaires sont susceptibles d'être incompatible avec la méthode habituelle de dépôt de lipides sur des électrodes pour la procédure electroswelling, notamment dans les solvants organiques qui sont ensuite évaporés pour laisser un film lipidique mince. Il ya deux voies principales de contourner cette difficulté: pour incorporer des protéines après la formation du liposome géant, ou d'adapter la manière dont les lipides sont déposés. Notre approche s'appuie sur d'autres ^5,11 à déposer les lipides et reconstitutiontuait une protéine de la membrane ainsi que d'une suspension de petites ou grandes "protéoliposomes". Nous décrivons le processus long et plus difficile de produire des protéoliposomes de protéines et de lipides purifiés ailleurs (Collins et Gordon, en révision). Nous décrivons ici le protocole en l'absence de toute protéine, mais il est le même lorsque la protéine est constituée, nous incluons les résultats montrant que protéoliposomes contenant le canal TRPV1 ion peuvent être transformés en GUVs et utilisés pour patch-clamp électrophysiologie. Dans toute approche électroformation, une inspection visuelle de l'échantillon de lipides au cours du processus de dépôt lipidique est essentielle au succès.

Notre approche peut être pertinent au-delà de l'application spécialisée pour la reconstitution du canal ionique. Dans le même temps depuis que nous avons mis au point ce protocole, et maintenant, il a également été montré comment la façon dont les lipides sont déposés sur des électrodes pour électroformation affecte l'hétérogénéité compositionnelle des GUVs en résultent. Bayk¹⁴ Al-Caglar et al. ont montré que GUVs liposomes formés à partir soigneusement déshydratés ont un 2,5 fois plus faible variation de la température de transition de miscibilité de GUVs formés à partir de mélanges de divers phospholipides et de cholestérol. Leurs travaux indiquent que les lipides, et en particulier le cholestérol, peut précipiter à partir du mélange de lipides déposés lors de solvants organiques, ce qui entraîne une grande variation spatiale dans la composition du film lipidique déposé. Ceci est particulièrement important pour les études sur le comportement de phase de membrane lipidique, mais peut aussi être critique aux expériences quantitatives sur le fonctionnement des canaux ioniques. Baykal-Caglar et al 's. Protocole est similaire, mais pas identique à la nôtre, et les lecteurs sont encouragés à étudier aussi.

Ce protocole (voir l'aperçu, figure 1) est l'un des nombreux qui pourrait être utilisé. Dans succès de électroformation de principe dépend du mélange de lipides, de l'hydratation, de la température, d'autres solutés (en particulier des ions), et deBien entendu la tension et la fréquence utilisée dans la formation. Comme électroformation devient mieux comprise, nous nous attendons à affiner notre protocole plus.

Enfin, il ya souvent une courbe d'apprentissage abrupte dans galvanoplastie liposomes géants. Nous suggérons la maîtrise du protocole classique (articles 1 et 4, et, si nécessaire, la section 5) avant d'apprendre à déposer lipides à partir de suspensions de liposomes (articles 2-5).

Protocole

1. Dépôt de lipides parmi les solvants organiques: protocole classique

1. Éliminer les lipides de stockage à -20 ° C ou -80 ° C, réchauffer à température ambiante. Attention: les lipides sont très hygroscopiques, et beaucoup sont sensibles à l'oxygène. Couvrir lipides dans l'argon sec ou gaz azote et à toutes les étapes de minimiser l'exposition à l'air.
2. Si nécessaire, suspendre les lipides dans le chloroforme ou le cyclohexane à mg / ml 1-10; noter que les concentrations indiquées par le fabricant sont généralement nominale seulement ATTENTION: Porter des gants appropriés et d'autres équipements de protection individuelle lors de l'utilisation de solvants organiques.. Retirez le PPE rapidement si solvant est déversé sur eux, comme la plupart des matériaux sont encore perméables à ces solvants et ils ne fournissent qu'une protection temporaire.
3. Nettoyez les deux côtés de deux 25 37,5 mm ITO lames de verre enduites x avec de l'éthanol
4. Mélanger les lipides pour atteindre les ratios molaires souhaités. Pour chaque 1 cm ² de surface de l'ITO coulisse à revêtir avec la lèvreid, mélange ~ 15-20 mg de lipides. Par exemple, si les deux 25 x 37,5 diapositives mm devaient être entièrement recouvert, nous aurions utilisent généralement 30 ul de 10 mg / mélange lipidique ml. Remarque: ajouter 0,1% en moles Texas Red-DPPE pour l'imagerie de fluorescence, et voir ci-dessous met en garde les colorants fluorescents.
5. Vérifiez que le côté enduit ITO des lames de verre est orientée vers le haut par la mesure de la résistance de surface avec un ohmmètre ou un multimètre.
6. Aspirer les lipides dans un solvant résistant à la seringue. Attention: Pas de colles ou de matières plastiques, autres que PTFE, doivent communiquer avec le solvant organique.
7. Avec l'aiguille de la seringue n'est pas tout à fait de toucher la surface d'ITO, appliquer doucement le lipide déplacer l'aiguille et d'autre de la glissière. Couvrez la surface de manière aussi uniforme, à la recherche d'un «éclat Rainbow" sur la surface du verre.
8. Placer les lames rapidement sous <1 Torr (1 mmHg) vide pendant 0,5-1 heures pour éliminer toute trace de solvant. Relâcher vide avec un gaz inerte.
9. Appliquer un joint de silicone, avec unefine couche de graisse à vide de silicone sur les deux côtés. Laisser au moins 5 mm de la lame exposée non recouverte d'un côté de la glissière.
10. Procéder immédiatement à la section 4.

2. Petit Préparation des liposomes pour déshydratation contrôlée

1. Préparer le mélange de lipides que dans les étapes 1.1 à 1.4.
2. Sécher les lipides en utilisant un courant d'argon ou de l'azote gazeux dans un tube de culture de diamètre de 10-15 mm. Pour les petites quantités de lipides, ≤ 0,5 mg, le film qui en résulte peut être hydraté directement après l'avoir placé sous vide pendant 0,5-1 heures pour éliminer le solvant résiduel, passez à l'étape 2.5. De plus grandes quantités de lipides ont tendance à piéger les solvants organiques en un gel épais, même sous vide, et sont mieux préparés par lyophilisation; voir les étapes 2.3-4.
3. Suspendre le film lipidique séché dans le cyclohexane, le couvercle à l'Argon et sceller avec un bouchon, placer le tube dans un bloc froid et le gel à -80 ° C pendant 1 heure minimum.
4. Placer le bloc froid et de l'échantillon de lipide dans un système de videcapable d'atteindre 100 mTorr. Appliquer le vide, il sera «décrochage» à environ 1 Torr comme sublimes solvant de congé. Une fois solvant est complètement enlevé (~ 1 heure) vide descend en dessous de ce niveau. Relâchez vide avec un gaz inerte et sceller le tube ou hydrate immédiatement.
5. Alors que les lipides sont sous vide, tampon d'hydratation Degas utilise vide et barbotage ^15-17.
6. Hydrater les lipides en utilisant un tampon dégazée à une concentration finale 1-10 mg / ml. Autoriser les lipides pour hydrater doucement. Après 30 min-1 heure, vortex pour briser les mottes restantes. Attendre une 0,5-1 heures supplémentaires pour permettre une hydratation complète. Utiliser un osmoticant, tels que le sorbitol ou le saccharose jusqu'à 200 mm, pour éviter la déshydratation complète dans les étapes ci-dessous.
7. Préparer 100-200 liposomes nm de diamètre par extrusion. Consultez le protocole d'extrusion du fabricant pour plus de détails. Notez que le tampon doit avoir moins de ~ mM force ionique 25 ou protocoles spéciaux de tension électroformation seront nécessaires dans la section 4.

3.Dépôt de lipides par déshydratation contrôlée de petits liposomes

1. Attention: Notre protocole nécessite lipides pour être placés dans l'équilibre vapeur avec des solutions salines saturées pendant de nombreuses heures. Nous vous recommandons vivement d'effectuer le protocole dans une atmosphère de gaz inerte, en utilisant une boîte à gants ou un endroit similaire.
2. Attention: Si la préparation des échantillons contenant des protéines, éviter la déshydratation complète. Hydratez l'atmosphère dans une enceinte avec un gobelet d'eau tiède, ou un humidificateur à base d'ultrasons. Utilisation d'un hygromètre pour assurer qu'il ya au moins 30% d'humidité relative. Utilisez le sorbitol ou le saccharose dans le petit tampon liposome comme une précaution supplémentaire pour éviter la déshydratation totale.
3. Préparer une solution de sel saturée d'humidité relative approprié. humidité cible dépend de l'osmolarité de la préparation de vésicules. Pour les préparations avec osmolarité physiologique, utiliser 30-45% d'humidité relative, tandis que de faibles préparations de vésicules d'osmolarité peuvent être suffisamment déshydratééquilibre avec 75-90% d'humidité relative (voir aussi tableau 1).
4. Mettez la solution saturée de sel et l'excès de sel dans un récipient hermétiquement scellé avec une tablette intérieure. Contenants d'aliments commerciaux pour le yogourt et granola fonctionnent très bien. Remplacer le plateau après le remplissage, et assurez-vous fluide est de 5-10 mm en dessous de la tablette.
5. Nettoyer les lames recouvertes d'ITO de l'article 1. Utilisez le multimètre pour déterminer de quel côté est conducteur, et d'étiqueter le côté non-conducteur avec le nom de l'échantillon.
6. Graisser légèrement deux côtés de l'(USP classe VI) joint en silicone (s) avec un ou plusieurs trous.
7. Placez le côté conducteur de diapositives sur le banc, et appliquer le joint silicone (s) à chaque diapositive à laquelle lipidique sera appliqué, s'assurer qu'il ya au moins 5 mm de lame exposée à une extrémité pour se connecter à l'appareil de électroformation. Lisser le joint d'étanchéité pour assurer une bonne étanchéité.
8. Diluer la préparation de vésicules dans un tampon pauvre en sel iso-osmotique à ~ 2.1 mg / ml. Nous constatons que concentr supérieurtions produisent des résultats médiocres.
9. Appliquer lipidique à la diapositive en gouttes ul 1-10. Gouttes plus petites produisent généralement de meilleurs résultats.
10. Placer la lame sur le plateau intérieur au-dessus de la solution de sel saturée et sceller hermétiquement le récipient. Laisser à température ambiante pendant 3 heures à O / N. Le récipient peut être placé à 4 ° C, mais il faut noter que, pour certains sels, l'humidité relative dépend fortement de la température, et que le froid va augmenter le temps d'équilibration.
11. Le film qui en résulte peut avoir un léger éclat d'arc-en pour lui, mais en tout cas devrait apparaître presque desséché. Solutions de départ très osmotiques peuvent être impossibles à sécher complètement à un film lipidique, ce qui n'affectera pas les résultats.

4. Électroformation de liposomes géants

1. films lipidiques, en particulier ceux formés à partir des liposomes déshydratés, sont facilement délogés. soigneusement hydrate chaque puits en plaçant une aiguille de seringue 27 sur le bord du joint et l'application d'un tampon lentement. Tampons peuventinclure l'eau, ≤ 200 mM de saccharose, ≤ 1 M sorbitol et ≤ 5 HEPES. Solution de sel de plus de 10 mM peut exiger de rechange protocoles de tension électroformation. Débordement chaque joint et par environ 10%.
2. Remarque: une fois que les lipides sont hydratés, procéder rapidement à travers les étapes restantes, depuis films lipidiques commencent à se décoller immédiatement. Le rendement et la taille sont maximisés si électroformation commence rapidement.
3. Dans un mouvement lisse, appliquer une deuxième lame ITO, face conductrice dans, vers le haut de la garniture. Assurez-vous d'avoir au moins 5 mm de débord extérieur de la zone du joint et en face de la première porte à faux. Appuyez doucement pour assurer une bonne étanchéité.
4. Nettoyez les deux surplombs à l'éthanol et de vérifier que les côtés face à la garniture sont conductrices avec votre multimètre.
5. La chambre peut encore être fixée avec du parafilm ou des pinces à ressort de traction légères, si désiré.
6. Branchez la chambre de électroformation à une source de tension en obtenant des barres en aluminium ou en cuivre, "EMI gasket mousse ", ou bande conductrice adhésive aux surfaces conductrices des deux diapositives. Nous employons la mousse joint EMI. plans pour un gabarit et le collier sont illustrés à la figure 5.
7. Vérifiez qu'il n'ya pas de court-circuit électrique entre les contacts, et que les contacts se connectent correctement aux surfaces d'ITO, en utilisant le multimètre.
8. Chauffer la chambre à 10 ° C supérieure à la température de fusion le plus élevé de l'un des lipides présents, par exemple pour la DPPC, de la chaleur à 52 ° C au minimum, de 10 ° C supérieure à la température de fusion de la chaîne de 42 ° C.
9. Pour tampons faible teneur en sel, appliquer une onde sinusoïdale 10 Hz, ~ 0,7 V _RMS pour chaque millimètre écart entre les deux surfaces revêtues d'ITO, pour 60-90 min. Pour tampons élevées de sel, d'autres protocoles de tension devraient être utilisés (voir références).

5. Imagerie et dépannage

1. Image du liposome en utilisant un microscope inversé équipé d'un cube de filtre pour la rhodamine ou Texas colorants rouges. Le liposome doit être de forme sphérique,majoritairement unilamellaires à l'oeil, et exempt de défauts tels que les "cordes" pendait au liposome.
2. Si les liposomes sont trop petites, utilisez moins de lipides.
3. S'il ya beaucoup de défauts ou quelques liposomes, cela peut être dû à des lipides en phase de gel. Envisager de relever la température de électroformation.
4. Si peu ou pas de liposomes géants formées à partir de tous les petits liposomes déshydratés, de réduire la force osmotique du tampon de liposomes, ou augmenter la force osmotique du tampon de électroformation. Un appel d'un tampon dans la solution tampon interstitielle concentré peut provoquer une délamination du film lipidique déposé.
5. Si le rendement de la vésicule, la qualité ou la taille sont pauvres, et tu inclus sels ou tampons de pH dans les électroformation ou liposome tampons, envisager des protocoles de tension électroformation alternatives. Par exemple, Pott, et al. ^11, recommander un protocole en trois étapes en utilisant une onde sinusoïdale de 500 Hz, augmentant la tension de 50-1,300 Vpp / m en 30 min, maintien pendant 90 mn, l'n diminuant la fréquence de 50 Hz sur 30 à 60 min. Platinum ou titane électrodes peuvent être nécessaires dans ce cas, mais cela ne modifie pas substantiellement le protocole.

Résultats

Dans nos exemples, nous préparons des liposomes à partir d'un mélange d'environ 55% mol POPC (1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-phosphocholine), 15% mol POPS (1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-phosphoserine , 30% mol de cholestérol, et de 0,1% en moles Texas Red-étiqueté 1,2-dipalmitoyl-sn-phosphoéthanolamine (TxR-DPPE). Cette composition a été choisi comme environ représentant des dorsales lipides ganglions de la racine ^18. Nous constatons que 15% molaires chargé...

Discussion

Électroformation de liposomes géants s'est développé en une technique souple compatible avec divers lipides, des préparations et des tampons. Un contrôle minutieux du processus de dépôt de lipides est plus critique pour le succès. Nous avons présenté des outils simples pour rendre dépôt contrôlé de lipides provenant de petites préparations de liposomes un processus simple. L'humidité relative est essentielle à la bonne déshydratation des liposomes initiaux, et la valeur optimale varie avec la ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital Multimeter	Agilent Technologies, www.agilent.com	U1232A or similar	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
	Fluke	117 or 177	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
Function Generator	Agilent Technologies, www.agilent.com	33210A or similar	Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load
ITO coated glass slides	Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com	CB-90IN-S107 or similar	Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm
Temperature controller	Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com	CNi3233 or similar
Hygrometer	Extech, Nashua, NH, www.extech.com	445815
Silicone rubber sheet	McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com	87315K64	Use USP Grade VI silicone for its high purity
EMI gasket	Laird Technologies www.lairdtech.com	4202-PA-51H-01800 or similar	Distributed by Mouser www.mouser.com
TxR-DHPE	Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com	T1395MP	Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable.
POPC	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com	850457P or 850457C	Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C)
POPS	Avanti Polar Lipids	840034P/C
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667