Près de tomographie optique de projection infrarouge pour l'évaluation de la distribution de masse β-cellulaire en recherche sur le diabète

Résumé

Nous décrivons l'adaptation de la tomographie optique de projection (OPT) ¹ À l'imagerie dans le proche infrarouge, et la mise en œuvre d'un certain nombre d'outils informatiques. Ces protocoles permettent l'évaluation des β du pancréas masse des cellules (BCM) chez les grands spécimens, d'augmenter la capacité de la technique multicanal et augmenter la qualité des données OPT.

Résumé

En adaptant OPT pour inclure la capacité de formation d'image dans le proche infrarouge (NIR) du spectre, on illustre ici la possibilité d'organes d'image agrandie de tissu pancréatique, tels que le pancréas de rat, et à augmenter le nombre de canaux (types cellulaires) qui peut être étudiée dans un échantillon unique. En outre, nous décrivons la mise en œuvre d'un certain nombre d'outils informatiques qui fournissent: positionnement 1 / précision (dans notre cas, le pancréas) un spécimen du centre de masse (COM) à l'axe de rotation (AR) ^2; 2 algorithmes / améliorées pour poste -alignement de réglage qui empêche les distorsions géométriques lors de la reconstruction tomographique ² et 3 / un protocole d'égalisation pour augmenter l'intensité de rapports signal sur bruit dans des déterminations fondées sur BCM OPT ^3. En outre, nous décrivons un porte-échantillon qui minimise le risque pour les mouvements involontaires de l'échantillon lors de l'acquisition. Ensemble, ces protocoles permettent l'évaluation de la distribution BCM et OTHcaractéristiques euh, à effectuer tout le volume du pancréas intact ou d'autres organes (par exemple, dans les études sur la transplantation d'îlots), avec une résolution allant jusqu'au niveau des îlots de Langerhans. individuels

Introduction

Le productrices d'insuline des cellules β sont essentiels pour la capacité du corps à contrôler l'homéostasie du glucose sanguin. Par conséquent, l'évaluation de la distribution BCM pancréas sont indispensables pour de nombreux domaines de recherche sur le diabète pré-clinique. Dans les évaluations de régimes thérapeutiques, par exemple, l'impact de l'ablation génique ciblée sur la différenciation des cellules endocrines ou des études d'étiologie du diabète dans des modèles rongeurs de la maladie dépendent souvent de telles analyses. Traditionnellement, ce type d'évaluation se sont appuyés sur fastidieuses démarches stéréologiques qui sont difficiles à réaliser en raison de la taille et la complexité constitution anatomique du pancréas. La plupart des approches d'imagerie haute résolution à l'heure actuelle (en général, optique), ne fournissent pas de profondeur de pénétration suffisante pour permettre l'imagerie du pancréas entier chez les rongeurs. A l'inverse, des méthodes d'imagerie qui ne sont pas limités par leur profondeur de pénétration (typiquement nucléaire) fournir à faible résolution pour résoudre la distribution BCM plein et sont entravéspar le manque d'agents de contraste suffisants ^4,5.

Tomographie optique de projection est une modalité d'imagerie 3D qui permet des évaluations à haute résolution d'échantillons biomédicaux sur la mm à l'échelle ⁶ cm. Par la présente, des informations sur la position dans l'espace et le volume de l'insuline individu exprimant des îlots de Langerhans peut être extrait à travers le volume du pancréas chez les souris normales et ^3,7-10 diabétique. L'objectif de la présente étude consiste à renforcer la capacité de cette technique pour l'évaluation de la β-cellules pancréatiques; leur répartition endogène, lorsqu'ils sont greffés dans d'autres tissus, leur relation avec les constituants du pancréas (tels que l'infiltration types de cellules) et dans les grandes préparations pancréatiques qu'auparavant.

La proximité de la tomographie optique de projection infrarouge (NIR-OPT) de configuration

Dans le dessous de protocoles, d'un scanner basé sur la TPO en place d'original décrit par Sharpe ¹ et al, adapté pour l'imagerie dans l'infrarouge proche est décrit et utilisé. Pour l'évaluation de canal unique du pancréas de la souris (par exemple de BCM), le SkyScan 3001 (Bioptonics) scanner peut être utilisé.

Lampe à halogénure métallique qui fournit de l'énergie d'excitation plus élevée qu'une lampe à arc au mercure à des longueurs d'onde 650 nm au-dessus, fournit la lumière d'excitation. La lumière est transmise à travers un guide de lumière liquide. Une combinaison de fluorochromes utiles et des filtres passe-bande pour NIR imagerie par fluorescence et la séparation des canaux est représenté sur la figure 3. La lumière émise est détectée avec une caméra CCD rétro-éclairé, avec un rendement quantique élevé dans le spectre proche infrarouge. Le balayage OPT est automatisé à l'aide d'une plate-forme LabVIEW qui contrôle la caméra et moteur pas à pas. Pour soutenir les échantillons de la taille de pancréas de rat intact, un miroir d'argent revêtu protégé et une cuvette large est utilisé. Enfin, un porte-échantillon qui élimine les indésirables movemen verticalests de l'échantillon pendant le balayage a été conçu.

Protocole

1. Préparation des échantillons et de numérisation

1.1 Préparation des échantillons

La procédure suivante est réalisée essentiellement comme décrit précédemment ^7.

1. Récolter le pancréas. Utilisez PBS glacé pour éviter la dégradation protéolytique.
2. Fixer le tissu en PFA à 4% dans du PBS sur la glace pendant 2-3 h. Assurez-vous que les lobes sont "étalés" lors de la fixation. Cela facilitera l'identification des repères anatomiques après reconstruction.
3. Laver à l'excès de PBS pendant 30 min.
4. Déshydrater le pancréas par étapes dans le méthanol (33, 66%, 100%), 15 min / étape. Cela permet de minimiser la formation de bulles lors du blanchiment (voir étape 5) et empêche la destruction des cellules au cours de congélation-décongélation (voir l'étape 7).
5. Incuber le tissu fraîchement préparée dans du MeOH: H ₂ O _2: DMSO blanchiment tampon dans un rapport de 02:01:03 à température ambiante pendant 24 h à étancher fluorescence tissu endogène. Pour les plus grands échantillons, l'échange de nouvelles bleaching tampon et incuber pendant une autre heure 24.
6. Laver dans du MeOH en excès, ON.
7. Congélation-décongélation pendant au moins 5 cycles de -80 ° C - RT pour faciliter la pénétration des anticorps.
8. Réhydrater par étapes vers TBST (33, 66%, 100%), 15 min / étape.
9. Bloquer dans TBST avec 10% de sérum (de préférence de la même espèce dans laquelle l'anticorps secondaire a été généré), 5% de DMSO et Naaz 0,01% pour les 12-24 h à la température ambiante
10. Incuber avec des anticorps primaires dans un tampon bloquant pendant 48 heures, à la température ambiante, de prolonger à 72 h pour les grands échantillons (anticorps utilisés ici sont répertoriés dans le tableau des réactifs).
11. Laver dans du TBST excès, ON.
12. Incuber avec fluorescence des anticorps secondaires conjugués pendant 48 heures, à la température ambiante, de prolonger à 72 h pour les grands échantillons.
13. Laver dans du TBST excès, ON.

1,2

La procédure suivante décrit comment monter l'échantillon dans de l'agarose et le fixer au porte-échantillon faits sur mesure (voir Figure 7) Avant OPT balayage.

1. Séparer les lobes spléniques, gastriques et duodénaux selon la figure 3A dans Hörnblad et al ^3. La relation entre les lobes est en outre précisé dans Hörnblad et al ^11.
2. Préparer 1,5% (p / v) d'agarose à faible température de fusion de dH ₂ O, filtre, laisser refroidir à 37 ° C et rincer le tissu dans dH ₂ O pour laver la lessive et éliminer les bulles d'agarose avant-encastrement sur ​​glace.
3. Découper un bloc d'agarose renfermant l'échantillon et laisser un espacement ~ 1 cm entre l'échantillon et la base de l'agarose. Couper des arêtes vives (≤ 90 °) du bloc d'agarose afin de réduire la diffusion de lumière.
4. Déshydrater l'échantillon pas à pas dans le MeOH (33, 66%, 100%), ce qui permet d'équilibrer le temps entre chaque étape. Lorsque l'échantillon coule il est considéré comme étant équilibrée.
5. Effacer l'échantillon dans une solution 1:2 d'alcool benzylique: Benzyl Benzoate (BABB) jusqu'à ce qu'il devienne transparent. Échange BABB solution et incuber pendant encore 12 heures.
6. Positionner l'échantillon effacée dans le porte-échantillon et le fixer par l'insertion, 2 aiguilles à travers l'entretoise d'agarose par des trous percés dans les brides du support.
7. Placer l'échantillon dans le scanner et le plonger dans une cuvette remplie de compensation BABB solution. Lorsque l'on compare une série de pancréas même grossissement doit être utilisé pour toutes les analyses. Le grossissement doit être optimisé pour le plus grand échantillon de la série.

1.3 Positionnement de l'échantillon à l'AR

Le protocole suivant décrit la procédure à positionner avec précision un échantillon en utilisant l'algorithme COM-AR. Cette procédure n'est applicable que lorsque le retour sur investissement inclut le spécimen. Pour une description détaillée des algorithmes, s'il vous plaît voir Cheddad et al ^2.

1. Acquérir des images de l'échantillon en deux positions de roboth l'anatomie et de canaux de signaux. La position ₁ à 0 ° (associée à l'axe X), présentant la plus grande zone de projection, et de la position ₂ à 90 ° (associé à l'axe Z). Nous utilisons le canal de GFP de visualiser l'anatomie.
2. Appliquer l'espérance-maximisation (EM) sur les images d'anatomie au seuil du retour sur investissement.
3. Calculer les points COM (abscisses) des images binaires obtenues à l'étape 2 à la fois pour le 0 ° et 90 ° des projections.
4. Superposer une ligne verticale passant par le point COM identifié calculé à l'étape 3 sur le 0 ° et 90 ° des images de la chaîne du signal.
5. Utiliser les images acquises à l'étape 4 comme références pour déplacer l'échantillon de telle sorte que la ligne médiane du champ de vision passe par les points trouvés COM de l'échantillon.

1.4 Numérisation

1. Réglez le temps d'exposition pour obtenir le meilleur rapport signal sur bruit possible sans saturationTing toutes les zones des images de projection. Répétez l'opération pour tous les canaux à scanner.
2. Sélectionner le jeu de filtres pour le premier canal de fluorescence à numériser. Les émissions des fluorophores λ courts peuvent exciter des fluorophores avec plus λ et provoquer ainsi photoblanchiment. Pour minimiser ce problème, scannez le fluorophore avec λ la plus longue première excitation.
3. Ouvrir l'obturateur pour illuminer l'échantillon et collecter le signal de fluorescence au-dessus de 360 ​​°, la rotation de l'échantillon le long de l'axe vertical pour chaque canal. L'angle de pas utilisée pour la configuration NIR-OPT est de 0,9 ° et pour le scanner 3001 Bioptonics 0,45 °.
4. Sélectionnez le filtre approprié pour le canal suivant et procéder comme ci-dessus.

2. Traitement informatique et de la reconstruction

2.1 Détection de désalignement post-acquisition et de correction (Une valeur de mise au point)

En tomographie à projection, il est en général nécessaired'attribuer une valeur post-alignement sur les projections pour affiner la position des images le long de l'axe de rotation avant la reconstruction. Toutefois, une petite aberration dans l'angle de la caméra vers l'axe optique peut provoquer la non-uniforme de valeurs-sur la longueur de l'échantillon et donc induire des distorsions géométriques. Pour éviter ces distorsions, une méthode de calcul pour trouver le précise et unifiée post-alignement valeur (valeur A) dans le spécimen peut être appliquée ^2.

1. Utiliser une transformée de Fourier discrète pour diviser une projection du signal spécifique à 0 ° et 180 ° en 8 blocs de pixels de hauteur et calculer le décalage le long de l'axe x (la valeur A) entre chaque bloc.
2. Appliquer une régression des moindres carrés linéaire pour aider à calculer l'angle θ ', qui décrit la pente de l'axe des x-décalage le long de la longueur de l'échantillon, et de trouver un point central de rotation.
3. Corriger les défauts d'alignement lors de la numérisation par rotation tous les projections θ '/ 2 autour du point central de rotation.

2.2 Contraste égalisation adaptative limitée histogramme (CLAHE)

Pour faciliter la détection et la segmentation des objets (îlots) présentant des signaux très faibles, qui sont à risque d'être «seuillée sur" lors de la reconstruction et / ou de segmentation pour des évaluations quantitatives, un algorithme CLAHE peut être appliqué sur les images de projection. L'opération est effectuée avec CLAHE deux transformations importantes d'intensité:

1. Le contraste local est estimé et égalisé à l'intérieur des blocs ne se chevauchant pas dans l'image de projection.
2. Les intensités sont ensuite normalisés sur les régions frontalières entre les blocs par interpolation bilinéaire.

Le nom de contraste limitée se réfère à la limite clip, qui est réglé pour éviter Pixel saturation de l'image. Dans ce protocole, le MATLAB intégré dans la fonction "adapthisteq» a été utilisée et appliquée par défaut avec le c limite lèvre de 0,01 et une taille de carreau de 256. Notez la taille des carreaux optimal doit être testée empiriquement et peut varier en fonction de l'échantillon analysé. Plus de détails sur l'algorithme et des exemples peuvent être trouvés dans Hörnblad et al ^3.

Remarque: Les étapes énumérées ci-dessus (y compris traitement de calcul COM-AR, réglage Une valeur et CLAHE, voir 1,3-2,2) sont construits sur des algorithmes standard et sont exécutées dans MATLAB (The Mathworks).

2,3 reconstruction tomographique et iso-surface de rendu

1. L'utilisation d'un rétroprojection filtrée algorithme, les images corrigées et normalisées peuvent maintenant être reconstruit avec compensation de désalignement unifiée et exigence minimale pour l'optimisation de la gamme dynamique. Dans ce protocole, toutes les reconstructions sont réalisées en utilisant la méthode de projection arrière filtrée disponible dans le logiciel NRecon (Skyscan), version 1.6.8 (= "_blank"> Http://www.skyscan.be/products/downloads.htm). Remarque, le grossissement d'un objet imagé dépend de sa distance par rapport au point focal de la lentille à moins géométrie du faisceau parallèle est mis en œuvre dans l'installation d'imagerie. Par conséquent, lors de l'importation d'un ensemble de données de projection pour le logiciel NRecon il est important d'inclure le bon objet à distance de la source (mm) et le sens de rotation du scanner (pour le compteur d'entrée "cc" aiguilles d'une montre et dans le sens horaire pour l'entrée "cw") dans l'accompagnement log, pour éviter les artefacts faisceau conique induites lors de la reconstruction.
2. Pour visualiser et de quantifier l'empilement des sections virtuelles obtenues, générer 3D iso-surfaces à l'aide du logiciel de traitement d'image approprié tel que Imaris ou Volocity.

D'isolement des îlots murins et procédures de transplantation ont été effectuées à Traitement de la recherche sur le diabète Institut cellulaire préclinique et Core Model translationnelle en vertu de protocoles examinés et approuvés par l'Université de Miami des soins aux animaux et du Comité utilisation. Le comité d'éthique pour la recherche sur les animaux, nord de la Suède, a approuvé toutes les autres expériences impliquant des animaux.

Résultats

Dans le présent rapport, nous décrivons un protocole pour l'extraction et le traitement informatique des données BCM dans les pancréas (rongeurs et d'autres tissus) à l'aide NIR-OPT (Figure 1). Comme l'illustre la figure 2, autofluorescense tissu de spécimen du pancréas est comme prévu nettement diminué dans le spectre NIR. Cela conduit à une augmentation significative de la moyenne du signal à bruit (S: N) pour l'évaluation de l'insuline des îlots de Langerhans marqués. Par les adaptations de l'OPT à l'imagerie dans la partie proche infrarouge du spectre, comme décrit ici, au moins trois canaux spécifiques peuvent être visualisées avec suffisamment S: rapport N pour permettre l'évaluation des types d'anticorps cellulaires marqués dans tout le volume du pancréas de souris avec distinct séparation des canaux (voir Figure 3 et 4). Appliquée à l'imagerie des processus diabétogène et / ou évaluations BCM en général, la technique permet donc la visualisation et la quantification desdomaines d'insuline positifs par rapport à environnant et / ou d'interagir types de cellules (voir figure 4). De telles évaluations sont grâce à la profondeur de pénétration tissulaire accrue obtenue dans le proche infrarouge possible d'effectuer des spécimens beaucoup plus grandes que par le passé, y compris le pancréas de rat, qui est 3-5 fois plus grand que son homologue de la souris (voir figure 5). Indépendamment du fait que des longueurs d'onde visibles ou NIR sont utilisés, la mise en œuvre de CLAHE peut faciliter considérablement OPT évaluations fondées sur des BCM au cours des différentes conditions génétiques et physiologiques en augmentant la sensibilité de détection de la technique (voir Figure 6). Un plan pour le porte-échantillon est développé montre la figure 7.

Figure 1. Organigramme illustrant les étapes essentielles pour OPT analyses basées sur des BCM dans le murine du pancréas. Le temps nécessaire pour évaluer un pancréas de souris typique est 13-14 jours. La majorité du temps est consommé pendant le traitement des tissus et la coloration immunohistochimique (10 jours), la compensation des tissus nécessite environ 2 jours, alors que la longueur de la numérisation dépend du temps d'exposition nécessaire (normalement environ 1 heure). Le traitement ultérieur calcul s'effectue en général dans une journée. Notez que le protocole de coloration relativement long est idéal pour le traitement par lots de plus grandes quantités de spécimens.

Figure 2. Rapport signal sur bruit pour les évaluations de la BCM à différentes longueurs d'onde. Un lobe du pancréas de souris duodénal, colorées pour l'insuline et d'un cocktail d'anticorps conjugués au fluorochrome secondaire (Alexa 488, 594, 680 et750), a été utilisée pour déterminer S: N élevés à différentes longueurs d'onde. Les images montrent le châssis, première projection pour chaque canal de signal. B, graphique illustrant la moyenne S: N pour chaque canal de signal. Les rapports ont été déterminés comme l'intensité moyenne des îlots (sur la base de 215 îlots), divisée par l'intensité de fond (la fluorescence tissu endogène à partir du tissu exocrine). C, S Graphique montrant: N élevés pour les îlots individuels dans chaque canal normalisé à l'indice composé S: S obtenus pour le canal Alexa 594. Une analyse de la variance manière a été utilisé pour les analyses statistiques. Les seuils de signification indiqués correspondent à ** p <0,01. La barre d'échelle en (A) correspond à 1 mm. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure3. Séparation des canaux. A, anticorps secondaires conjugués avec des colorants AlexaFluor répertoriés dans le tableau ont été immobilisés séparément sur ​​proteinG-sépharose perles. B, les billes fluorescentes ont été ensuite incorporé à différents niveaux dans un fantôme d'agarose et imagé en utilisant des filtres indiqués.

Figure 4. OPT imagerie multicanal basé en recherche sur le diabète. A, OPT base iso-surface reconstruction d'un pancréas (12 semaines, le lobe duodénal) du diabétique non obèse (NOD) modèle de diabète de type 1. Le spécimen est coloré d'insuline (îlots β-cellules, pseudo couleur bleue); muscle lisse α-actine (vaisseaux sanguins, rouge) et CD3 (infiltration de lymphocytes T, vert). Les anticorps secondaires correspondants étaient utilisés; Cy3, IRDye-680 et DyeLight-750 respectivement. Laencarts (A'-A ''') montrent les canaux de signaux individuels. B, image OPT (blow up vue) d'un lobe de foie de souris (lateralis lobe sinistres) greffé avec des îlots syngéniques et imagé avec NIR-OPT deux semaines suivant la transplantation. Les îlots d'insuline exprimant pseuodocolored sont en bleu et le muscle lisse α-actine vaisseaux positifs sont en rouge. Cette approche permet l'évaluation de la distribution de greffe d'îlots au sein du réseau vasculaire. Barres d'échelle correspond à 1 mm.

Figure 5. NIR-OPT facilite la visualisation des grands spécimens. A, Iso-surface de rendu de la distribution BCM dans un pancréas de rat à partir du modèle Zucker gras diabète de type 2 (lobe splénique à 9 mois), ce qui illustre la possibilité de spécimen image sur le rat l'échelle du pancréas par NIR-OPT. Tel que déterminépar cette technique, le lobe est affiché ~ 6 fois plus grande (v / v) que son homologue de souris et abrite 10139 insuline des îlots de Langerhans exprimant dont β-cellule de volume représente 1,32% du volume total lobulaire. B, coupe tomographique correspondant à la ligne en pointillés dans (A) ce qui montre que tous les îlots de fond du tissu est détectée. C, Iso-surface de rendu de la distribution BCM dans un pancréas de souris (lobe splénique à 8 semaines) s'affiche comme une référence de taille. Le lobe affiché abrite 2490 îlots d'insuline exprimant dont β-cellule de volume représente 0,89% du volume total lobulaire. Le pancréas sont colorées avec GP anti-insuline suivie par Alexa594 conjugué anticorps de chèvre anti-GP (souris) et 680 IRDye âne conjugué anti-GP (rat) anticorps respectivement. Les spécimens (AC) sont représentés à l'échelle et la barre d'échelle en (C) correspond à 2 mm.

Figure 6. CLAHE facilite la détection d'îlots dans le pancréas de souris par imagerie OPT. AC, Représentant iso-surface des images OPT rendus d'un C57Bl / 6 pancréas de souris (lobe splénique à 8 semaines) marqué à l'insuline. Iso-surface reconstructions d'images OPT ont été réalisées avant (A, vert pseudo couleur) et après le protocole a été appliqué CLAHE (B, pseudo couleur rouge). C, superposition des données non normalisées dans (A) et les données traitées en CLAHE (B). C'-C ", Représentant superposition fort grossissement des non-normalisés (A) et CLAHE transformés (B) images. Comme l'a montré la présence de" rouge "îlots seulement, le script CLAHE facilite la détection du signal de petite et basse îlots d'intensité. Dans l'exemple actuel le spécimen représenté (après traitement CLAHE) abritait 2419 îlots avec un volume de 1,74 mm ³ (Les chiffres sont fondés sur les données correspondantes de projection non transformés a 1057 îlots wie un volume de 1,77 mm ^3). D et E, Exemple de données de commande (D) et le modèle de la souris ob / ob diabète de type 2 ¹² (E) à 6 mois de mise en œuvre du protocole CLAHE. Notez l'augmentation massive générale de la taille des îlots dans le pancréas ob / ob (E). Dans (D) et (E) le contour du pancréas (gris) est basée sur le signal d'autofluorescence de tissu. La barre d'échelle en C est de 500 um en AC. La barre d'échelle en C »correspond à 200 um C 'et C''. Barre d'échelle en E correspond à 1 mm (D) et (E). Images à (AC) sont adaptés de Hörnblad et al ³ et ont été générées à l'aide de la 3001 Bioptonics scanner.

Figure 7. Porte-échantillons pour la fixation d'échantillons OPT. L'échantillon est fixé par l'insertion d'aiguilles à travers l'entretoise d'agarose par des trous pré-percés dans les brides. Le support est articulé sur le moteur pas à pas par l'intermédiaire d'unpuissant aimant situé à sa base. Cette configuration omet l'utilisation de colles instables et empêche les mouvements indésirables de l'échantillon pendant le balayage.

Discussion

Les techniques décrites pour OPT imagerie permet l'extraction de paramètres spatiaux et quantitative dans tout le volume du pancréas murin. En raison de limitations dans la résolution possible pour ce type d'imagerie mésoscopique il convient de noter que, comme pour la plupart des modalités d'imagerie, plus l'échantillon inférieur le la résolution (Bien que l'utilisation d'une résolution plus élevée CCD devrait augmenter la résolution de la numérisation OPT) . Ainsi, pour l'évaluation de la souris intactes lobes du pancréas, de la technique à l'heure actuelle ne fournit pas la résolution cellule unique bien que proche (environ 15-20 um) ^7. Pourtant, pour l'extraction de la distribution BCM dans le pancréas de souris les protocoles ont fourni des données qui correspondent à plus que bien ceux obtenus par exemple le point de comptage morphométrie ^3,13 Il convient de noter que, bien que la mise en œuvre du protocole CLAHE permet la détection d'îlots significativement plus , ces îlots sont généralement plus petits et ne contrite essentiellement aux β-ensemble de cellules volumes.

Les protocoles immunohistochimiques impliqués sont relativement longues (jusqu'à deux semaines), mais les mains réelles sur le temps de préparation de l'échantillon est court et donc la technique est bien adaptée à l'étude de grandes cohortes d'animaux ^9. Si le potentiel des modes de distribution hétérogènes est une priorité pour l'enquête, il convient de souligner que des précautions doivent être prises dans les étapes concernant la fixation et le montage pour éviter que le tissu pancréatique est fixé de manière défavorable et un plat ("étalée" ) de montage du tissu faudrait s'efforcer de faciliter de telles évaluations.

Une question importante lors de l'exécution OPT, c'est que COM de l'échantillon est fixé à l'axe de rotation et qu'il ne bouge pas, verticalement ou horizontalement, au cours de la procédure de numérisation. Par conséquent, il est essentiel d'avoir une configuration mécanique stable et un système qui fonctionne bien pour attaching de l'échantillon. Nous avons résolu ce problème en construisant une nouvelle monture (Figure 7).

Géométrie parallèle n'était pas le cas de notre NIR-OPT ou Bioptonics 3001 scanner, qui a été détecté comme un décalage vertical entre les positions arrière et avant des objets périphériques dans les images de projection enregistrées. En ajustant l'objet à distance de la source dans le fichier journal du scanner respectif (voir 2.3.1) nous avons pu améliorer considérablement la qualité de nos données et de corriger les distorsions géométriques sur les bords loin des images de projection, ce qui est particulièrement important lorsque évaluer les plus grands spécimens.

Dans le protocole actuel, nous fournissons une suggestion de jeux de filtres qui permettent de visualiser des trois différents canaux spécifiques et une «anatomie» de canaux dans les évaluations des préparations pancréatiques intacts. Bien entendu, ces paramètres peuvent être modulés pour mieux répondre aux fluorochromes utilisés pour une étude donnée même si, comme toutes les formes de fluorescencemicroscopie cent, le danger potentiel du signal transpercement doit être soigneusement évaluée. L'étude des îlots d'insuline marquées avec des fluorochromes qui sont excités au-dessus de 750 nm n'a pas encore été possible de nous en utilisant le lampe aux halogénures métalliques que notre jeu utilise le haut. Il est possible que d'un appareil photo avec une efficacité quantique encore plus élevée dans les longueurs d'onde pertinentes en combinaison avec d'autres sources lumineuses (diodes laser, par exemple) pourraient augmenter le potentiel de NIR-OPT loin et permettre à l'imagerie des longueurs d'onde encore plus élevés.

OPT est une technique d'imagerie très polyvalent pour les évaluations spatiales et quantitatives des échantillons biomédicaux à l'échelle mm-cm. Bien que les protocoles présentés ici ont été développées dans le but principal du pancréas / recherche sur le diabète, ils devrait être possible de traduire la recherche sur d'autres espèces, les types d'échantillons et des marqueurs. Par la possibilité de visualiser plusieurs chaînes distinctes dans des préparations pancréatiques intacts, NIR-OPT imagerie futres a le potentiel comme outil pour évaluer la spécificité absorption d'agents de contraste destinés à l'évaluation non invasive par d'autres modalités d'imagerie, pour autant que ces agents de contraste pourrait être conçu pour transporter aussi un fluorophore détectable par l'OPT.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom de réactif / Matériel	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Méthanol	Scharlau	ME03162500
30% de H 2 O 2	Scharlau	HI01362500
Alcool benzylique	Scharlau	AL01611000
Benzyl Benzoate	Scharlau	BE01851000
Faible point de fusion d'agarose	LONZA	50100
Paraformaldéhyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127
DMSO	Sigma-Aldrich	D5879
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T8787
Souris anti-asma-Cy3	Sigma-Aldrich	C6198	L'anticorps primaire
Lapin anti-CD3	Sigma-Aldrich	C7930	L'anticorps primaire
Guinée Pig anti-Ins	DAKO	A0564	L'anticorps primaire
Âne anti-GP IRDye680	LI-COR Biosciences	926-32421	Anticorps secondaire
De chèvre anti-Rb DyeLight750	Thermo Scientific	35570	Anticorps secondaire
De chèvre anti-GP Alexa594	Molecular Probes	A-11076	Anticorps secondaire
De chèvre anti-GP Alexa488	Molecular Probes	A-11008	Anticorps secondaire
Chèvre antiGP-Alexa594	Molecular Probes	A-11012	Anticorps secondaire
De chèvre anti-GP Alexa680	Molecular Probes	A-21076	Anticorps secondaire
De chèvre anti-GP Alexa750	Molecular Probes	A-21039	Anticorps secondaire
OPT Skyscan 3001	Bioptonics		OPT-Scanner
Leica MZ FLIII	Leica Microsystems		Stéréomicroscope
Objectif 0.5x Leica	Leica Microsystems	10446157
Leica Camera adaptateur 1.0x	Leica Microsystems	10445930
EL6000 halogénures métalliques		11504115	Lightsource
Guide Liquid Light		11504116
Cuvette	Hellma Analytics	6030-OG	55 x 55 x 52,5 mm
Miroir	Edmund Optics	F68-334	50 x 50 mm
Andor Ikon-M	Andor Technology	DU934N-BV	CCD rétro-éclairé
Filterset	Technologie Chroma	41021-MZFLIII	TXR, Alexa-594, Cy3
Filterset	Technologie Chroma	41022-MZFLIII	IRDye680, Alexa-680
Filterset	Technologie Chroma	49037-MZFLIII	Dylight750, Alexa-750
ProteinG-Sepharose perles	GE Healthcare	17-0618-01	Protéine G Sepharose 4 Fast Flow
D'azoture de sodium	Sigma-Aldrich	08591	L'azoture de sodium solution 0,1 M