Mesure de la tension de sortie Pendant Laser Induced Axon lésion axonale évaluer l'adhésion au substrat à piconewton et Millisecond Résolution

Résumé

Nous avons mesuré la sortie de tension dans un axone qui a été partiellement lésé avec un dissecteur laser en mesure de spectroscopie de force simultanées effectuées sur une sonde optiquement piégé collée à la membrane de l'axone. Le protocole expérimental développé évalue l'adhérence des axones au substrat de culture.

Résumé

La formation des connexions fonctionnelles dans un réseau de neurones en développement est influencée par des signaux extrinsèques. La croissance des neurites des neurones en développement est soumis à des signaux chimiques et mécaniques, et les mécanismes par lesquels il détecte et réagit aux signaux mécaniques sont mal compris. L'élucidation du rôle des forces dans la maturation des cellules permettra à la conception des échafaudages qui peut favoriser l'adhérence cellulaire et l'accouplement du cytosquelette au substrat, et donc d'améliorer la capacité de différents types de neurones pour régénérer après une blessure.

Ici, nous décrivons une méthode pour appliquer des mesures de spectroscopie de force simultanés pendant lésion cellulaire induite par laser. Nous mesurons relâchement de la tension dans l'axone partiellement lésé par simultané suivi interférométrique d'une sonde optique piégé adhéré à la membrane de l'axone. Notre protocole expérimental détecte le relâchement de la tension avec sensibilité piconewton, et la dynamique de la libération de tension aurésolution de la milliseconde. Par conséquent, il propose une méthode à haute résolution pour étudier comment le couplage mécanique entre les cellules et les substrats peut être modulée par un traitement pharmacologique et / ou par des propriétés mécaniques distinctes du substrat.

Introduction

La microscopie optique est l'un du système de formation d'image moins invasive disponible pour observer les cellules vivantes. Avec l'exploitation des effets tels que la pression de radiation (comme pinces optiques ^1), ou flux de photons de haute énergie (comme dans dissection laser ^2), cette technologie a été étendue aux nano-manipulation. Le système d'imagerie optique fournit un contrôle précis de visualiser et de manipuler les cibles cellulaires sous ^3. Dans le même temps, grâce à l'étalonnage précis de la puissance du laser livré, outils optiques accomplir soit la manipulation de l'échantillon mou ou invasive avec une reproductibilité sans précédent.

Plusieurs laboratoires intégrés, dans le même dispositif expérimental, pinces optiques et dissecteur laser afin de réaliser l'ablation organites ^4, à fusionner les différentes cellules ^5, ou pour stimuler les cellules par entraîné optiquement cargaisons ^6,7. Bien pinces optiques, après étalonnage de la rigidité optique, permettent dele contrôle de la force appliquée à la cellule sur une échelle piconewton, les systèmes de dissection laser peut moduler la manipulation optique, qui va de la membrane photo-ration à l'ablation des organites simples ou dissection des structures sub-cellulaires. Cependant, l'étalonnage de dissection laser repose sur l'évaluation qualitative de l'entité de manipulation optique par rapport à l'énergie fournie à l'échantillon, principalement basée sur l'analyse d'images illustrant les changements morphologiques dus à l'échantillon ^8. Dans la méthode présentée, nous montrons comment effectuer la mesure de la spectroscopie de force au cours de la dissection axonale laser d'un neurone en développement, pour quantifier, sur l'échelle piconewton, la force produite par un équilibre altération de la structure du cytosquelette d'un compartiment subcellulaire ^9. Des neurones en culture adhèrent au substrat, et polarisent au cours du développement. La phase de polarisation se produit durant les cinq premiers jours in vitro. À la deuxième étape de la polarisation, l'un des Extrudment neurites est long, et il faudra différencier pour devenir l'axone ^10. Élongation des axones en réponse à la force de traction au niveau du cône de croissance a déjà été modélisé par le modèle de Dennerl ^11. Récemment, ce modèle a été étendu pour inclure ¹² le rôle de l'adhésion neurites sur les substrats de la matrice extracellulaire. Ce modèle biophysique, proposé après les observations expérimentales ^13, a montré que les forces de traction sur le cône de croissance, se propageant le long de la neurites, sont modulés par des adhérences focales au substrat. De même, lésion axonale produit une libération locale de tension se propageant en direction du corps de la cellule. Ainsi, nous avons proposé que la mesure de cette tension libérée dans un emplacement le long de l'axone entre la lésion et le corps cellulaire offre la possibilité d'évaluer l'issue d'amortissement des adhésions focales ne sont pas touchés.

Nous calibrer l'énergie nécessaire photons flux de la dissection laser pour contrôler l'étendue de l'avarie de axonale infligéee, de la section complète de la lésion partielle. Après la calibration, nous avons répété lésion partielle des axones des neurones plusieurs différenciation et développé le protocole de quantifier le relâchement de la tension, et obtient ainsi un paramètre quantitatif pour estimer l'adhérence de l'axone au substrat ^14.

Dans le présent travail, nous décrivons en détail le protocole mis au point, ce qui représente une procédure expérimentale précise pour évaluer et comparer avec sensibilité piconewton l'adhésion axonale au substrat dans différentes conditions expérimentales telles que le traitement chimique ^14, ou différents types de support de culture cellulaire.

Protocole

1. Configuration optique

Le système optique entier a été décrit précédemment ^15. En bref, le système pinces optiques est basé sur une onde continue ytterbium (CW) fibre laser fonctionnant à 1064 nm (IPG Laser GmbH). Un modulateur spatial de lumière (SLM) (LCOS-SLM, modèle X10468-07 - Hamamatsu) fait varier la phase du faisceau laser IR entrant pour commander la position de la tache de focalisation de piégeage sur la boîte de culture par ordinateur hologrammes générés. Les Blue-pinces logiciels (lien web sur la table de l'équipement) hologrammes générés librement disponibles projetées sur le modulateur spatial de lumière. L'interféromètre pour les mesures de spectroscopie de force reposait sur une photodiode à quatre quadrants (DOU, S5980 avec C5460SPL 6041 board - Hamamatsu) et une photodiode (PD, PDA100A-EC - Thorlabs).

La source de dissection laser pulsé est un sous-nanoseconde Nd UV: YAG à 355 nm (PNV-001525-040, POWERCHIP nano-Pulse laser UV - Teem Photonics). Un modulateur acousto-Modulateur optique (MQ110-A3-UV, 355 nm, la silice fondue-AA-opto-électronique) contrôle la puissance du laser UV directement à l'échantillon.

La pincette optique holographique et le laser micro-dissecteur sont intégrés sur un microscope droit modifié (BX51 - Olympus) équipé d'un 60X, 0,9 NA eau trempage étape objective.The du microscope se compose d'un trois-axes linéaires moteur à courant continu de micro-positionnement Système (M-126.CG1, Physique-Instruments) portant une piézoélectrique étape de nano-positionnement à 3 axes séparés (P-733.3DD, Physique-Instruments) pour combiner le mouvement grossier de l'échantillon avec la résolution inférieure au nanomètre de l'élément piézo- étape. Le système de la platine du microscope est équipé de deux boucles de régulation agissant en synergie pour maintenir le point de mise au point de piégeage à la bonne position, en fonction du mode de fonctionnement sélectionné (ou position de serrage de la main, statique ou dynamique) ^16. En particulier, une boucle de rétroaction interne agit sur un étage piézo-électrique, pour garder la perle à la sélectioned distance du centre du piège. L'autre boucle externe commande la position de la platine motorisée pour exploiter la région couverte par l'actionneur piézo-électrique sur une surface plus grande que sa course disponible ^17. Lorsque l'élément piézo-phase atteint la limite de la course disponible dans une direction, la boucle externe déplace le micro-étape dans la direction opposée, donc l'élément piézo récupère vers sa position centrale, car elle suit le bourrelet emprisonné collée à l'échantillon. Lorsque l'élément piézo-stade atteint la position centrale de sa gamme de cours, le micro scène arrêtée. D'autres détails du système sont présentés dans Guiggiani et al ^16,17.

Un dispositif à effet Peltier (QE1 chauffage résistif avec commande de chauffage à deux canaux TC-344B - Warner Instruments) contrôle la température de la culture de cellules sous un microscope (37 ° C). Dans la culture, le pH et l'humidité ont été maintenus à des conditions physiologiques en aérant un polydiméthyle conçu sur mesuresiloxane (PDMS) manchon (intégration de l'objectif de microscope) avec humidifié carbogène (95% _O2, 5% _CO2).

2. Culture cellulaire Préparation

Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le ministère italien de la Santé. Les cultures primaires ont été obtenus à partir de l'hippocampe de souris (C57BL6J, Charles River) au jour embryonnaire 18 (E18).

1. Les neurones ont été étalées à une concentration de 25.000 cellules / ml à fond de verre boîtes de Pétri (P35G-0-14-C - Matek Corporation). La faible concentration des cellules en culture est nécessaire pour éviter la formation d'un réseau dense dès les premiers jours in vitro. A la concentration cellulaire mentionné, la probabilité de trouver des cellules isolées avec un neurites plus pas connecté à d'autres cellules est beaucoup plus élevé.

3. Revêtement perle

1. Microsphères de polymère (Ø 4 pm, laboratoires COOH-fin-Bangs, code produit PC05N/6700) ont été enduites de poly-D-lysine suivant la procédure décrite dans la Polylink Coupling Kit Protein (Polysciences, code produit 19539). Les billes sont recouvertes de la même molécule utilisée pour couvrir le support de la culture et de la faveur cellules adhérence.

4. Choisissez Neuron isolé. Détachez une perle du substrat Culture, Piège et déplacez-côté de la Neuron

1. Mettez la culture boîte de Pétri sur la platine du microscope. Après avoir réglé la mise au point sur l'échantillon par le mouvement de la scène, corriger la position du condenseur objectif éclairant de mettre Kohler-éclairage. Aligner l'optique d'éclairage pour régler l'état Kolher-éclairage est nécessaire pour améliorer la qualité de l'imagerie en champ clair. En utilisant de telles conditions d'alignement, il est également nécessaire pour maximiser l'efficacité de la collecte de laser IR (à travers le condenseur objectif), de la diffusion sonde emprisonné, pour effectuer son suivi interférométrique par le DOU et PD.
2. Introduire à la pipette un peu pl de la solution mère de microsphères revêtuà la boîte de culture. Microsphères déposer et adhérer au substrat de culture. Le nombre de pi injecté dans la boîte de culture dépend de la concentration des microsphères de la solution mère. La condition idéale est d'avoir entre un et deux microsphères par champ imagerie de vue. Quand trop de microsphères sont ajoutés à la boîte de culture, ils peuvent déjà attacher au hasard dans les neurones en culture.
3. Déplacez-vous dans la boîte de culture, la recherche d'un neurone isolé avec un neurites plus (l'axone), et enregistrer la position de la platine du microscope.
4. Déplacer et rechercher une perle adhéré au support de culture.
5. Allumez le laser de piégeage IR. A ce stade, aucun des hologrammes sont projetés sur SLM, et de la position de la tache laser IR coïncide avec la position du spot laser UV. Régler la position axiale de la tache infrarouge 3.2 um au-dessus de la surface de support de culture, par le mouvement de la platine du microscope.
6. Régler la puissance du laser UV directement à l'échantillon de moins de 1 mW. LeUV laser dissection a déjà été calibré ^14:
   6.5 uW le support en verre est soumis à une ablation
   4 mW une connexion neuronale est complètement disséqué
   2,5 mW une neurites est partiellement lésé
   <1 mW une onde de choc est produite dans la boîte de culture. L'onde de choc optique est suffisamment fort pour détacher le talon du support de verre.
7. Allumez le laser UV, tout en laissant le laser infrarouge, et déplacez le spot UV au-dessus de la perle respecté par le mouvement de la platine du microscope. Les perles se détache de la surface, et il est piégé par le laser IR. Ensuite, éteignez le laser UV.
8. Déplacer les billes piégées plusieurs micromètres au-dessus du support de verre (de 20 à 30 pm). La levée du talon de cette position, on l'empêche de venir au contact d'autres cellules pendant qu'il est déplacé vers le neurone choisi précédemment. Porter le bourrelet à la position de phase enregistrée précédemment. Régler la vitesse de phase à une valeur faible (10 um / sec) de telle sorte la force de traînée du fluide ne dépasse pas le piège optiquevigueur ping.

5. Déplacer la position du piège par rapport au Coin Dissector laser et Axon Position par hologramme généré par ordinateur, et de calibrer la rigidité pinces optiques

1. Déplacer le bourrelet vers le support de verre de visualiser l'axone. Le bourrelet est maintenu au-dessus de la cellule pour éviter le contact avec celui-ci (environ 5 um au-dessus du support de verre).
2. Déplacer la platine du microscope pour déplacer le spot de focalisation UV sur le centre de la largeur de l'axone. Enregistrer la position actuelle de la scène.
3. Déplacer le focus position au comptant IR par hologramme généré par ordinateur. Dans cette étape, l'étape est arrêtée dans la position choisie à l'étape précédente. Lorsque l'hologramme généré par ordinateur est projeté sur le SLM, la bille piégée est déplacée par rapport à l'axone. Nous déplacer le point laser IR pour avoir le bourrelet emprisonné aligné sur le centre de la neurite, de la tache laser UV centré sur le même neurites aussi. Le spot IR et donc la perle piégée sont positionnés le long de la neurites5-10 um loin de l'endroit UV. Nous passons la position de l'IR par rapport à la tache UV en fonction de la géométrie des neurites. Dans le cas où les pinces optiques ne sont pas équipés d'un système SLM, la position peut être modifiée par des miroirs inclinables ou déflecteurs acoustiques optiques, sur le chemin optique IR. Le spot laser infrarouge peut être positionné à une distance de 5 à 10 um de la tache UV afin d'éviter une interaction optique du faisceau de dissection avec la sonde piège, qui pourraient influencer son mouvement brownien et modifier les traces de spectroscopie de force.
4. Après la définition de la nouvelle position de la tache infrarouge par rapport à la tache UV et la position de l'axone, déplacer la platine pour positionner le bourrelet emprisonné loin de l'axone et éviter la collision avec elle. Déplacer la position axiale du bourrelet emprisonné à environ 2 um au-dessus de la vitre de recouvrement.
5. Aligner le DOU du centre Les franges d'interférence sur elle: signaux différentiels QPD x et y sont des zéros lorsque le DOU est centrée. Acquérir 5 sec du mouvement brownien de la bille piégée par le interférométriemètre, à la fréquence d'échantillonnage de 50 KHz. Obtenir la rigidité (pN / nm) et la sensibilité (V / nm) du piège optique par la méthode de spectre de puissance ^18.

6. Fixez la perle de l'axone. Effectuer la mesure de force axotomie et simultanée

1. Levez la position perle piégée environ 4 um au-dessus du couvercle en verre, et le déplacer vers la position de scène enregistrée précédemment (voir l'étape 3.2).
2. Déplacez le bas talon coincé vers l'axone jusqu'à ce qu'il touche le neurites. La collision entre le bourrelet emprisonné et l'axone est contrôlée par le signal DOU z détecter le déplacement de la bille emprisonnée dans le sens axial.
3. Attendre 10 sec avec le bourrelet emprisonné poussé contre l'axone pour favoriser son adhérence à la membrane des neurites.
4. Déplacer le micro-étape pour déplacer la bille piégée de l'axone, et vérifier ainsi son adhésion à la membrane cellulaire. Si la perle respecté, il s'échappe du piège optique.
5. Déplacer en arrière le piège à laser sur le bourrelet colléeet activer la boucle de force avec serrage état de force égale à zéro. De cette façon, les repositionne piézo-scène la perle, attachés à la cellule, au centre du piège optique. Si le système n'a pas de contrôle de la boucle de rétroaction, la position d'interruption du laser peut être déplacé par la platine du microscope pour le centrer sur la sonde collée. Le centre du piège est atteinte lorsque les signaux QPD sont les mêmes que lorsque la bille est coincée et n'est pas collée à la cellule (y QPD signaux égaux à zéro et x et le signal DOU z donne la même tension somme des quatre quadrants que lorsque le talon est coincé loin de toute surface).
6. Définir une condition de force la bride sur l'axe z, le positionnement du laser de piégeage légèrement sur le centre de la bille (environ 100 nm), pour générer une précontrainte sur la sonde piège collée. Dans le cas où le système n'est pas équipé d'une commande de force de serrage, la position de piège optique peut être soulevée vers le haut au pas de 25 nm par la platine du microscope. Le signal DOU z permet de surveiller. Par conséquent, utiliser this signal pour régler la position de la trappe de laser par rapport à la sonde collée. Une telle pré-tension est nécessaire pour détecter la pression exercée sur la membrane après la lésion axonale et la diminution conséquente du mouvement brownien de la sonde adhéré. Une approche similaire a été proposée pour mesurer le relâchement de la tension dans un câble d'attache de la membrane par imagerie vidéo ^19.
7. Déconnexion du retour de force-pince pour mesurer la force sur la sonde adhérant à la condition de position de serrage (l'élément piézo-étape est bloquée).
8. Lancer l'enregistrement simultané des positions des sondes piégés par l'interféromètre (20 fréquence d'échantillonnage KHz), et la cellule pendant laser axotomie en accéléré imagerie à champ clair (20 Hz fréquence de trame).
9. Allumez le laser UV pour délivrer des impulsions laser jusqu'à une lésion devient visible sur l'image de l'axone (généralement 200-400 impulsions optiques sont nécessaires énergie par impulsion: 25. NJ), puis éteignez le laser UV.
10. Continuez l'enregistrement par l'interféromètre pour environ 3 kmn, jusqu'à ce que les coordonnées x, y et z des traces QPD atteindre un plateau.

7. Quantifier le total relâchement de tension

1. Autre les traces enregistrées QPD (en volts) par la sensibilité étalonnée du piège optique, d'obtenir des traces respectives de nanomètres.
2. Filtrer la trace de déplacement z x, y, et par un filtre passe-haut avec les couper à 10 Hz.
3. Calculer la variance totale des traces filtrées représentant le mouvement brownien de la bille piégée. Calcul de la variance à 25 msec pour recouvrir les fenêtres de temps de 500 ms (10 000 points de données) ^20. Le filtrage des traces passe-haut exclut les effets du mouvement brownien en raison de la fluctuation de la membrane ou le mouvement de l'actine corticale. Le mouvement brownien de la bille est réduite par les forces optiques et les forces d'adhérence sur la membrane cellulaire. Lorsque la membrane est tendue en raison de la libération des tensions sa viscosité augmente, et donc le mouvement brownien de la perle, détectée immédiatementdiatement après axotomy, commence à diminuer.
4. Définir T0: début de la diminution de la variance du mouvement brownien, après la livraison de l'énergie laser UV. A l'instant t0 le temps indique le début de la déformation de la membrane.
5. Définir t1: la fin de la diminution de la variance du mouvement brownien (quand il atteint un plateau). L'instant t1 marque la fin de la déformation de la membrane.
6. Effectuer suivi vidéo des débris ou une égratignure sur le support de verre de couverture, afin de mesurer une éventuelle dérive de l'échantillon au cours de la mesure de force. Pour suivre la particule sur le support de verre, nous appliquons d'abord seuils des images brillantes sur le terrain, afin d'obtenir une pile d'images binaires avec la particule en blanc sur un fond noir. Ensuite, on suivre le centre de masse de particules avec une précision sous-pixel (en utilisant le logiciel ImageJ gratuit).
7. Soustraire la dérive mesurée à partir des traces QPD déplacement. Multiplier les traces QPD dérive corrigée par la rigidité optique calibré respectif (k _x, k _{y, z k) afin d'obtenir les traces Fz Fx, Fy, dans piconewtons.}
8. Calculer la trace de la force totale de F _tot = √ (Fx ^​​2 + ² + Fy Fz ^2).
9. Calculer la libération totale de la force entre T0 et T1 comme F _libéré = F _tot (t1) - F _tot (T0). La force mesurée à l'instant t0 doit être soustraite, car il est dû au déplacement de la sonde à partir du centre de la trappe, lorsque les adhère bourrelet à l'neurites.
10. Calculer la surface de contact des neurites entre le bourrelet piégé et la position du spot laser UV: sur la mesure d'image de champ lumineux les longs (L) et à court axes (D) de la neurites entre le bourrelet piégé et la position du spot laser UV. La zone de contact axone est un _axone = L x D.
11. Normaliser la totale libérée force F _publié par la zone de contact axone _{Un axone.}

Résultats

La cellule génère des forces de traction sur le substrat par ses points d'adhésion. Force générée par les éléments du cytosquelette sont en équilibre avec la force antagoniste du substrat de culture. Après lésion induite par laser de la neurite, une partie des câbles tendus de cytosquelette sont perturbés et leur tension équilibrée est libéré en raison de la force antagoniste de l'adhérence du substrat est éliminé. La tension libérée est partiellement diffusé sur les adhésions focales ne ...

Discussion

Nous décrivons dans ce travail une méthode quantitative pour comparer l'adhérence des neurites au substrat de culture, en effectuant une mesure par spectroscopie de force simultanée pendant lésion cellulaire induite par laser. La libération mesurée de tension est liée au degré d'adhésion de la cellule au substrat: les cellules avec un plus grand nombre d'adhésions focaux devraient libérer moins de tension. Mesure de la libération de la tension en fonction de piconewtons fournit une quantité phy...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Polymer microspheres, 4 μm, COOH coated	Bangs laboratories	PC05N/6700
PolyLink Protein Coupling Kit	Polyscience	19539
EQUIPMENT
IR laser	IPG Laser GmbH	YLM-5-SC-LP	ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization
Spatial light modulator	Hamamatsu	LCOS-SLM 10468-07
Blue-tweezers software	Optics group, University of Glasgow	Free downloadable software	http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/
ImageJ	Hamamatsu	Free downloadable software	http://rsbweb.nih.gov/ij/
QPD	Thorlabs	S5980 with C5460SPL 6041 board	Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement
PD	Teem Photonics	PDA100A-EC	Photodiode to measure z trapped probe displacement
nano-Pulse UV laser	AA-optoelctronics	PNV-001525-040	Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps
Acoustic Optic Modulator	Olympus	MQ110-A3-UV, 355nm fused silica
Upright microscope	Andor	BX51	Equipped with a 60, 0.9 NA, water dipping objective
CCD	Warner Instruments	V887ECSUVB EMCCD
Peltier device	Physic Instruments	QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller
Microscope stage: micro+piezo stage	National Instruments	Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD
Daq		NI PCI-6229	Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage
Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine			Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop