Détermination de l'activité enzymatique microbienne extracellulaire dans les eaux, les sols et les sédiments de haut débit microplaques dosages

Résumé

procédures de microplaques sont décrites pour l'analyse colorimétrique ou fluorimétrique de l'activité enzymatique extracellulaire. Ces procédures permettent l'analyse rapide d'une telle activité dans un grand nombre d'échantillons de l'environnement dans un laps de temps raisonnable.

Résumé

Une grande partie du cycle des éléments nutritifs et la transformation du carbone en milieu naturel se produit grâce à l'activité des enzymes libérées par les micro-organismes extracellulaires. Ainsi, la mesure de l'activité de ces enzymes extracellulaires peut donner un aperçu des taux de processus au niveau de l'écosystème, telles que la décomposition de la matière organique et la minéralisation de l'azote ou du phosphore. Des dosages de l'activité enzymatique extracellulaire dans des échantillons environnementaux impliquent typiquement l'exposition des échantillons à des substrats colorimétriques ou fluorométriques artificiels et suivant le taux de l'hydrolyse du substrat. Nous décrivons ici microplaques basé méthodes de ces procédures qui permettent l'analyse d'un grand nombre d'échantillons dans un court laps de temps. Les échantillons sont laissés à réagir avec des substrats artificiels à l'intérieur de microplaques de 96 puits ou de puits profond blocs de microplaques, et l'activité enzymatique est ensuite déterminée par absorption ou de fluorescence du produit final résultant de l'utilisation d'un reade microplaque typiquer ou fluorimètre. Ces procédures à haut débit non seulement de faciliter les comparaisons entre les sites ou les écosystèmes séparés spatialement, mais aussi de réduire sensiblement le coût de ces tests en réduisant les volumes globaux de réactifs nécessaires par échantillon.

Introduction

Les micro-organismes tels que les bactéries et les champignons d'obtenir les nutriments et de carbone à partir de composés organiques complexes, grâce à la production d'enzymes extracellulaires. Ces enzymes hydrolysent typiquement des polymères en sous-unités plus petites qui peuvent être prises dans la cellule. Par conséquent, au niveau écologique, ces enzymes extracellulaires microbiennes sont en grande partie responsables de la minéralisation des éléments nutritifs et de la décomposition de la matière organique qui se produit dans les milieux naturels. Des enzymes telles que la cellobiohydrolase (CBH), β-glucosidase et sont importants pour la dégradation de la cellulose et de travail à l'unisson pour catalyser l'hydrolyse de la cellulose en glucose ^1,2, ce qui donne un substrat de carbone utilisables pour l'absorption et l'assimilation microbienne. La phosphatase enzyme libère solubles groupes phosphates inorganiques de organophosphates, essentiellement de minéralisation du phosphate et de la rendre disponible pour une utilisation par la plupart des organismes ^3. D'autres enzymes, telles que la N-acétylglucosaminidase (NAGase), sont important dans la dégradation de la chitine et peut faire à la fois du carbone et de l'azote disponible pour l'acquisition microbienne ^4.

Une des procédures pour le dosage de l'activité enzymatique extracellulaire microbienne dans les milieux naturels est l'utilisation d'artificiel p-nitrophényl (p NP) des substrats liés, une approche qui a été initialement développé pour détecter sol activité de la phosphatase ^5. Cette approche repose sur la détection d'un produit final coloré, le p-nitrophénol, qui est libéré lorsque le substrat artificiel est hydrolysé par l'enzyme appropriée. Le p-nitrophénol peut ensuite être quantifié par colorimétrie en mesurant son absorbance à environ 400-410 nm. Cette méthode a depuis été appliquée pour détecter d'autres enzymes telles que la NAGase ^6, et a été utilisé dans diverses études portant sur ​​l'activité enzymatique extracellulaire microbienne dans les sols et les sédiments ^9.7.

Une approche alternative qui était originally développé pour évaluer l'activité glucosidase extracellulaire dans les milieux aquatiques ^10,11 rend l'utilisation de 4-méthylumbelliférone (IUM) substrats liés. Le produit final libéré (4-méthylumbelliférone) est hautement fluorescent et peut être détectée en utilisant un fluorimètre avec un paramètre d'excitation / émission d'environ 360/460 nm. Une variété de substrats artificiels MUB-liés sont disponibles, permettant la mesure fluorométrique de l'activité d'au moins autant d'enzymes (par exemple β-glucosidase, la cellobiohydrolase, NAGase, phosphatases) que l'on peut doser à l'aide de la procédure colorimétrique de NP-substrat p. D'autres enzymes extracellulaires microbiens, tels que la leucine aminopeptidase de la protéine dégradant, peuvent être analysés par fluorimétrie à l'aide de 7-amino-4-méthylcoumarine (CUO) des substrats liés. Les deux MUB et substrats COU-liés ont été utilisés pour déterminer l'activité enzymatique dans divers échantillons terrestres et aquatiques ^12,13.

Bien que des études antérieures ont descrmicroplaque fluorimétrique ou colorimétrique ibed approches pour déterminer l'activité enzymatique extracellulaire ^14, il ya un besoin pour une présentation claire de la façon de mener de tels essais. Ici, nous démontrons les procédures pour la conduite des techniques à haut débit de microplaques pour l'analyse de l'activité enzymatique extracellulaire dans les sols et les sédiments à l'aide de l'approche colorimétrique p substrats de NP-lié et dans les eaux naturelles en utilisant la technique des substrats MUB-Linked Fluorescent. Nous nous concentrons sur la mesure des activités de β-glucosidase, NAGase, et phosphatase que ces enzymes peuvent être liées au carbone, l'azote et le cycle du phosphore, respectivement. Cependant, les modes opératoires décrits ici peuvent être appliqués à la mesure d'autres enzymes extracellulaires en utilisant différents substrats artificiels.

Protocole

Colorimétrique Analyse des extracellulaire activité enzymatique dans les sols et les sédiments

Une. Préparation du substrat et solutions tampons pour les analyses colorimétriques de l'activité enzymatique

1. H préparer tampon acétate 50 mM (pH 5,0 à 5,5), en mélangeant 50 ml de 0,1 M d'acide acétique (2,87 ml d'acide acétique glacial dans 500 ml d'eau), 150 ml de 0,1 M d'acétate de sodium et 200 ml d'eau distillée ₂ O. Ajuster le pH à 5,0 à 5,5 avec 0,1 M d'acide acétique, si nécessaire.
2. Préparer une solution de 1 M d'hydroxyde de sodium (NaOH) dans l'eau distillée ₂ O.
3. Préparer des solutions de substrat de NP lié p dans 50 mM de tampon acétate. Pour doser la phosphatase préparer 5 mM p NP-phosphate dans 50 mM de tampon acétate, pour doser β-glucosidase préparer 5 mM p NP-β-glucopyranoside, pour doser NAGase préparer 2 mM pNP-β-N-acétyl-glucosaminide. Préparer toutes les solutions de substrat dans stériles 15 ml ou 50 ml tubes de centrifugation. Les solutions peuvent être stockées à 4 ° C pendant 2 à 3 semaines.

2. Détermination d'une norme pour convertir l'absorbance à p NP Concentration

1. Préparer des solutions standard de p-nitrophénol dans 50 mM de tampon acétate. Les concentrations devraient varier de 0,025 à 1 mM.
2. Transfert trois répétitions de 100 pi de chaque concentration à une microplaque de 96 puits clair. Ajouter 10 ul de NaOH 1 M et 190 ul de H ₂ O distillée à chaque puits.
3. absorbance record à 410 nm en utilisant un lecteur de microplaques.
4. Concentrations se multiplient dans la courbe standard par 0,3 pour obtenir micromoles p NP par 300 volume de réaction ul. Tracer la courbe d'absorbance en fonction pmol de p NP. La pente de la courbe sert de facteur de conversion (C) qui se rapportent à l'absorbance umole de p NP dans chaque réaction enzymatique.

3. Conduite de l'Enzyme Assay

1. Pour le sol, préparer une suspension de chaque échantillon à analyser dans un 15 ml tube à centrifuger stérile à une concentration d'environ 1 g / ^ml-1 en utilisant 50 mM de tampon acétate. Pour les sédiments, ajouter un tampon d'acétate assez pour faire la bouillie facilement pipettable. Le volume exact de bouillie nécessaire variera en fonction du nombre d'enzymes testés, mais un minimum de 5 ml est recommandé. Vortex chaque suspension jusqu'à ce que toutes les mottes de terre ou les sédiments se sont dispersés et noter le volume final.
2. Re-vortex chaque suspension et la pipette juste 150 pi dans chacun des six puits sur un bloc de 96 puits deepwell (Figure 1). Il est important de vortex complètement et fréquemment afin de maintenir les particules de sol en suspension. Laisser au moins deux puits par bloc vide pour servir de contrôle de substrat. Remarque: clip la fin de pointes de pipettes avec des ciseaux avant de pipetage comme les boues, ont tendance à obstruer conseils. Préparer un bloc à 96 puits pour chaque enzyme à doser.
3. Verser environ 5 ml de tampon acétate dans un réservoir de pipette et en utilisant une pipette à 8 canaux d'ajouter 150 ul du tampon à la last deux puits de chaque échantillon (ce seront des contrôles de tampon échantillon) et les deux puits de contrôle de substrat (Figure 1)
4. Verser environ 10 ml de la solution de NP-substrat p appropriée dans un réservoir de pipette et en utilisant une pipette à 8 canaux d'ajouter 150 ul de la solution de substrat pour les quatre premiers puits de chaque échantillon et les deux puits de contrôle de substrat (Figure 1). Noter le temps que la réaction commence dès que la solution de substrat est ajouté.
5. Incuber les plaques à température ambiante (22 ° C) pendant 0,5-4 h. Temps d'incubation exacte varie en fonction du niveau d'activité dans les échantillons et l'enzyme à doser. Pour la plupart des sols et des sédiments, de la phosphatase et de β-glucosidase nécessitent des temps d'incubation de 0,5 à 1,5 heures, tandis que la NAGase et d'autres enzymes nécessitent des temps d'incubation de> 2 h.
6. Bien que des essais sont en période d'incubation préparer clair microplaques de 96 puits à l'absorbance. Préparer une microplaque pour chaque bloc deepwell (c'est à dire pour chaque enzyme dosé). Introduire à la pipette 10 ul de NaOH 1 M et 190 ul d'eau distillée dans chaque puits de la microplaque. Remarque: NaOH ralentit la réaction enzymatique et augmente le pH qui améliore la couleur de la NP p libéré pendant la réaction.
7. Après incubation, centrifuger les blocs de 96 puits à 2000-5000 x g pendant 5 min pour sédimenter les particules du sol.
8. Utilisez une pipette multicanaux de retirer 100 pi de chaque puits, en veillant à éviter le culot, et le transférer dans le puits correspondant à préparé microplaque de 96 puits clair.
9. Allumez le lecteur de microplaques et mettre en place les logiciels nécessaires. absorbance record à 410 nm. Si l'absorbance d'un bien donné est au-dessus de la limite de détection linéaire du lecteur de plaques, diluer ainsi que 1:01 avec de l'eau et re-mesure. Si l'absorbance est encore trop élevé, le test doit être répété avec un temps d'incubation plus courte.

4. Détermination de la masse sèche des échantillons

1. Introduire à la pipette 1 ml de chaque sampl e bouillie dans une casserole en aluminium préalablement pesée.
2. Sécher dans une étuve de séchage à 75 ° C pendant 48 h et peser. Soustraire le poids de la cuve à partir de cette valeur pour obtenir la masse sèche du sol ou de sédiment dans 1 ml de la suspension. Multiplier par un facteur de 0,15 pour déterminer la masse sèche de l'échantillon dans les 150 ul ajoutés à chaque puits dans le dosage d'enzyme.

5. Calcul de l'activité enzymatique par masse sèche de sol ou les sédiments

1. Calculer l'absorbance finale de chaque échantillon en soustrayant l'absorbance de l'échantillon de contrôle à partir de l'absorbance de l'échantillon d'essai. Si les contrôles de substrat ont une forte absorption (environ> 0,060) alors soustraire ceux aussi.
2. Calcul de l'activité enzymatique en pmoles hr ^{-1 -1} g de matière sèche à partir de l'équation:

l'activité de l'enzyme = absorbance finale / (C x temps d'incubation x échantillon masse sèche)

Analyse fluorescent de extracellulaire activité enzymatique dans les eaux naturelles

TLE "> 1. Préparation du support, Standard et solutions tampons pour analyses fluorométriques de l'activité enzymatique

1. Préparer 200 uM des solutions de substrats MUB-liés (par exemple 4-MUB-β-glucopyranoside, le 4-MUB-phosphate, le 4-MUB-N-acétyl-β-D-glucosaminide) en dissolvant le substrat approprié dans stérile (autoclavée) distillée H ₂ O dans 15 ml stériles ou 50 ml tubes de centrifugation. Enveloppez tubes en papier d'aluminium pour exclure la lumière et stocker au réfrigérateur avant de l'utiliser. Les substrats doivent être stables pendant au moins 1 semaine si elles sont stockées de cette manière.
2. Préparer une norme MUB en faisant une solution stock de 100 uM 4 méthylumbelliférone dans de l'eau distillée stérile ₂ O. Conserver au réfrigérateur dans de l'ambre ou bouteille en aluminium gainé. Immédiatement avant utilisation, diluer la solution 100 uM d'actions par 1/10 en H ₂ O stérile pour obtenir une solution de travail de 10 uM pour les dosages enzymatiques.
3. Préparer une solution stock de tampon de bicarbonate 100 mM en dissolvant 8,4 g de NaHCO _{3 en 1 LH 2 O et autoclave. Diluer cette solution mère 1/20 en H 2 O stérile si nécessaire pour obtenir une solution de travail de 5 mm pour les dosages enzymatiques.}

2. Organiser des échantillons d'eau sur un 96 puits noir microplaques

1. Organiser une microplaque pour chaque enzyme suivant l'exemple représenté sur la figure 2. Notez que pour permettre la réplication adéquat, des normes et des contrôles, cette procédure peut doser l'activité d'une enzyme unique pour un maximum de neuf échantillons d'eau sur une microplaque à 96 puits noir.
2. Verser environ 5 ml du premier échantillon dans un réservoir de pipette et utiliser une pipette à 8 canaux à pipette200 ul dans tous les puits de la colonne 1 de la microplaque (s). Jeter les embouts de pipette neufs et répéter au besoin pour chaque échantillon d'eau pour remplir les colonnes 1-9.

3. Mise en place d'échantillon, Standard, prend goût, et des contrôles de substrat

1. Mettre en place des contrôles pour tenir compte des échantillons, standardss, et le substrat de trempe sur la même microplaque noire que les échantillons (Figure 2).
2. Contrôles exemples contiennent de l'eau de l'échantillon et le tampon bicarbonate, et ne sont pas utilisées dans les calculs d'activité mais démontreront lecture cohérence tout au long de l'expérience. Les contrôles de trempe sont constitués d'eau de l'échantillon et une quantité standard de l'étiquette fluorescente et sont utilisés pour mesurer la diffraction de la fluorescence dans l'eau de l'échantillon. Substrat et contrôles standard sont constitués de tampon de substrat soit lié ou le marqueur fluorescent standard, respectivement, et le bicarbonate.
3. Verser environ 5 ml de 5 mM de tampon de bicarbonate dans un réservoir de pipette propre. Pipette 50 ul de tampon dans les puits de la microplaque de 1 à 9 dans les lignes D et E pour former deux puits réplicats de commandes d'échantillon par échantillon. Changer d'embout de pipette puis transférer 200 pi de tampon bicarbonate de puits 10 à 12 dans les lignes A et H.
4. Réduisez l'éclairage ambiant par gradation ou d'éteindre lipo ds que la norme fluorescent est sensible à la lumière.
5. Verser environ 5 ml de 10 pM de 4-méthylumbelliférone dans un réservoir de pipette propre. Pipette 50 ul dans les puits de la microplaque de 1 à 12 dans la ligne H, et dans les puits 1 à 9 dans les lignes G et F pour former trois répétitions de contrôles de trempe par échantillon et l'ensemble des contrôles standard. Soit placer la microplaque dans l'obscurité ou couvrir avec un couvercle opaque pour réduire la dégradation de la lumière MUB.
6. Allumez le fluorimètre et mettre en place les logiciels nécessaires pour être prêt à lire avant d'ajouter le substrat. Note: certaines ampoules fluorimètre peuvent nécessiter un temps d'échauffement de 3 minutes ou plus.
7. Verser environ 5 ml de substrat approprié MUB-lié (par exemple 4-MUB-phosphate) dans un réservoir de pipette propre. Utilisez une pipette 12 canaux à la pipette 50 ul dans les puits de la microplaque de 1 à 12 dans la ligne A, et dans les puits 1 à 9 dans les lignes B et C pour former trois essais répétés pour chaque échantillon et trois contrôles de substrat. Immediately passez à l'étape 4.1, fluorescence d'enregistrement.

4. Fluorescence enregistrement

1. Lire la fluorescence initiale immédiatement après l'addition de substrat à la microplaque. Après la lecture de la fluorescence, incuber la microplaque à température ambiante (22 ° C), soit dans le noir ou recouvert d'un couvercle opaque pour réduire la dégradation de la lumière MUB.
2. Le temps d'incubation nécessaire pour mesurer l'activité enzymatique maximale possible dans un échantillon d'eau va dépendre de la concentration d'enzyme dans l'échantillon. Etant donné que ce n'est pas connue avant le dosage est terminé, la microplaque devra être lu à intervalles de temps multiples. Typiquement, la lecture à des intervalles de 10-15 minutes au cours de 1 h est acceptable pour de nombreuses enzymes, bien que les échantillons avec une activité très élevée pour certaines enzymes peuvent culminer avant 10 min.
3. Continuer la lecture de fluorescence dans la microplaque à vos intervalles désignés pendant au moins 1 heure. Soyez sûr de garder la microplaque couvert ou dans l'obscurité entre la lectures.

5. Calcul de l'activité enzymatique par volume d'eau

1. Pour chaque échantillon à chaque intervalle de temps de calculer les: fluorescence moyenne de l'échantillon initial (puits D et E), la fluorescence de l'échantillon final moyen (puits AC), la fluorescence moyenne standard (puits H10-11), et la moyenne étancher fluorescence de contrôle (puits FG).
2. Pour chaque intervalle de temps, calculer l'activité enzymatique en nmoles ml ^-1 h ^-1 à partir de l'équation:

l'activité de l'enzyme = (fluorescence moyenne de l'échantillon - fluorescence moyenne de l'échantillon initial) / ((fluorescence moyenne / 0,5 mole) x standards (moyenne étancher fluorescence de contrôle / moyenne de fluorescence) x standards (0,2 ml) x (temps en h))

3. Examiner les valeurs de l'activité calculée pour chaque pas de temps. Déterminer l'activité de potentiel final de l'étape de temps avec la plus forte activité. Si les valeurs d'activité continuent d'augmenter alors pas de temps plus tard, peuvent être nécessaires, si les valeurs d'activité tombent Throughout cours de l'exécution, puis exécutez à nouveau avec plus courts intervalles de temps. Dernière activité est en nmoles de substrat consommée h ^-1 ml ^-1, mais peut être étendu à exprimer comme micromoles h ^-1 L ^-1.

Résultats

Les sols et les sédiments aquatiques ont généralement des niveaux appréciables d'activité enzymatique extracellulaire par suite des communautés microbiennes joints (biofilms) se développant sur ​​la surface des particules. Figure 3 montre comment cette activité varie en fonction de la taille des particules obtenues à partir du sédiment de surface d'une troisième courant de l'ordre dans le nord du Mississippi, États-Unis. Une étude antérieure a montré que les communautés b...

Discussion

Détermination de l'activité d'une variété d'enzymes extracellulaires microbiennes dans les sols et les sédiments peut fournir des indications utiles sur les taux de minéralisation des éléments nutritifs et de matière organique traitement ^17. Cependant, les sols peuvent varier dans leurs niveaux d'humidité, il est donc important de normaliser l'activité de sol poids sec. Cela nécessite une étape de séchage supplémentaire (typiquement de deux jours) au-delà de la simple mesur...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS AND MATERIALS
Glacial acetic acid			Various suppliers
Sodium acetate			Various suppliers
Sodium hydroxide			Various suppliers
p-Nitrophenol	Fisher	BP612-1	Alternates available
p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate	Sigma	N3234	pNP-substrate
pNP-β-glucopyranoside	Sigma	N7006	pNP-substrate
pNP-β-N-acetylglucosaminide	Sigma	N9376	pNP-substrate
Clear 96-well microplates	Fisher	12-563-301	Alternates available
96-well deep well blocks	Costar	3958	Alternates available
Aluminum weigh pans			Various suppliers
Sterile 15 ml centrifuge tubes			Various suppliers
Sterile 50 ml centrifuge tubes			Various suppliers
4-Methylumbelliferone	Sigma	M1381
4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate	Sigma	M8883	MUB-substrate
4-MUB-glucopyranoside	Sigma	M3633	MUB-substrate
4-MUB-N-acetylglucosaminide	Sigma	M2133	MUB-substrate
Sodium bicarbonate			Various suppliers
Black 96-well microplate	Costar	3792
Pipette reservoir			Various suppliers
EQUIPMENT
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge rotor	Eppendorf	A-4-81	For microplates/deep-well blocks
Microplate reader	BioTek	Synergy HT	Alternates available
Microplate fluorometer	BioTek	FLx 800	Alternates available
8-channel pipettor			Various suppliers