Évaluer murin Fonction Artère résistance à l'aide myographie de pression

Résumé

Dans myographie de pression, un petit segment intact d'un navire est montée sur deux petites canules et mis sous pression à une pression intracavitaire approprié. Ici, nous décrivons la méthode pour mesurer la réponse de vasorelaxation de la souris 3 ^Rd Commander artères mésentériques dans c57 et sGCα _{1 - / - Souris en utilisant myographie de pression.}

Résumé

systèmes de myographe de pression sont extraordinairement utile dans l'évaluation fonctionnelle des petites artères, sous pression à une pression transmurale approprié. L'état physiologique près réalisés dans myographie de pression permet la caractérisation en profondeur des réponses intrinsèques aux stimuli pharmacologiques et physiologiques qui peuvent être extrapolés à l'comportement in vivo du lit vasculaire. myographe de pression a plusieurs avantages sur myographs de fils classiques. Par exemple, les navires de moindre résistance peuvent être étudiés à des pressions intraluminaux étroitement contrôlés et physiologiquement pertinents. Ici, nous étudions la possibilité de ^3ème artères mésentériques de commande (3-4 mm de long), précontractés avec la phényléphrine, à vaso-relax en réponse à l'acétylcholine. Artères mésentériques sont montés sur deux canules connectées à un système sous pression et étanche qui est maintenue à une pression constante de 60 mmHg. Le diamètre de la lumière et extérieure de la cuve sont continuously enregistré en utilisant une caméra vidéo, permettant la quantification en temps réel de la vasoconstriction et vasorelaxation en réponse à la phényléphrine et l'acétylcholine, respectivement.

Pour démontrer l'applicabilité de myographie de pression pour étudier l'étiologie des maladies cardiovasculaires, nous avons évalué la fonction vasculaire dépendant de l'endothélium dans un modèle murin de l'hypertension systémique. Les souris déficientes en _une sous-unité α de la guanylate cyclase soluble (sGCα ₁ ^{- / -)} sont hypertendus quand sur un (S6) de fond 129S6 (sGCα _une ^-/-S6) mais pas lorsque les souris C57BL / 6 (B6) de fond (sGCα _une ^-/-B6). Utiliser myographie de pression, nous démontrons que sGCα résultats ₁ à la carence en déficience vasorelaxation endothélium-dépendante. La dysfonction vasculaire est plus prononcée dans sGCα ₁ ^-/-S6 que dans sGCα ₁ ^-/-B6 souris, probablement contributing de la pression artérielle plus élevée dans _une sGCα ^-/-S6 que dans sGCα ^-/-B6 _une souris.

myographie de pression est une technique relativement simple, mais sensible et mécaniste utile qui peut être utilisé pour évaluer l'effet de divers stimuli sur la contraction et la relaxation vasculaire, augmentant ainsi notre compréhension des mécanismes qui sous-tendent les maladies cardiovasculaires.

Introduction

systèmes de myographe de pression sont utilisés pour mesurer la fonction physiologique et les propriétés des petites artères, veines et autres vaisseaux. Une petite partie intacte d'une artère ou veine est monté sur deux petites canules en verre et mise sous pression à une pression intracavitaire appropriée, permettant à la cuve pour maintenir l'essentiel de son en caractéristiques in vivo (figures 1 et 2). L'état physiologique près dans un myographe de pression reflète le comportement in vivo du lit vasculaire, ce qui permet l'étude des propriétés intrinsèques (par exemple tonus myogène) des navires isolés. Parmi les avantages de myographie de pression sur myographie de fil, où la contraction musculaire est évaluée par couplage mécanique direct à un capteur de force ^1, y compris (i) que les micro-artères de résistance, qui définissent la résistance globale développée dans le système vasculaire, peuvent être étudiés, alors que myographe de fil est limitée à de plus grandes artères de conduit, (ii) tchapeau le risque d'endommager l'endothélium est réduite car aucun des fils doivent être passés par la lumière du vaisseau, (iii) que la forme naturelle de la cuve est mieux maintenu, et (iv) la dimension du navire peut être étudié à un large éventail de pressions ou des contraintes de cisaillement ^2.

L'étude de micro-vaisseaux peut être plus instructif que d'étudier les grandes artères de conduite pour aider à comprendre les mécanismes physiopathologiques et moléculaires qui contribuent à la tonicité vasculaire altérée dans les maladies cardiovasculaires comme l'hypertension. Par exemple, altération de la fonction endothéliale associée à l'alimentation des souris un régime riche en graisses pendant 8 semaines a pu être démontrée dans 2 ^nd ordre artères mésentériques ³ mais pas dans les anneaux aortiques (figure 3). Un autre avantage de myographie de pression, c'est que la constriction myogénique intrinsèque de la cuve sous pression est présente, et que le rôle et la fonction de l'endothélium dans ce phénomène peut être étudié. Ici, nous descrBIE l'utilisation d'un myographe de pression pour étudier la réactivité vasculaire des souris mésentériques ordre ³ artères de résistance dans un contexte de l'oxyde nitrique avec facultés affaiblies (NO)-cGMP de signalisation.

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Protocole

1. Préparation de la solution

1. 500X EDTA stock: peser 500 mg EDTA-Na ₂ • 2H ₂ O et les dissoudre dans 50 ml d'eau déminéralisée. Stocker à température ambiante.
2. KCl solution dépolarisants.
   1. Préparer la solution mère K10X: 3,69 g NaCl, 18,64 g de KCl, 0,36 g _MgSO4 anhydre, 0,41 g KH ₂ PO _4, 0,46 g CaCl ₂ • 2H ₂ O. Dissoudre dans 250 ml d'eau déminéralisée. Stocker à température ambiante.
   2. Pour 100 ml KCl dernière solution 1X dépolarisants: Dissoudre 0,21 NaHCO _3, 0,18 g de glucose dans 90 ml d'eau déminéralisée. Ajouter 10 ml de la solution mère K10X. Ajouter 95 ul de solution EDTA 500X. Mélangez bien. Conserver à 4 ° C. Utilisez moins d'une semaine.
3. Préparer une nouvelle solution HEPES PSS, le jour de l'expérience (pour 1 litre).
   1. 6,96 g NaCl, 0,35 g de KCl, 0,288 g MgSO ₄ • 7H ₂ O, 0,1605 g de KH ₂ PO _4, 2,38 g HEPES. Dissoudre dans 100 mlde l'eau désionisée. Marquer comme flacon A.
   2. 0,312 g CaCl ₂ • 2H ₂ O. Dissoudre dans 100 ml d'eau déminéralisée. Marquer comme flacon B.
   3. 1,25 g _NaHCO3, 0,991 g de glucose. Dissoudre dans 98 ml d'eau déminéralisée. Marquer comme flacon C.
4. Ajouter 2 ml de 500X EDTA dans une fiole C. Prendre 700 ml d'eau déminéralisée dans un grand flacon. Verser le contenu du flacon A, B et C dans le grand flacon avec vortex continue. Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH.

2. Médicaments utilisés

1. Phényléphrine (10 ^-2 M): dissoudre 20,37 mg dans 10 ml d'eau déminéralisée. Aliquote de 1 ml et conserver à -80 ° C. Série diluer pour obtenir 10 ^-3 10 ^-4, 10 ^-5 et 10 ^-6 mol / L le jour de l'expérience.
2. L'acétylcholine (10 ^-2 M): dissoudre 18,17 mg dans 10 ml d'eau déminéralisée. Aliquote de 1 ml et conserver à -80 ° C. Série diluer pour obtenir 10 ^-3 10 ^-4, 10 ^-5 et 10 ^-6mol / L, le jour de l'expérience.

3. Souris

Homme WT et sGCα ₁ ^{- / -} souris sur le fond S6 et B6 ont été étudiés tout au long de cette étude. Le sGCα ₁ ^{- / -} ont été générés comme décrit précédemment ^4,5. Logement et procédures impliquant des animaux de laboratoire (souris) ont été approuvés par le comité de protection des animaux de recherche du Massachusetts General Hospital, Boston, MA.

4. Mesure de la réactivité vasculaire dans l'artère mésentérique

1. Euthanasier les souris avec du pentobarbital (200 mg / kg, ip). Ouvrez la cavité abdominale et disséquer le tissu mésentérique. Isoler et disséquer une artère mésentérique du 3 ^ème sans conjonctif et le tissu adipeux ordre, et placez-le dans l'artère glacée HEPES PSS solution pré-équilibrée avec 95% O _2/5% de CO ₂ pendant 15 min. Couper anneaux de longueur de 2-3 mm avec pas de ramification de la mésentériqueartère. Différencier les artères et les veines au niveau micro des vaisseaux est problématique quand il n'ya pas de sang dans les vaisseaux. Par conséquent, nous vous recommandons d'identifier le navire pendant qu'il est encore intact dans l'animal avant dissection it out.
2. Remplissez les canules de verre dans la chambre myographe de pression (DMT modèle 110P 11P et la version 1.31, Figure 2) avec une solution HEPES-PSS à l'aide d'une seringue de 10 ml à travers soupapes d'admission et de sortie. Le remplissage de la canule doit être fait soigneusement que la pression excessive peut endommager le capteur fragile connecté à canules. Après avoir rempli canules fermer les deux soupapes d'admission et de sortie bien.
3. Monter une extrémité de la cuve sur une canule droite et l'attacher soigneusement avec un brin amende de suture de nylon. Avec l'aide d'une seringue, rincer et remplir le réservoir avec une solution HEPES par la soupape d'admission. Porter à la canule gauche près de la cuve et monter l'autre extrémité du récipient sur celui-ci. Attachez avec suture de nylon. Remplirla chambre avec un maximum de 10 ml avec une solution HEPES. Arrivée de la fuite en poussant doucement solution HEPES via la vanne d'entrée à l'aide d'une seringue.
4. Installation de la chambre sur le myographe et en vertu de la caméra vidéo. Commencez l'oxygène et de la chaleur (37 ° C) dans la chambre. Raccorder la soupape d'admission avec un tube P1 à partir du premier réservoir de solution tampon HEPES, tandis que la soupape est fermée. Soit une bulle et passe de la solution dans le tube jusqu'à ce qu'il n'y ait pas de bulles dans le tube. Ouvrez la vanne.
5. Raccorder la soupape gauche de la chambre avec le tube P2 provenant de régulateur de pression. Encore une fois vérifier toutes les bulles. Il ne devrait pas y avoir de bulles ou de fuite dans le système.
6. Allez dans le menu de la pression sur le panneau myo-interface ou dans le logiciel et mettre la pompe en tournant le débit.
7. Ouvrez le programme et cliquez sur Collecter. Navire devrait être visible à l'écran maintenant (Figure 3). Le navire est visualisée à l'aide d'une caméra montée sur un microscope, ce qui permet monitoring et l'analyse de la lumière du vaisseau, le diamètre du vaisseau, et l'épaisseur de paroi.
8. Augmenter progressivement la pression interluminal via la soupape de P1 en sélectionnant la pression P1 dans le panneau myo-interface ou dans le programme et entrez la valeur de pression comme suit: 5 mmHg → 10 → 20 → 40 → 60 mmHg. Navire tend parfois à se tordre ou convoluer alors que la pression augmente, ajuster la tension ou de la souche en conséquence avec l'aide de micropositionneur verticale ou longitudinale (Figure 2). Equilibrer la cuve à 60 mm Hg et 37 ° C au moins pendant 45 minutes. Changer la solution de bain une fois avec HEPES préchauffées pendant l'équilibrage.
9. Appliquer 10 ml d'une solution de KCl dépolarisant, préchauffée à 37 ° C, au bain de dépolariser entièrement les cellules musculaires lisses et de réaliser une constriction maximale. Après constriction stable, rincer le bain avec une solution HEPES 3 fois toutes les 10 min.
10. Vérifier la viabilité du navire et de l'intégrité de l'endothélium par la stabilité et la reproductionréponses Ible à l'ajout de phényléphrine (10 ^-5 M) et l'acétylcholine (10 ^-5 M). Rincer 3 fois avec une solution HEPES toutes les 10 min.
11. Ajouter phényléphrine (10 ^-5 M) à preconstrict le navire, et quand une constriction stable a été obtenu, effectuer une courbe de concentration-réponse cumulative vasodilatation (CRC) par l'addition successive de doses croissantes d'acétylcholine (10 ^-9, 3 x 10 ^{- 9,} 10 ^-8, 3 x 10 ^-8, 10 ^-7, 3 x 10 ^-7, 10 ^-6, 3 x 10 ^-6 et 10 ^-5 M). Après la dernière dose, rincer 3 fois avec une solution HEPES toutes les 10 min avant de commencer nouveau CRC.
12. Déterminer le diamètre de la lumière passive en appliquant Ca ^{2 +} PSS-libres contenant 2 mM EGTA. De l'tracés enregistrée mesurer le diamètre du flux lumineux pour chaque dose-réponse (figure 4), qui sera utilisé pour le calcul de tous les paramètres.
13. Exprimez toutes les réponses de relaxation à l'acétylcholine comme percchangement entage en diamètre de la lumière après preconstriction de phényléphrine par rapport à la différence entre le diamètre sans calcium et le diamètre, après la constriction à la phényléphrine, en utilisant l'équation suivante:
14. Pourcentage dilatation = 100% x [(D _x - D _i) / (D _Ca-libre - D _i)], où D est le diamètre de la lumière mesurée et x, i, et Ca sans désigner diamètres artériels à chaque dose d'agoniste (x), suivant initial de diamètre phényléphrine constriction (i), et Ca ^{2 +} tampon frais (Ca-free).

5. Analyse statistique

Toutes les mesures continues sont exprimées en moyenne ± SEM. La réactivité vasculaire dans les artères mésentériques est analysé par mesures répétées ANOVA à deux voies. Dans tous les cas, P <0,05 est considérée comme statistiquement significative.

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Résultats

NO joue un rôle central dans le maintien de l'homéostasie de la pression artérielle à la fois chez l'homme et ⁶ dans des modèles animaux ^7. La capacité du NO à contrôler vasculaire relaxation des muscles lisses est médiée par la guanylate cyclase soluble (CGT), une enzyme hétérodimérique hème contenant qui génère cGMP ^8. Récemment, une modificateurs de pression variant génétique du sang a été identifié dans un lieu qui contient le sGCα ₁ et _...

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Discussion

Les souris sont le modèle expérimental de choix pour de nombreux chercheurs, en partie en raison de la possibilité d'introduire des modifications génétiques, générant ainsi des modèles de souris pour la physiopathologie humaine. Le statut vasoactif de faible résistance, mais pas de grands navires de conduit définit en grande partie la régulation du flux sanguin dans le système vasculaire ^11. La taille des artères de résistance chez les petits animaux comme les souris, empêche l'utilisat...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Fisher Scientific	BP358
CaCl2 (2H2O)	Fisher Scientific	C79-500
KCl	Sigma	P9333
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
KH2PO4	Sigma	P3786
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328
NaOH	Fisher Scientific	S318
D-Glucose	Sigma	G8270
EDTA	Fisher Scientific	BP121
HEPES	Sigma	H3375
Phenylephrine	Acros Organics	AC20724
Acetylcholine	Sigma	A6625
Pressure Myograph System	DMT