Une méthode pour la souris Isolement îlots pancréatiques et AMPc intracellulaire Détermination

Résumé

Le dosage in vitro la fonction β-cellulaire en utilisant des îlots isolés de souris de Langerhans est un élément important dans l'étude du diabète physiopathologie et la thérapeutique. Alors que de nombreuses applications en aval sont disponibles, ce protocole décrit précisément la mesure intracellulaire d'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) comme un paramètre essentiel de déterminer la fonction β-cellulaire.

Résumé

Glycémie non contrôlée est une caractéristique du diabète sucré et favorise morbidités comme la neuropathie, la néphropathie et la rétinopathie. Avec la prévalence croissante du diabète, à la fois auto-immune de type 1 et lié à l'obésité de type 2, des études visant à délimiter le diabète physiopathologie et les mécanismes thérapeutiques sont d'une importance critique. Les β-cellules d'îlots pancréatiques de Langerhans sont responsables de la sécrétion de l'insuline de façon appropriée en réponse à des concentrations élevées de glucose dans le sang. En plus du glucose et d'autres nutriments, les cellules β sont également stimulés par des hormones spécifiques, appelées incrétines, qui sont sécrétées par l'intestin en réponse à un repas et d'agir sur les récepteurs β-cellulaires qui augmentent la production d'adénosine monophosphate cyclique intracellulaire ( cAMP). Diminution de la fonction β-cellulaire, la masse, et la réactivité de l'incrétine sont bien comprises de contribuer à la physiopathologie du diabète de type 2, et sont de plus en plus liés wile diabète de type 1 e. L'isolement actuel de l'îlot de la souris et de l'AMPc protocole de détermination peut être un outil pour aider à délimiter les mécanismes favorisant la progression de la maladie et des interventions thérapeutiques, en particulier ceux qui sont médiés par les récepteurs de l'incrétine ou récepteurs qui agissent par modulation de la production d'AMPc intracellulaire liée. Bien que seules des mesures d'AMPc vont être décrits, le protocole d'isolement des îlots de Langerhans décrit crée une préparation propre, qui permet également de nombreuses autres applications en aval, y compris le glucose stimulé la sécrétion d'insuline, la [3 ^{H]-thymidine,} abondance des protéines, et l'expression de l'ARNm.

Introduction

Le maintien strict de euglycémie est impératif de prévenir les pathologies telles que la neuropathie, la néphropathie et la rétinopathie, qui sont toutes des caractéristiques de la pathologie de incontrôlée de type 1 et 2 de diabète ^1. Fonction β-cellulaire réduite et la masse à la fois de type 1 et diabète de type 2 perturbent les concentrations de glucose dans le sang ^2. Alors que le type auto-immune 1 diabète résulte d'une perte dévastatrice de cellules β productrices d'insuline, troubles de β-cellulaire sécrétion d'insuline et périphérique signalisation de l'insuline dans le diabète de type 2, ainsi que de promouvoir l'hyperglycémie, la dyslipidémie, et augmentation de la production hépatique de glucose, ce qui entraîne par la suite dans à la fois la perte de masse β-cellulaire et de l'insuline sécrétoire capacité de β-cellules individuelles ^3. Comprendre les mécanismes sous-jacents β-cellules dans la progression de type 1 et diabète de type 2, nous l'espérons donner lieu à de nouvelles thérapies pour prévenir et traiter ces maladies.

Dans ti vitrodes modèles de culture uestion, tels que l'INS-1 et MIN6 immortalisés lignes β-cellulaires, peuvent être des outils utiles pour la compréhension des fonctions spécifiques β-cellules. Cependant, les interactions entre les différents types de cellules au sein de l'îlot peut se réguler la fonction β-cellulaire. Par exemple, l'influence paracrine de glucagon (libérée à partir de cellules-α) et la somatostatine (libéré à partir des cellules-δ) en augmentant et en diminuant la sécrétion d'insuline, respectivement, démontre l'importance de la proximité de la cellule de la cellule dans la réponse endocrinienne ^4. En outre, les jonctions communicantes entre les cellules-β potentialisent la libération d'insuline ^5. En outre, bien que des progrès ont été réalisés dans la génération de lignées insulinome que mieux reproduits la réponse physiologique des îlots isolés au glucose (par exemple, l'INS-1 dérivé 832/13 et 832/3 lignées cellulaires), leur réactivité de glucose diffère encore de rat normal îlots ^6,7. En outre, la réponse de ces lignées cellulaires d'insulinome clonalesde peptide-1 (GLP-1) des agonistes du glucagon-like peuvent différer considérablement les uns des autres, ainsi que de ^six îlots normaux. Par conséquent, les lignées cellulaires immortalisées peuvent ne pas représenter le meilleur modèle pour les agents de dosage ayant un impact sur la production d'AMPc.

Par contraste avec les lignées cellulaires dérivées insulinome, l'étude de la fonction β-cellulaire uniquement dans des modèles animaux entiers offre sa propre série de complications. Un des plus grands défis dans le travail avec le tissu endocrinien est de mesurer la concentration précise de l'hormone libérée. Plus précisément, le foie joue un rôle majeur métaboliser l'insuline, et le flux sanguin du pancréas va directement vers le foie. Ainsi, une mesure de l'insuline dans le plasma peut ne pas représenter avec précision les quantités d'insuline est sécrétée par le pancréas lui-même ou de l'incidence des différents traitements sur le taux de sécrétion de l'insuline ^8. En outre, le métabolisme rénal de glucagon peut limiter la fiabilité de la production de glucagon par α-cellules d'îlots ⁹. Par conséquent, l'isolement d'îlots de souris primaires pour l'expérimentation in vitro fournit une compréhension plus précise de la façon dont l'îlot est de répondre à des stimuli spécifiques pour compléter les mesures effectuées in vivo.

Le présent protocole pour l'isolement des îlots de souris est un protocole bien établi utilisé par un certain nombre de groupes (avec de légères modifications qui peuvent aider à accroître la réussite) ^10,11. En outre, la détermination de la production d'AMPc permet une lecture directe de la capacité de réponse des cellules incrétine-β. En conjonction avec la mesure de l'AMPc, la teneur en protéines et la sécrétion d'insuline peut également être quantifié à partir de la même préparation de l'échantillon de l'AMPc, aidant à déterminer si un défaut de la fonction β-cellule se trouve proximal ou distal par rapport à l'AMPc ^10. La teneur en AMPc finale et l'insuline demande de sécrétion dans ce protocole peut être un outil très puissant pour comprendre l'influence des constituants pharmaceutiques et alimentaires, entre autres,s, sur l'AMPc et la sécrétion d'insuline. En plus de la stimulation de glucose seul, d'autres composés peuvent être utilisés pour mesurer les changements dans l'AMPc et la sécrétion d'insuline ^10,11.

Enfin, bien que l'insuline est l'hormone principale nous dosage à partir de d'îlots isolés, d'autres hormones, telles que le glucagon et la somatostatine, ainsi que des cytokines, des eicosanoïdes, et l'adénosine monophosphate cyclique, peut également être mesuré, soit par un test de stimulation transitoire ou par quantification de leurs niveaux dans un milieu de culture ^12. Enfin, bien que hors de la portée de ce manuscrit, l'isolement d'îlots avec le procédé d'isolement de la collagénase décrit permet une préservation des îlots de sorte que de nombreuses autres applications en aval peuvent être poursuivis, tels que la greffe d'îlots, l'isolement de l'ARN pour le temps réel de PCR quantitative ou microréseau analyses, protéine l'isolement de transfert de Western, îlot plongement et l'imagerie par immunofluorescence, et l'incorporation de [3H]-thymidine en tant que mesure de repli des cellules des îlotscation, dont certains ont été décrits dans les articles de JoVE précédentes ^{13 à 16.} Dans l'ensemble, la suite de la procédure d'isolement des îlots décrite dans le protocole peut fournir un chercheur de l'information importante et utile pour le développement de thérapies et de promouvoir la découverte de médicaments visant à améliorer la fonction β-cellulaire.

Protocole

Toutes les expériences animales ont été exécutés en conformité avec toutes les directives, les règlements et les organismes de réglementation. Le protocole est démontré a été réalisée sous la direction et l'approbation du soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle (IACUC) de l'Université de Wisconsin-Madison.

Une. Préparation des solutions

1. La méthode d'euthanasie dans ce protocole est exsanguination sous anesthésie Avertin (pour un examen des alternatives, voir Discussion). Pour faire Avertin, ajouter 0,625 g (1,25% ou 44,2 mM) de 2-2-2 tribromoéthanol à 1,25 ml de 2-méthyl-2-butanol dans un tube conique de 15 ml et on chauffe à 37 ° C pendant 20 à 30 min. Vortex la solution à haute température pendant 10-15 secondes à la fois pour dissoudre complètement la tribromoéthanol 2-2-2. Une fois complètement dissout, ajouter la solution à 48,75 ml de la double H ₂ O distillée, filtrer à travers un filtre de 0,45 um dans un nouveau 50 ml tube conique, envelopper les 50 ml coniquesal tube dans une feuille d'aluminium et conserver à 4 ° C pendant un mois. Amener le tube à la température ambiante avant l'injection des souris.
2. Pour faire une solution saline équilibrée de Hanks (HBSS), porter 1 L 1x HBSS d'un stock 10x (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA) dans le double _H2O distillée, ajouter 0,35 g (4,2 mM) Nacho _3, et magasin à 4 ° C pendant jusqu'à 1 mois. Pour chaque souris, 105 ml de cette solution (plus de 5-10 ml supplémentaires pour le pipetage erreur) seront nécessaires pour l'isolement des îlots.
3. Îlots sont très sensibles aux dommages hypoxiques; Par conséquent, on fait barboter du HBSS avec 95% O _2/5% CO ₂ pour imiter les concentrations de O ₂ dans le sang. Mélanges de gaz spéciaux peuvent être achetés et une station de bullage mis en place avec une pipette Pasteur attaché à un tube flexible. Après barbotage de la quantité requise de HBSS avec 95% O _2/5% CO ₂ pendant 15 minutes, ajouter 0,02% de BSA de qualité RIA (albumine de sérum bovin) en volume et de garder sur de la glace pour la remainder de l'isolement des îlots de Langerhans.
4. Pour la préparation de Ficoll, peser 32,5 g de Ficoll dans un bécher de 400 ml, ajouter 80 ml de HBSS, et agiter à 500-700 rpm pendant 30 min. Une fois dissous, verser la solution de Ficoll dans 250 ml graduée et ajouter HBSS à la marque de 130 ml sur le cylindre gradué pour créer une solution de Ficoll 25%. Couvrez le dessus de l'éprouvette graduée avec deux portions de Parafilm ® M (Pechiney Plastic Packaging Company, Chicago, IL) et agiter vigoureusement à plusieurs reprises.
5. Pour une solution de Ficoll 23%, 20,5% et 11%, ajouter 27,6, 24,6, et 13,2 ml de Ficoll 25%, respectivement, à 50 ml tubes coniques. Ensuite, amener chaque solution jusqu'à un total de 30 ml avec HBSS et bien agiter pour mélanger. Tous les quatre solutions de Ficoll doivent être conservés à 4 ° C et sont bonnes pour un maximum de 2 semaines.
6. solution de collagénase qui est appropriée pour isoler les îlots actifs est préparée à partir de la collagénase de Clostridium isolé histolytiqueum (tableau des matériaux). Chaque lot doit être testé pour l'efficacité de l'enzyme. Typiquement, la collagénase est utilisée à 0,3 à 0,5 mg par ml de HBSS. Utilisant des concentrations d'enzymes dans cette gamme (habituellement 3 concentrations différentes), déterminer la qualité et la quantité des îlots isolés de souris ou même portée pour régler la concentration de l'enzyme de travail âge.
7. Une fois que la concentration correcte est déterminée, chaque souris nécessite 35 ml de collagénase dans du HBSS pour l'ensemble du protocole d'isolement. Agiter la collagénase dans HBSS à se dissoudre. Immédiatement avant la chirurgie, pré-charger une seringue de 5 ml avec une solution de collagénase, placer la canule et à enlever les bulles d'air, et laisser sur la glace jusqu'à ce que nécessaire.
8. Les milieux de culture d'îlots pour O / N est une incubation RPMI 1640 supplémenté médias. Pour la solution de stock, dissoudre un paquet RPMI 1640 (Gibco, New York) dans 1 L de la double H ₂ O distillée et ajouter 1,19 g HEPES (5 mM) et 2 g Nacho ₃ (24 mM). Ajuster le pH à 7,4,stériliser par filtration, et conserver à 4 ° C dans l'obscurité.
9. Pour les milieux supplémentés, ajouter 10% de FBS et 100 IU/100 pg / ml de pénicilline / streptomycine, respectivement, pour les actions du milieu RPMI 1640. Si une concentration différente de glucose est souhaitée, sans glucose du milieu RPMI 1640 peuvent être utilisés, et une concentration de glucose spécifique peuvent être ajoutés.
10. Pour un stock tampon Krebs Ringer Bicarbonate (Krebs), ajouter les ingrédients suivants pour doubler l'eau distillée à des concentrations suivantes: NaCl (118,41 mM), KCl (4,69 mM), MgSO ₄ (1,18 mM), KH ₂ PO ₄ (1,18 mM ), Nacho ₃ (25 mM), HEPES (5 mM), et _CaCl2 (2,52 mM) à pH 7,4. CaCl ₂ doit être ajouté en dernier et cette solution peut être stockée à 4 ° C pendant jusqu'à 2 semaines.
11. Pour faire un stock de travail de Krebs, premier gaz avec 95% O _2/182 5% de CO ₂ pendant 10-15 min avec une pipette Pasteur à 37 ° C, suivie par l'addition de 0,5% de grade de RIA BSAen volume. Ensuite, le glucose est ajouté à la concentration désirée pour le dosage in vitro.

2. Préparation des outils

1. Un peu émousser les pointes de 30 - et 27-G aiguilles en utilisant une pierre à aiguiser pour arrondir la pointe acérée. Mettez un coude à 45 degrés dans l'aiguille d'environ ¼ de pouce de la pointe à l'aide d'une paire de pinces. Veillez à ne pas serrer trop fort, qui fermer le diamètre interne de l'aiguille.
2. Couper le fil 3/0 soie de suture dans environ longueurs de 4 pouces, un pour chaque souris.
3. Couvrir le fond de microscope de dissection d'une pellicule plastique et ruban adhésif.
4. Coupez plusieurs morceaux de papier absorbant banc, à environ 3 x 5 pouces de taille, pour au moins 2 pour la souris.

3. Préparation de la souris

1. Remplir une seringue de 1 ml avec 1 ml d'Avertin.
2. Injecter la solution Avertin par voie intrapéritonéale à environ 40 pi / gramme de poids corporel.
3. Après la souris sans longer répond à queue ou pincées plantaires des pattes postérieures, de transférer avec précaution à la station de travail de dissection au microscope.
4. Avec la souris dans la position couchée sur le dos et sa tête face distale, pulvériser la souris avec 70% d'éthanol aqueux. Assurez-vous d'utiliser une quantité suffisante d'éthanol à 70% afin de limiter la quantité de poils dans la cavité thoracique exposée.

4. L'ouverture de la cavité thoracique

1. Pincez la fourrure et la peau de la souris entre les deux pattes de derrière et faire une coupe initiale à travers l'épiderme, le derme et membrane sous-jacente.
2. Tout en pinçant la peau et de la membrane sous-jacente, couper vers l'aile avant des deux côtés de la souris en prenant soin d'éviter de couper tous les organes internes.
3. Pliez la peau et le volet de la membrane sur la cage thoracique et enlever l'appendice xiphoïde pour faciliter l'accès au pancréas pour l'inflation.
4. Réorienter la souris avec la tête face proximale et déplacer les organes internes vers le côté droit du travail station de révéler l'aorte descendante.
5. Sauf tissu sanguin doit être collecté, l'aorte descendante peut être coupé à compléter l'euthanasie. Imprégnez-vous de l'excès de sang avec du papier de banc ou une Kimwipe pour faciliter l'accès à la voie biliaire principale.

5. Gonflage du pancréas

1. Avec une loupe binoculaire, repositionner l'intestin grêle de sorte que le canal cholédoque forme une ligne perpendiculaire à la tête de la souris.
2. Prenez une pince et saisir l'intestin grêle et trouver le sphincter d'Oddi (sphincter d'ampoule) à la fin de la voie biliaire principale, qui s'évase sur sur l'intestin grêle de la voie biliaire, formant un triangle blanc sur l'intestin rose. Une fois que le sphincter d'Oddi a été localisé, prendre # 5 pince Dumont et faites glisser la pointe en dessous de la voie biliaire principale aussi près de l'intestin grêle que possible, en prenant soin de ne pas percer le conduit.
3. Après avoir percé à travers l'intestin grêle et du tissu conjonctif, en utilisant cepointe de l'Dumont Pince à saisir le fil de suture et tirez dans le canal cholédoque. Nouez le canal cholédoque au plus près du sphincter d'Oddi que possible, en s'assurant que le noeud est tendu pour éviter les fuites.
4. Saisir les deux extrémités de la suture et tirez vers la queue pour mettre un peu de tension sur le canal cholédoque. L'utilisation d'un main libre, faire une petite incision avec les ciseaux micro dans le canal cholédoque juste au-dessus de la dernière bifurcation dans le foie. Remarque: Il est important de ne pas couper trop près du sphincter d'Oddi, car cela pourrait entraîner une inflation partielle du pancréas et éviter de couper à travers le canal cholédoque comme il sera également entraîner une mauvaise inflation.
5. Tout en tenant les deux extrémités de la chaîne avec le canal cholédoque tendu, retirer la seringue / canule qui a été pré-chargé avec 5 solution de collagénase ml du seau à glace, déposer la seringue, et insérer l'aiguille 30 G émoussé dans la coupe canal cholédoque, en faisant attention de ne pas percer le par le wall du conduit. Si l'aiguille 30 G n'est pas assez large pour les voies biliaires pour former un joint autour, retirez-le et remplacez-le par 27 aiguille G émoussé.
6. Tout en maintenant l'aiguille en place, relâchez la suture et ramasser la seringue de 5 ml. Enfoncez lentement le piston de la seringue. Remarque: Si l'aiguille a été insérée avec succès dans le canal cholédoque, il va étendre.
7. Continuer à appuyer sur le piston lentement et laisser hors de façon pulsatile jusqu'à ce que la première partie du pancréas gonfle, suivie par une pression constante doux jusqu'à ce que le pancréas ne gonfle. Remarque: La plupart pancréas détiennent 3-5 ml avant de commencer à fuir. En outre, une inflation retenu doit avoir une distribution uniforme de tissu exocrine et la partie du pancréas au-dessus de l'estomac sera gonflé.
8. Retirez l'aiguille de la voie biliaire principale et mis sur le côté.

6. Pancréas enlèvement

1. Prenez une pince dans une main et une paire de ciseaux courbes enl'autre. Utilisation de la pince, saisir l'intestin grêle au niveau du sphincter d'Oddi. Avec les ciseaux fermés, utiliser la pointe à une partie distincte du pancréas de l'intestin grêle.
2. Répartir les ciseaux part à élargir le fossé entre l'intestin grêle et le pancréas.
3. Placer le "V" de la paire de ciseaux, où le petit intestin et le pancréas se fixent les uns aux autres sur le côté droit de la fente qui vient d'être faite. Utilisation de la pince tirez doucement l'intestin grêle passé les ciseaux pour enlever le pancréas.
4. Continuez à travailler vers le bas l'intestin grêle pour le tissu conjonctif rose. À ce stade, ramasser de l'intestin grêle près de son point d'attache à l'estomac et le pancréas couper l'écart du reste de l'intestin grêle. Remarque: Veillez à ne pas couper le pancréas comme il peut commencer à se dégonfler.
5. Saisir délicatement la partie du pancréas attachés à l'estomac avec une pince (pince plats qui fonctionnent le mieux). Tout en tirant doucement sur le pancréas, utiliser la courbeciseaux pour couper d écart au niveau des connexions entre le pancréas et de l'estomac.
6. Localiser la rate et maintenez-le avec la pince au-dessus du pancréas. Prenez les ciseaux courbes et couper les liens entre la rate et le pancréas.
7. Trouver l'endroit où le pancréas est attaché au gros intestin. Décrochez le gros intestin avec une pince et utiliser la pointe des ciseaux à pointer à travers. Etaler les ciseaux de l'autre que, avant de générer un décalage entre le gros intestin et le pancréas.
8. Retarder le gros intestin avec une pince: cela se traduira par le pancréas avalée, en exposant ses connexions précises dans le gros intestin. Snip loin les connexions restantes.
9. Trouver le tissu conjonctif rose attaché à le pancréas et l'intestin grêle et couper au plus près du pancréas que possible. Remarque: Si percer le pancréas est un problème, il est conseillé de couper plus proche de l'intestin grêle comme le tissu conjonctif sera filtré dans les étapes ultérieures.
10. Solrab autant du pancréas que possible et soulevez-le doucement. Avec des ciseaux courbes, couper les connexions restantes entre le pancréas et la cavité thoracique pour éliminer entièrement le pancréas. Remarque: Le pancréas doit toujours être gonflés si retiré correctement.
11. Stocker le pancréas prélevés dans ~ 2,5 ml de solution de collagénase dans un tube conique de 50 ml sur de la glace jusqu'à ce que toutes les autres pancréas ont été gonflé et retiré pour l'expérience.

7. Laver

1. Prendre toutes pancréas isolés et les déplacer à séparer 50 ml tubes coniques contenant chacun 25 ml de solution de collagénase frais
2. Placez les 50 ml tubes coniques en position verticale dans un 37 ° C en secouant bain d'eau capable d'osciller à 220-250 rpm, avec le shaker éteint.
3. Gazer chaque tube conique de 50 ml avec 95% O _2/5% CO ₂ pendant 5 min avec une pipette Pasteur.
4. Refermer chaque tube hermétiquement et placer sur le côté dans l'eau en secouantbain en dessous de la surface de l'eau. Secouez à 220-250 rpm pendant 20 secondes, à chaque minute, à 16 min à partir de 6 min. (Agiter à 6, 8, 10, 12, 14, et 16 min)
5. Transférer immédiatement les tubes dans une centrifugeuse à température ambiante pour une rotation rapide. Apportez la centrifugeuse à 1500 tours par minute (400-500 g) et éteignez immédiatement.
6. L'utilisation d'un piège à vide, aspirer environ de 22,5 ml de la solution de collagénase, sans perturber le culot. Laver avec 10 ml de HBSS et vortex doucement pour briser le culot.
7. Effectuez une autre tour rapide à la température ambiante jusqu'à 1500 tours par minute (400-500 g).
8. Aspirer environ 10 ml de la solution, de nouveau sans perturber le culot.
9. Laver avec encore 10 ml de glace froide HBSS et vortex doucement pour briser une fois de plus le culot. Répétez les retombées et aspirer rapidement 10 ml de la solution.
10. Vortex doucement le culot dans 2,5 ml restants de solution HBSS. Verser la solution1.000 um maille dans un nouveau 50 ml tube conique. Cela permettra d'éliminer les débris de tissu grand pas digéré par la collagénase.
11. Rincer la vieille 50 ml tube conique avec 2,5 ml de glace froide HBSS. Utiliser une pipette Pasteur pour rincer les parois du tube à fond avant le transfert de la 2,5 ml de HBSS à travers les mailles dans les nouveaux 50 ml de tube conique.
12. Effectuez une autre tour rapide à la température ambiante à 1500 tours par minute (400-500 g) pour sédimenter le tissu.
13. Aspirer la totalité du HBSS en inclinant le tube vers le piège à vide. Remarque: Il est très important de ne pas perturber le culot, car cela entraînerait la perte d'îlots. Si la pastille est lâche ou commence à se déplacer vers le piège à vide, arrêter aspiration de la solution et re-sédimenter le tissu et puis continuer à aspirer la solution restante.
14. Une fois que la totalité du HBSS a été éliminée, ajouter 4,8 ml de solution de Ficoll à 25% et de vortex pour disperser le culot.
15. Couche avec précaution 2,4 ml de 2Solution de Ficoll 3% au-dessus de la solution de Ficoll à 25% par addition de la solution de 23% de Ficoll sur le côté du tube conique de 50 ml. Pour assurer une mise en couches, faire tourner le tube conique de 50 ml lors de l'ajout de la solution de Ficoll.
16. Répétez le processus de stratification pour 20,5% et les solutions de Ficoll 11%. Remarque: Si 4 couches distinctes ne sont pas présents, ajouter HBSS jusqu'à la marque de 50 ml et inverser le tube 4-6 fois ou jusqu'à ce que le gradient de Ficoll n'existe plus. Re-sédimenter le tissu et réessayer étapes 7.14 à 7.16.
17. Spin le tube conique de 50 ml à la température ambiante à 1820 tours par minute (800 g) pendant 15 min.
18. Verser tout le Ficoll 50 ml dans un tube frais conique, en ayant soin de laisser la pastille de tissu exocrine derrière. Ajouter de la glace froide HBSS jusqu'à la marque de 50 ml et inverser le tube 4-6 fois pour mélanger le Ficoll et HBSS ensemble.
19. Spin le tube conique de 50 ml à la température ambiante à 1820 tours par minute (800 g) pendant 5 min.
20. Aspirer délicatement la plupart du mélange HBSS / Ficoll en utilisant un tra videp. Ne pas perturber le culot qu'il est lâche et peut être aspiré facilement.
21. Prenez une pipette Pasteur et transférer le culot dans un tube de culture jetable.

8. Choisir îlots

1. Ajouter 5 ml de milieu de prélèvement (par exemple. RPMI 1640 ou Krebs Ringer Bicarbonate tampon) sur le tube de culture jetable. Remarque: Les médias cueillette varient en fonction des applications en aval.
2. Laissez les îlots se déposent au fond du tube de culture pendant 5 min. Les transférer à l'aide d'une pipette Pasteur à un 15 mm par 60 mm de polystyrène plat de Pétri. Remarque: Il est important d'utiliser une boîte de Pétri que ceux-ci ne sont pas traités et permettra d'éviter les îlots d'adhérer à l'antenne.
3. Dans un 15 mm séparée par 60 mm de polystyrène boîte de Pétri, ajouter 5 ml de la souris milieux de culture d'îlots (100 ml RPMI 1640 Stock médias, 10 ml inactivé par la chaleur FBS, 1 ml Pen / Strep; filtre stérilisés).
4. Avec l'aide d'une loupe binoculaire avec backligcapacité de ht, utiliser une pipette P-20 pour prendre les îlots dans la boîte de Pétri contenant îlot milieux de culture, en prenant soin d'éviter de transférer des débris de tissu acinaire. Lorsque rétro-éclairé, îlots apparaissent brun-or et leur membrane externe peuvent briller, tout en tissu acinaire apparaît en gris clair et terne. Si la préparation de l'îlot contient une grande quantité de débris, il est conseillé de sélectionner manuellement îlots à deux reprises dans un milieu frais. Réduire la contamination des débris limiter îlot agglutination après une nuit d'incubation. Ajout DNAse (3000 U / ml) dans le tampon de digestion peut aussi aider à limiter îlot agglutination (JWJ, observation personnelle). Remarque: Il est important de compter le nombre d'îlots isolés pour planifier des expériences en aval.
5. Incuber les îlots O / N dans un incubateur réglé à 37 ° C avec 5% de CO _2.

9. AMPc Assay

1. Étiqueter 1,7 ml microtubes de, un pour chaque répétition de l'essai. Remarque: des tests de camp doit avoir au moins duplicates pour chaque condition de traitement, mais plus de répétitions par traitement sont préférés.
2. Après dégazage du tampon bicarbonate de Krebs Ringer pendant 15 min avec 95% O _2/5% de CO ₂ avec la pipette de Pasteur, ajouter 0,5% de BSA de qualité RIA et une concentration de glucose finale de 1,7 mM (solution de pré-incubation). Puis, ajouter 1 ml de Krebs fraîchement gazés à chaque tube de centrifugeuse. Deux ml de Krebs est requis par tube pour les points de pré-incubation et le temps de traitement; mais il est recommandé de préparer au moins 5-10 ml supplémentaire.
3. Agiter les îlots au milieu de la boîte de Petri, et à l'aide d'une pipette P-20, la main-choisir les îlots à un nouveau 15 mm par 60 mm de polystyrène boîte de Pétri contenant 5 ml de la solution de pré-incubation à laver le milieu de culture contenant du glucose des îlots.
4. Le kit de dosage de l'AMPc utilisé est le GE Healthcare AMPc direct BioTrak EIE. Ledit protocole utilisé est une modification de celui décrit pour le "meas d'AMPc intracellulairesurement utilisant la procédure acétylation non EIA avec les nouveaux réactifs de lyse », et a été optimisé pour une utilisation avec le nombre minimum d'îlots par tube, ce qui permet une augmentation du nombre de conditions de traitement et les répétitions techniques. L'utilisation d'un P-20 pipette, le transfert d'au moins 13 îlots dans chaque tube de l'étape 9.2, le maintien de la cohérence entre les îlots taille des tubes, avec 1 ml de tampon de pré-incubation. Remarque: Augmenter le nombre de répétitions est plus bénéfique que le nombre d'îlots par tube. Toutefois, s'il ya suffisamment de îlots pour accroître le nombre d'îlots par tube uniformément, il est conseillé de le faire, jusqu'à 25-50 îlots par tube.
5. Avec les bouchons de tubes de micro ouvert, transférer dans un incubateur à 37 ° C fixé à 5% de CO ₂ et incuber pendant 45 min à normaliser la sécrétion de l'insuline de tous les îlots à un niveau de base.
6. Bien que les échantillons sont en période d'incubation, préparer les traitements (soit 8 mM, 11,1 mM, glucose mM 16,7, etc) dans le Krebs fr gazésom l'étape 9.2. dans 15 ml tubes coniques, avec 1 ml supplémentaire pour tenir compte de toute erreur de pipetage. Ajouter 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX) à une concentration finale de 200 uM. IBMX est un inhibiteur de la phosphodiestérase générale qui bloque la dégradation de l'AMPc, ce qui permet d'accumuler de l'AMPc dans la cellule telle qu'elle est produite. (Remarque:.. C'est un essai de production d'AMPc vrai Voir la section de discussion pour les cas où la mesure de la production d'AMPc peut-être pas souhaitable Si IBMX est exclu de l'analyse, plus îlots seront tenus par tube afin d'obtenir des données d'AMPc dans le plage linéaire de la courbe étalon).
7. Après la 45 min de pré-incubation, enlever les tubes à centrifuger de l'incubateur, casquette et d'impulsion vortex chaque échantillon (moins de 0,5 sec). Il s'agit de mélanger le gradient de l'insuline qui a été probablement généré en raison des îlots étant concentrés dans la partie inférieure du tube. Il faut prendre soin de ne pas trop durement vortex, car cela pourrait nuire à la stabilité de l'îlot (Note: Plafonnétubes avec îlots peuvent être légèrement effleuré ou inversés si il n'est pas possible d'impulsion vortex doucement. Ces options seront ajouter le temps de l'analyse, qui doit être considéré lors de la planification de l'expérience).
8. Transférer chaque tube à une centrifugeuse de paillasse (RT) et de spin jusqu'à ce que les îlots atteignent 10,000 rpm (7,000-7500 g) puis s'éteignent immédiatement.
9. Utiliser une pipette P-1000 pour éliminer la majeure partie du Krebs dans chaque tube de centrifugeuse, en laissant environ 10 à 15 ul de Krebs sur le culot d'îlots de Langerhans. Utiliser une pipette P-20 pour éliminer la partie la plus proche du culot de l'îlot. Si culot est perturbé, la pipette Krebs dans le tube et re-spin.
   (Remarque: Si l'expérimentateur trouve trop difficile à enlever tout le Krebs du culot îlot sans le déranger, le dernier 10-15 pi peut être laissé sur et pris en compte dans le volume total tard dans le protocole.
10. Obtenir une quantité suffisante de l'azote liquide dans un contenant isolé pour casser le gel des échantillons après incubation.
11. Prenez les échantillons de l'incubateur, casquette, vortex rapidement (moins de 0,5 sec) tourner les tubes à centrifuger dans une centrifugeuse de paillasse (RT) à 10 000 tours par minute (7,000-7500 g), puis immédiatement arrêté. Si l'insuline ou autre métabolite est une application en aval souhaitée, utiliser une pipette P-1000 pour recueillir une aliquote de milieu dans un tube de centrifugeuse et conserver à -20 ° C jusqu'à analyse plus approfondie. Si le support de stimulation ne sont pas recueillies, il peut être mis au rebut.
    (Remarque: IBMX une forte potentialisation de la sécrétion d'insuline stimulée par le glucose (GSIS) Par conséquent, les résultats obtenus à partir de GSIS milieu de stimulation de l'AMPc peuvent ne pas représenter exactement le véritable effet des traitements spécifiques sur GSIS, surtout si ces effets sont subtils.).
12. Répétez l'étape 9.9 pour enlever le plus moyen de stimulation que possible sans perturber le culot d'îlots. Aligner geler le culot d'îlots dans l'azote liquide une fois qu'il ya moins de 10-15 pi de Krebs à gauche sur la pastille d'îlots. Une fois toutes leséchantillons ont été congelés pression, conserver à -80 ° C jusqu'à la mesure de l'AMPc.
13. Le jour de la détermination de l'AMPc, de préparer les nouveaux réactifs de lyse selon le protocole du fabricant. Ajouter 200 ml lyse réactif 1B pour chaque tube de centrifugeuse et tourbillon à la vitesse supérieure pendant 30 sec. Laissez les tubes sont assis sur la glace pendant 10 min, vortex toutes les 2 min 30 sec. (Remarque: Le protocole recommande de procéder à une analyse microscopique au bleu trypan pour assurer la lyse cellulaire, mais ce n'est pas effectuée pour des îlots).
14. Préparer les normes de travail et de mettre en place la microplaque EIA exactement comme décrit dans le protocole du fabricant. Après que le substrat de l'enzyme a été incubée avec la microplaque pendant 30 min, réaliser l'étape 1.0 M d'acide sulfurique en option, et déterminer l'absorbance des puits de la microplaque à 450 nm en utilisant un lecteur de microplaque.
15. Résultats d'AMP cyclique seront comptabilisés comme fmole / bien. Cela devrait être normalisée pour le volume total de l'échantillon d'origine (200 pi + touteKrebs résiduel laissé sur les îlots de l'étape 9.9). Ensuite, les résultats peuvent soit être normalisées pour le nombre total d'îlots, donnant fmol AMPc produite / îlot, ou des échantillons de lysat peut être soumis à l'acide bicinchoninique de dosage (BCA) des protéines de normaliser les résultats de la protéine cellulaire totale (donnant protéine fmol / ug) . Ce dernier est recommandé lorsque la taille des îlots sont incompatibles entre les échantillons, et peut être un substitut pour la taille des îlots. Le kit de dosage de protéines BCA de Pierce a été utilisé avec succès dans ce protocole, et ne nécessite que 25 ml d'échantillon. Les normes BSA devraient être préparés dans la lyse réactif 1B du kit de dosage de l'AMPc.

Résultats

Pour assurer un rendement élevé au cours de l'isolement des îlots, des techniques chirurgicales décrites dans le protocole devraient être suivis de près. Bien que les techniques présentées ici seront adaptés à chaque laboratoire, il ya quelques étapes essentielles qui conduiront à un isolement réussi. Afin de rendre le canal cholédoque facilement accessible, il est recommandé que les organes soient déplacés vers le côté droit de la souris (Figure 1). En outre, cela permettra le pa...

Discussion

Avec la prévalence du diabète devrait affecter 7,7% de la population mondiale, l'exigence de nouvelles techniques de recherche est impératif à la fois comprendre et traiter le diabète ^18. L'isolement des îlots présente est un protocole bien établi utilisés pour l'expérimentation in vitro et a été présenté précédemment, avec de légères modifications ^11,14,16. Bien que la sécrétion d'insuline est une application en aval commun pour des îlots isolés, en s...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase from Clostridium histolyticum suitable for isolating active islets	Sigma-Aldrich	C7657
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F9378
Hanks Balanced Salt Solution 10X	Invitrogen (Gibco)	14065-056
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
RPMI 1640 (powder)	Invitrogen (Gibco)	31800-022
Albumin from Bovine Serum (BSA)	Sigma-Aldrich	A7888
3/0 Silk Suture Thread	Fine Science Tools	18020-30
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10
0.8 mm Forceps	Fine Science Tools	11050-10
Curved Scissors	Fine Science Tools	14061-10
Vannas-Tübingen Spring Scissors - Straight/Sharp/8.5 cm/5 mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15003-08
Dissecting Scissors	Fine Science Tools	14002-14
5 ml BD Luer-Lok Syringe	BD	309646
1 ml BD syringe	BD	309628
30 G BD Needle 1/2" Length	BD	305106
27 G BD Needle 1/2" Length	BD	305109
Sharpening Stone	Fine Science Tools	29008-01
2-2-2-tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402-25G
2-methyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	240486-100mL
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Monopotassium Phosphate (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P0662
Sodium Bicarbonate (NaCHO3)	Sigma-Aldrich	S6014
CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3881
MgSO4·7H2O	Sigma-Aldrich	M9397
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen (Gibco)	15140-122
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS)	Fisher Scientific	SH30088.03HI
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Sigma-Aldrich	5879-100MG