Criblage à haut débit fonctionnelle utilisant une maison double lueur de dosage de luciférase

Résumé

Nous présentons une méthode de dépistage rapide et peu coûteuse pour identifier des régulateurs de transcription à l'aide de haut-débit transfections robotiques et un dosage de la luciférase double lueur maison. Ce protocole génère rapidement des données fonctionnelles directes côté-à-côte pour des milliers de gènes et est facilement modifiable pour cibler tout gène d'intérêt.

Résumé

Nous présentons un protocole de criblage à haut débit rapide et peu coûteux pour identifier des régulateurs transcriptionnels de l'alpha-synucléine, un gène associé à la maladie de Parkinson. Des cellules 293T sont transfectées de manière transitoire avec des plasmides provenant d'une banque d'expression de l'ORF parée, en même temps que les plasmides rapporteurs de luciférase, dans un format de microplaque à un gène par puits. L'activité de la luciférase de luciole est analysée après 48 heures pour déterminer les effets de chaque gène de la bibliothèque sur l'alpha-synucléine transcription, normalisée à partir d'un produit d'assemblage d'expression de contrôle interne (un promoteur hCMV diriger la luciférase de Renilla). Ce protocole est facilitée par un robot de paillasse enfermé dans une enceinte de sécurité biologique, qui exécute une manipulation de liquide aseptique en format 96 puits. Notre protocole de transfection automatisé est facilement adaptable à la production de la bibliothèque de lentiviral à haut débit ou d'autres protocoles de dépistage fonctionnels nécessitant une triple-transfections de grands nombres de plasmides de la banque uniques dans conjunction avec un ensemble commun de plasmides auxiliaires. Nous présentons également une alternative peu coûteuse et validé à disponibles dans le commerce, deux réactifs luciférase qui emploie PTC124, EDTA, et le pyrophosphate de supprimer l'activité luciférase de luciole avant la mesure de Renilla. En utilisant ces méthodes, nous avons criblé 7670 gènes humains et identifié 68 organismes de réglementation de l'alpha-synucléine. Ce protocole est facilement modifiable pour cibler d'autres gènes d'intérêt.

Introduction

La capacité à identifier des éléments régulateurs génétiques clés et les facteurs qui agissent sur eux est fondamental pour l'exploration de nombreux processus biologiques. Toutefois, l'identification des facteurs qui régulent l'expression de gènes dans des types de cellules rares, telles que les populations neuronales spécifiques, peut être difficile. Ici, nous présentons un protocole pour identifier de nouveaux régulateurs de la transcription de l'alpha-synucléine (SNCA), un gène associé à la maladie de Parkinson et exprimé dans les neurones dopaminergiques dans la substantianigra la pars compacta de la région du cerveau moyen. Nous accomplissons cela en utilisant un écran à haut débit, double-luciférase, in vitro reporter à déconstruire expression alpha-synucléine dans les cellules 293T. Le promoteur d'alpha-synucléine est d'abord clone dans un plasmide rapporteur contenant le gène de la luciférase de luciole. Un plasmide disponible dans le commerce contenant de la luciférase de Renilla sous le contrôle d'un promoteur constitutivement actif sert de contrôle interne. The constructions rapporteurs sont co-transfectés dans des cellules 293T avec les plasmides dans des microplaques à partir d'une banque d'expression d'ADN, de telle sorte que chaque puits est transfectée avec un plasmide unique de la bibliothèque. Après 48 heures, l'activité de la luciférase pour chaque rapporteur est mesurée séquentiellement en utilisant un dosage double lueur. L'expression relative de l'alpha-synucléine en réponse à chaque gène bibliothèque est déduite par le rapport de la luciole: l'activité de la luciférase de Renilla dans chaque puits (F: rapport R) après normalisation sur la base de plaque.

Ce protocole permet de cribler un grand nombre de gènes (~ 2 500 par semaine) pour leur capacité à transactiver un gène rapporteur en utilisant un minimum de personnel (1-2 personnes) et un coût minime (environ 3 $ le coût d'un réactif par essai de microplaques). Régulateurs de la transcription de gènes neuronaux (par exemple, l'alpha-synucléine), qui sont difficiles à étudier dans des cultures de neurones réfractaires à la manipulation génétique, peuvent être comparés côte à côte dans cette analyse fonctionnelle directe. Nous incluons dans notreprotocole une méthode détaillée pour le clonage et la croissance des plasmides contenant le promoteur alpha-synucléine, car nous avons constaté que les plasmides contenant cette région sont instables lorsqu'elles sont cultivées avec les procédures classiques (voir Discussion). Nous incluons également une alternative peu coûteuse à des réactifs disponibles dans le commerce à double luciférase pour tests à haut débit. Ce protocole peut être facilement adaptée pour cibler d'autres éléments de régulation d'intérêt, ou à tout processus exigeant à haut débit transfections transitoires.

Protocole

Pour une vue d'ensemble expérimental, voir Figure 1.

1. Préparer plasmides rapporteurs contenant l'alpha-synucléine Promoteur

Les éléments de régulation du gène de l'alpha-synucléine (Figure 2) couvrent environ 10 kb, du PNLS (non-Un composant bêta de peptide amyloïde) séquence de répétition dinucléotide amont ^1,2 par l'intron 2 ^3. Nous incluons une partie de cette région notre construction de rapporteur. Nous avons constaté que les plasmides contenant l'intron 2 procédures spéciales requises pour la croissance, comme décrits ci-dessous. Les plasmides de luciférase, et pGL4.10 pGL4.75 (figure 3), sont disponibles dans le commerce auprès de Promega et peuvent être propagées en utilisant des protocoles classiques de biologie moléculaire.

1. Amplifier les deux composantes du promoteur d'alpha-synucléine dans les RAP séparés en utilisant la recette dans le tableau 1 et les amorces dans le tableau 2.
2. Verify produits de PCR sur un gel d'agarose et propre en utilisant le kit de purification PCR Qiaquick (Qiagen), en éluant dans 50 ul de TE (Tris-EDTA). Rangez le fragment élue 0,9 kb à -20 ° C pour une utilisation future.
3. Digérer la totalité du volume du fragment de PCR de 3,4 kb, ainsi que 5 ug de pGL4.10, avec Sacl et Xhol. Traiter le vecteur de phosphatase alcaline d'intestin de veau (Roche) et gel purifier en utilisant le kit PureLink Gel Extraction rapide (Invitrogen).
4. Ligaturer le fragment et le vecteur en utilisant la T4 ADN ligase (NEB). Nettoyez la réaction terminée en utilisant le kit Micro PCR PureLink (Invitrogen), en éluant à 10 tampon TE pi.
5. Transformer 2 ul de la réaction de ligature a nettoyé dans 20 pl de cellules compétentes ElectroMAX Stbl4 (Invitrogen) et l'électroporation selon les instructions du fabricant. Agiter dans un incubateur à 30 ° à 225 tours par minute pendant 90 min. Etaler deux volumes sur des plaques LB contenant 100 mg / ml d'ampicilline et incuber à 30 ° C pendant 2 jours.
6. L'utilisation d'un cure-dent, sélectionnez 4-6 petites colonies pour l'inoculation dans 2 ml de TB (Terrific Broth). Cultiver ces cultures miniprep dans un shaker 30 ° C O / N.
7. Purifier l'ADN plasmidique à partir de 1,5 ml de chaque culture de miniprep en utilisant le kit Plasmid Miniprep PureLink HiPure (Invitrogen).
8. Digérer les minipreps avec BamHI et par électrophorèse sur gel d'agarose. Le clone correct devrait produire des fragments de 2,8 kb et 4,9 kb.
9. Restreak la culture restante miniprep à partir du clone correct sur un milieu LB (Luria Broth) plaque fraîche et de croître à 30 ° C pendant 2 jours.
10. Choisissez une petite colonie et ensemencer une culture de départ de 1,5 ml de la tuberculose. Secouez O / N à 30 ° C. Ne laissez pas la culture de départ pousser à saturation.
11. Diluer le levain entier dans 150 ml de tuberculose préchauffé et agiter à 30 ° C pendant 2 jours. Avant de procéder à l'étape suivante, en utilisant 1,5 ml de cette culture pour une mini-préparation et la digestion supplémentaire pour confirmer que le clone n'a pas muté pendant replicati sur.
12. Purifier l'ADN plasmidique de la culture restante en utilisant le kit Plasmid Maxiprep PureLink HiPure (Invitrogen). Les rendements attendus de ce plasmide intermédiaire sont 50-150 mg par 150 ml de culture.
13. Décongeler le fragment de 0,9 kb figé dans l'étape 1.2. Répétez les étapes 1.3 à 1.12 pour cloner le fragment de 0,9 kb dans le plasmide intermédiaire, la digestion place avec Kpnl et Sacl. Ligate, transformer, sélectionner et développer pour Maxipreps comme ci-dessus. Digestion avec BamHI devrait donner des fragments de 5,8 kb et 2,8 kb. C'est le plasmide qui sera utilisé pour l'écran.

2. Préparer les cellules 293T, Reporter plasmides, et une bibliothèque d'ADN pour le dépistage

Des cellules 293T sont d'abord ensemencées dans des plaques à 96 puits et transfectées le lendemain. plasmides rapporteurs et des ADN de la bibliothèque sont dilués dans des plaques à 96 puits. Nous avons obtenu des plaques d'ADN de la bibliothèque transfection qualité de l'ADN de base à l'Hôpital général du Massachusetts (obtenir = "_blank"> dnacore.mgh.harvard.edu). Ce protocole transfecte une plaque bibliothèque unique en 2 plaques identiques de cellules 293T (figure 1), donc 2 plaques de cellules doivent être ensemencées pour chaque plaque bibliothèque à être projeté.

Remarque: Cultiver les cellules dans les médias sans rouge de phénol ou des antibiotiques, car ils interfèrent avec les tests de la luciférase et augmentent la toxicité pendant la transfection, respectivement.

1. Pour chaque plaque de bibliothèque à cribler, des cellules 293T trypsinisées de remettre en suspension à une concentration de 1,5 x 10 ⁵ cellules / ml dans du DMEM contenant 14% de FBS. Verser dans un réservoir stérile (Axygen).
2. Placez le réservoir, 2 à fond transparent, des plaques à 96 puits (Corning), et une boîte de conseils filtre de pipette (Agilent) sur la plate-forme de robot. Déposer 100 pi de cellules dans chaque puits de deux plaques, pour une densité de 1,5 x 10 ⁴ cellules par puits.
3. Centrifuger les plaques de cellules à 50 g pendant 2 min, en utilisant de faibles vitesses de rampe pour assurer l'égalitédensité de cellules tout au long de chaque puits. Incuber à 37 ° C et 10% de CO ₂ O / N.
4. Diluer la luciole et de Renilla plasmides rapporteurs à 5 ng / ul dans un milieu sans sérum. Combiner les dilutions dans un rapport de 05:03 à luciole Renilla plasmide (en volume) dans un tube conique de 15 ml.
5. Pipet les plasmides combinés dans chaque puits d'une plaque de 96 puits, distribution de 17 pi par plaque bibliothèque, plus 2-10 ul excès, dans chaque puits.
6. Obtenir des plaques de la bibliothèque de la transfection d'ADN de qualité comme ci-dessus et complétez à 13,3 ng / ul avec de l'eau exempte d'endotoxines. Le volume minimum par puits devrait être de 28 pi.

3. Effectuer Transfections

Le jour 2 de l'écran, plasmides rapporteurs et d'ADN de la bibliothèque sont transfectées dans des cellules 293T.

1. Pour chaque plaque bibliothèque, mélangez 107,5 pi de RT Optifect (Invitrogen) avec 4,3 ml de milieu sans sérum (01h40 dilution) dans un tube de polystyrène. Incuber pendant 5 min à température ambiante, et l'n distribuer 44 pi (par plaque bibliothèque) dans chaque puits d'une plaque de 96 puits, polystyrène fond en V (Greiner).
2. Placer la plaque de dilution Optifect, plasmides rapporteurs (étape 2.5), les ADN de la bibliothèque (étape 2.6), et une boîte de pointes de pipette sur la plate-forme de robot.
3. Aspirer 17 pi de plasmides rapporteurs, 43 pi de dilution Optifect, et 26 ul d'ADN bibliothèque, en insérant un espace d'air de 5 pi entre chaque aspiration. L'ADN de la banque doit être aspiré dernier pour empêcher la contamination croisée. Verser le contenu des conseils dans une nouvelle plaque de fond en V polystyrène, mélanger, couvrir et mettre de côté pendant 20 minutes pour permettre complexes lipides / ADN pour former. Si la transfection de multiples plaques de bibliothèque, de remplacer les embouts de pipette et plaque de la bibliothèque, et répéter.
4. Découvrez la plaque de mélange Optifect / ADN et le placer sur la plate-forme de robot avec 2 plaques de cellules 293T. En utilisant une seule boîte de pointes de pipette, aspirer 80 pi de la Optifect: mélange d'ADN et passer lentement 40 pi sur chaque plaque de cellules. Si transfecting plusieurs plaques de bibliothèque, répétez l'opération pour tous Optifect: plaques d'ADN. Couvrir cellules.
5. Centrifuger les plaques de cellules à 1200 g pendant 30 min. Couvrir et retourner à l'incubateur.
6. Incuber les cellules pendant 4-6 heures. Pendant cette incubation, préparer du milieu frais par mélange de 12 ml de DMEM contenant 10% de FBS et 10 ug / ml de ciprofloxacine (Cellgro) pour chaque plaque de bibliothèque transfectée. Verser milieu frais dans un réservoir stérile.
7. Placez 2 boîtes de conseils de robot, une seule plaque de cellules, le réservoir contenant un milieu frais, et un réservoir de déchets sur la plate-forme de robot. Aspirer 100 pi de milieu à partir des cellules et distribuent dans le réservoir de déchets partiellement rempli d'éthanol à 70%. En utilisant des pointes frais, aspirer 100 pi de milieu frais et distribuer lentement sur les cellules. Répétez l'opération pour toutes les plaques de cellules.
8. Plaques revenir à l'incubateur pendant 48 heures.

4. Effectuez double luciférase-dosages

Au jour 4 de l'écran, l'luciole et de Renilla essais luciférase sont effectuées.

Remarque: Le dosage à double luciférase nécessite l'addition séquentielle de deux tampons de dosage, 3X tampon luciole dosage et un tampon d'essai 3X Renilla, comme décrit dans le tableau 3 de luciole et de Renilla luciférases ne sont pas sécrétées, ainsi les cellules doivent être lysées avant de mesurer l'activité luciférase. . Tampon de dosage Firefly lyse des cellules et fournit substrat pour la luciférase de luciole, tampon de dosage Renilla éteint le signal luciole et fournit substrat pour la luciférase Renilla.

1. Pour chaque plaque de bibliothèque, préparer 8 ml de tampon 3X luciole dosage à partir de solutions mères comme décrit dans le tableau 3, et se dispenser 82 pi dans chaque puits d'une plaque à fond en V à 96 puits.
2. Pour chaque plaque de bibliothèque, également préparer 12 ml de tampon de dosage 3X Renilla et dispenser 122 pi dans chaque puits d'une plaque à fond en V à 96 puits. Mettez de côté à la fois leluciole et de Renilla tampons de dosage.
3. Placez une boîte de pointes de pipette, un réservoir de déchets, et 2 plaques de cellules (transfectées dans la même assiette bibliothèque) sur la plate-forme de robot.
4. Aspirer 60 pi de milieu de chaque assiette, et jetez les dans le réservoir de déchets partiellement rempli d'éthanol à 70%. Les plaques de recouvrement et mettre de côté. Si la transfection de multiples plaques de bibliothèque, répétez l'opération pour tous les jeux de plaques.
5. Placez 2 boîtes de embouts de pipette, la plaque de tampon 3X luciole dosage, et un ensemble de plaques de cellules sur le pont du robot.
6. Aspirer 40 pi de tampon 3X luciole dosage et l'ajouter à la première plaque de cellules, bien mélanger. Le passage à de nouveaux embouts de pipette, répétez l'opération pour la seconde plaque de cellule. Placer les cellules à la température ambiante pendant 10 min pour compléter la lyse. Si la transfection de multiples plaques de bibliothèque, remplacer les boîtes de conseils et de plaques de cellules, et répéter.
7. luminescence d'enregistrement de chaque puits de chaque plaque de cellule sur un luminomètre, enregistrement pendant 1 seconde par puits. Plaques Retour au robotpont.
8. Placez 2 boîtes de embouts de pipette, la plaque de tampon de dosage 3X Renilla, et un ensemble de plaques de cellules sur le pont du robot.
9. Aspirer 60 ul de tampon de dosage 3X Renilla, et l'ajouter à la première plaque de cellules, en mélangeant soigneusement. Le passage à une nouvelle boîte de pointes de pipette, répétez l'opération pour la seconde plaque de cellule. Si la transfection de multiples plaques de bibliothèque, répétez l'opération pour tous les jeux de plaques cellulaires.
10. luminescence d'enregistrement de toutes les plaques sur un luminomètre, l'enregistrement de chaque bien pour 1 sec comme ci-dessus. Jeter plaques.

5. Analyse des données

1. Calculer la luciole: rapport Renilla de luminescence ("F: rapport R") pour chaque puits en divisant les chiffres de signal de luciole par les comtes de signal de Renilla.
2. Calculer la valeur de l'induction en divisant le rapport F: R de chaque puits par la moyenne F: rapport R de la plaque, à l'exclusion de la plus haute et la plus basse de 25% des puits.
3. La moyenne des valeurs d'induction dans les répétitionspour une seule plaque de bibliothèque transfectées. Gènes induisant ou réprimant l'alpha-synucléine plus de trois plis sont considérés comme des "hits" sur cet écran et sont soumis à une validation supplémentaire et des écrans secondaires.

Résultats

Valeurs de luciférase typiques, F: ratios R et les valeurs d'induction pour une seule demi-plaque sont présentés dans la figure 4 Notez le succès dans bien H2, un inducteur 32 fois.. Les gènes produisant une toxicité excessive (par exemple, bien E3), ou les puits qui ont été mal transfectées, produisent de faibles valeurs pour luciole et luciferases Renilla, mais une valeur moyenne de l'induction. Les gènes provoquant l'induction non spécifique de l'activité de la lu...

Discussion

L'alpha-synucléine a été impliquée dans la maladie de Parkinson (PD) en tant que composant de corps de Lewy, des inclusions intracellulaires ⁴ considérés pathognomonique de cette maladie. De nombreuses études d'association pangénomiques ont lié polymorphismes de nucléotides simples dans l'alpha-synucléine à un risque accru pour sporadique PD ^5,6,7. Bien que moins fréquente que PD sporadique, maladie de Parkinson familiale peut aussi être causée par des mutations dans l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
QIAQuick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
PureLink Quick Gel Extraction Kit	Invitrogen	K2100-12
PureLink PCR Micro Kit	Invitrogen	K310250
PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit	Invitrogen	K2100-03
PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit	Invitrogen	K2100-07
Bravo Robot	Agilent	-
Robot Pipet Tips with Filter	Agilent	19477-022
Robot Pipet Tips without Filter	Agilent	19477-002
Clear-bottomed 96-well Plates	Corning	3610
Reservoirs	Axygen	RES-SW96-HP-SI
Polystyrene V-bottomed 96-well Plate	Greiner	651101
Polypropylene V-bottomed 96-well Plate	Greiner	651201
Adhesive Plate Covers	CryoStuff	#FS100
Reagent
Phusion DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530L
BAC 2002-D6	Invitrogen	2002-D6
Calf Intestine Alkaline Phosphatase	Roche	10713023001
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202L
pGL4.10	Promega	E6651
pGL4.74	Promega	E6931
ElectroMAX Stbl4 Competent Cells	Invitrogen	11635-018
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	Invitrogen	18265-017
DMEM without Phenol Red	Invitrogen	31053-028
Optifect	Invitrogen	12579017
Ciprofloxacin	CellGro	61-277-RF
Tris-Hydrochloride Powder	Sigma	93287
Tris-Base Powder	Sigma	93286
Triton X-100 Pure Liquid	Fisher	BP151-100
DTT	Invitrogen	15508-013
C–nzyme A	Nanolight	309
ATP	Sigma	A6419
Luciferin	Invitrogen	L2912
h-CTZ	Nanolight	301
PTC124	SelleckBiochemicals	S6003