Modification multi-échelle des implants métalliques avec des gradients des pores, polyélectrolytes et leur surveillance indirecte<em&gt; In vivo</em

Résumé

Dans cette vidéo, nous allons démontrer les techniques de modification pour les implants métalliques poreux pour améliorer leur fonctionnalité et de contrôler la migration cellulaire. Les techniques comprennent le développement de gradients de pores pour commander le déplacement de la cellule en 3D et de la production de la membrane basale imite pour commander le mouvement de cellule à deux dimensions. En outre, une méthode HPLC pour la surveillance en intégration de l'implant in vivo via l'analyse des protéines du sang est décrit.

Résumé

Implants métalliques, notamment des implants en titane, sont largement utilisés dans des applications cliniques. La croissance tissulaire et l'intégration de ces implants dans les tissus sont des paramètres importants pour les résultats cliniques réussies. Afin d'améliorer l'intégration des tissus, des implants métalliques poreux sont en cours d'élaboration. La porosité ouverte de mousses métalliques est très avantageux, étant donné que les zones interstitielles peuvent être fonctionnalisés, sans compromettre les propriétés mécaniques de la structure entière. Nous décrivons ici les modifications à l'aide d'implants en titane poreux à base de microbilles de titane. En utilisant les propriétés physiques inhérentes telles que l'hydrophobie de titane, il est possible d'obtenir des gradients de pores hydrophobes à l'intérieur des implants métalliques à base de microbilles et en même temps, d'avoir une membrane basale imitateur, basée sur des polymères naturels hydrophiles. Gradients de pores 3D sont constitués par des polymères synthétiques tels que l'acide poly-L-lactique (PLLA) par la méthode de congélation-extraction. 2D nanofibrillar surles faces sont formées à l'aide de collagène / alginate suivie d'une étape de réticulation avec un agent de réticulation naturel (génipine). Ce film nanofibrillar a été construite par couche par couche (LBL) du procédé de dépôt des deux molécules de charge opposée, le collagène et l'alginate. Enfin, un implant où les différentes zones peuvent accueillir différents types de cellules, comme cela est nécessaire pour de nombreux tissus multicellulaires, peut être obtenue. Par ce moyen mouvement cellulaire dans des directions différentes en différents types de cellules peut être contrôlée. Un tel système est décrit dans le cas spécifique de la trachée régénération, mais il peut être modifié pour d'autres organes cibles. L'analyse de la migration cellulaire et les méthodes possibles pour créer différents gradients de pores sont élaborés. La prochaine étape dans l'analyse de ces implants est leur caractérisation après l'implantation. Cependant, l'analyse histologique des implants métalliques est un processus long et fastidieux, donc pour le suivi réaction de l'hôte à des implants métalliques in vivo une unelternative méthode basée sur le suivi de protéines sanguines CGA et différent est également décrite. Ces méthodes peuvent être utilisées pour le développement de la migration sur mesure vitro et des essais de colonisation dans et également être utilisés pour l'analyse des implants métalliques fonctionnalisés in vivo sans histologie.

Introduction

Actuellement implants métalliques disponibles conviennent aux applications porteurs, mais leur non-dégradabilité nécessitent conceptions qui garantissent une interface forte avec le tissu qui les entoure ^1. En prévoyant des structures qui facilitent la croissance cellulaire et la colonisation in vivo, la durée de vie des implants métalliques peut être prolongée ^2. Implants métalliques ouvertement poreux sont des matériaux pour l'ingénierie de l'interface tissu prometteurs et aussi pour assurer une bonne colonisation des implants. Ils ont été utilisés activement que les implants orthopédiques et implants aussi trachéales ^3-5. Cependant, il ya encore des problèmes qui doivent être résolus tels que le contrôle précis sur le mouvement des cellules dans les zones interstitielles. L'incapacité à contrôler ce processus pourrait conduire à la colonisation incomplète dans une extrémité et de la resténose dans l'autre. Aussi fonctionnalisation supplémentaire de ces implants est nécessaire pour la réalisation de fonctions plus élevées telles que, la livraison de facteurs de croissance,vascularisation dirigé et un mouvement simultané de différents types de cellules ^8.6. Pour les implants trachée, ce qui est crucial que la colonisation de l'implant par un tissu vascularisé est souhaitable. Cependant, le tissu incontrôlée en croissance à la lumière de la trachée n'est pas souhaitable, car elle diminue la perméabilité de l'implant.

Une possibilité de contrôler le mouvement des cellules est de taille exclusion. En connaissant la taille des cellules cibles et leur capacité à interagir avec un polymère synthétique étant donné qu'il est possible d'élaborer des gradients de pores qui peut effectivement de déterminer la profondeur de circulation des cellules. Par exemple en créant une architecture pore qui est assez grand pour l'entrée des cellules du tissu conjonctif telles que les fibroblastes extraluminale, mais assez petites (moins de 10 um) pour empêcher leur mouvement intraluminale un contrôle effectif sur la colonisation d'un implant tubulaire peut être réalisé.

De méthodes de création de pores disponibles tels que gel drying, le lessivage des particules, gaz de moussage ^9,10; le plus facile à adapter la méthode pour la formation rapide de gradients pores avec minimum d'équipements nécessaires est de gel-extraction ^11. Dans ce procédé, une solution de polymère est congelée dans un mélange binaire d'un solvant organique et de l'eau. Ensuite, le solvant est échangé par l'intermédiaire de l'extraction par un liquide pré-refroidi miscible tel que l'éthanol. Congélation et des conditions d'extraction déterminent la forme et la taille des pores, et si l'extraction est réalisée d'une manière où le mouvement de la solution d'extraction peut être commandé, la taille des pores et la forme peuvent être directionnellement modulé.

Deuxième étape de tissus multicellulaires est la formation de barrières poreuses entre les différents types de cellules pour contrôler leur interaction. Cela est également nécessaire pour la disponibilité des différents micro-environnements pour les différents types de cellules en fonction de leurs exigences ^12,13. Trachée est un organe tubulaire qui relie le larynx avec bronchi. Il a une pseudostratifié doublure de l'épithélium ciliaire intérieur des cellules à mucus interdispersées qui produisent du mucus. La structure 3D et la stabilité de la trachée est maintenue par le cartilage en forme de C-rings. Ainsi, dans une trachée artificielle il devrait y avoir une jonction définie entre le tissu conjonctif et la couche épithéliale ciliaire. Bien que d'une structure 3D est nécessaire pour la partie de tissu conjonctif, la migration des cellules épithéliales nécessite une membrane en forme de sous-sol surface pour réaliser le mouvement directionnel et la fermeture de la plaie. Polyélectrolytiques films multicouches (PEM) sont une option possible pour obtenir des imitateurs de la membrane basale. Procédé par couche de la couche (LBL) est un procédé polyvalent pour obtenir des revêtements de surface mince et fonctionnel. Il est basé sur des interactions électrostatiques de deux polyélectrolytes de charges opposées et leur accumulation dans une manière séquentielle pour obtenir des revêtements de surface nanométrique dont les propriétés peuvent être modifiées en changeant simplement les variables telles que les espèces de polyélectrolytes, le pH,numéro de couche, l'ajout d'une couche de recouvrement, etc réticulation Un des principaux avantages de la méthode LbL est sa capacité à se conformer à la topographie du substrat sous-jacent. Ainsi, dans des conditions contrôlées, cette méthode peut aussi être utilisée pour obtenir une couverture de surface de structures poreuses. Si le collagène est utilisé comme l'un des polyélectrolytes, il est possible d'obtenir des structures nanofibrillar qui peuvent imiter la surface de la membrane basale. L'hydrophobie de titane permet le développement de ces structures et fibrillarity peut être préservée dans les revêtements épais ^14. De cette façon, l'attachement et le mouvement de cellule à la surface peut également être contrôlée. En utilisant de gel-extraction et de revêtement de film par couche de manière séquentielle, une structure dans laquelle le mouvement des cellules peut être commandée latéralement, longitudinalement et circonférentiellement peut être obtenue ^15.

Ici, nous décrivons deux méthodes de modification nouvelles pour les implants en titane à l'aide de leur comportement hydrophobe qui peut êtreétendu à la modification des divers implants poreux: i) la formation de gradients de micropores à l'intérieur des implants en titane macroporeux avec hydrophobes, des polymères synthétiques, ii) la formation d'une couche de film polymère épais sur la surface de l'implant qui favorise la croissance cellulaire et la formation de la garniture par des multicouches de polyélectrolytes. Ces méthodes peuvent être utilisées successivement ou séparément. Ils fournissent des structures qui assurent la migration contrôlée et l'organisation spatiale des différents types de cellules dans les tissus multicellulaires ^16,17. Pour le cas spécifique de la trachée, le résultat souhaité pour l'implant serait la colonisation par le tissu fibro-vasculaire dans les gradients micropores sans resténose et la formation de la paroi interne des cellules épithéliales ciliées sur les multicouches de polyélectrolytes.

Une façon de contrôler l'intégration des implants est de faire de petites interventions chirurgicales au cours de la période de leur intégration avec l'hôte in situ. Afin d'être en mesure to décider du calendrier des interventions, il est important d'avoir des informations sur les effets systémiques de l'implant. C-Reactive Protein (CRP) a été utilisé pour la surveillance de l'infection et la réponse inflammatoire dans les milieux cliniques. Chromogranine A (CGA) peut également être utilisé de manière similaire et pourrait fournir des résultats plus précis pour observer le niveau d'inflammation ^18. Comme un moyen possible d'observer l'intégration de l'implant métallique in vivo, nous présentons une procédure de surveillance continue des effets systémiques de l'implant par la caractérisation d'échantillons sanguins animaux avec la chromatographie liquide à haute pression (HPLC) et le séquençage des protéines ultérieure. Élaboration de cette méthode peut être utilisée pour échapper à l'analyse histologique point final régulière. Coupe histologique des implants métalliques est un processus long, lourd et coûteux et peut être effectuée uniquement à des moments spécifiques. Pour cette raison, les tests sanguins qui fournissent des informations solides sur la santé de l'implant bien conçuêtre les voies possibles pour réduire l'expérimentation animale tel que mandaté par les récentes règles de l'UE concernant l'expérimentation animale.

Les méthodes présentées ici peuvent être utilisés pour améliorer la performance des implants métalliques par fonctionnalisation ou d'avoir une autre façon de contrôler les implants existants.

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Protocole

1. Préparation des gradients micropores implants métalliques macroporeuses

1. Nettoyez les implants (tels que les implants faits de billes de titane de qualité médicale avec une gamme de taille de 400-500 um, Neyco SAS, France) à l'éthanol puis soniquer dans l'acétone pendant 15 min.
2. Conception et fabrication des moules en Téflon selon la taille de l'implant et de la forme (Pour les expériences classiques, des moules cylindriques de 1,5 cm de diamètre avec une hauteur de 2 cm sont utilisés). Les moules doivent être modulaire, de sorte que les certaines parties peuvent être retirées au cours de l'extraction. Une telle conception du moule assure le contrôle du processus d'extraction en forçant le déplacement du fluide d'extraction d'une manière dirigée.
3. Pour les implants tubulaires destinées à remplacer la trachée, de la structure soit composé de trois éléments: i) une partie de fond pour déterminer la taille de l'implant, ii) d'un mandrin, et iii) d'un noyau externe qui est amovible. De cette façon, le gradient de taille des pores peut être formé à partir de l'extérieur vers l'intérieur.
4. Préparer la solution de polymère synthétique (PLLA): Pour une solution de PLLA gel / extraction doit être préparé dans un mélange binaire de dioxane et d'eau (87:13%, v: v).
5. Chauffer le mélange à 60 ° C afin d'obtenir une solution homogène. 60 ° C, choisi car il correspond à la limite supérieure de la résistance à la température pour les seringues de précision en verre qui doit être utilisé pour l'introduction de la solution dans les implants.
6. Si une concentration élevée (≥ 6%) des solutions de PLLA de haut poids moléculaire, on utilise, à introduire la solution dans de l'implant immédiatement après le chauffage. Sinon gélification de la solution se fait sans une immersion totale.
7. Calculer le volume de la solution de polymère nécessaire à l'égard de la porosité de l'implant, par changement de la précision dans le volume de la solution congelée pouvant être pris en compte.
8. Introduire la solution dans les implants avec des seringues en verre de précision avec précision de 0,1 pi. La limite inférieure de la concentration en polymère est3% pour la formation de pores gradient reproductible alors il devient difficile d'obtenir une répartition homogène dans les échantillons d'épaisseur supérieure à 6%. Cependant, pour des applications spécifiques autres concentrations peuvent être utilisés.
9. Congeler les échantillons directement à -80 ° C ou avec une période d'incubation avant de 30 min à température ambiante. Conditions de gel déterminent en partie la formation de pores, donc les conditions de congélation peuvent être ajustées en fonction de la porosité visé. Conserver les échantillons pendant la nuit à -80 ° C.
10. Extraction: Plonger les implants dans 80% de EtOH pré-réfrigérés. Effectuer l'extraction à -20 ° C pendant la nuit. Pour obtenir des gradients de porosité, supprimer toutes les parties du moule à l'exception du mandrin pour les implants tubulaires et toutes les parties sauf la partie de fond pour des implants en forme de disque. L'utilisation d'un scalpel pré-réfrigérée pour en faciliter la séparation du moule.
11. Après extraction à -20 ° C pendant la nuit ^19, enlever les parties de moule restants et sécher à l'air les implants. Pour la caractérisation desla porosité totale de la structure d'analyse porosimètre au mercure est nécessaire. Mesures porosimètre à mercure ont montré des pics distincts correspondant aux pores sur les deux côtés de l'implant et les pores plus petits interdispersées. Toutefois, les données les plus cruciaux est la différence entre les porosités de surfaces intraluminaux et extraluminal, qui peuvent être analysés par J de l'image pour la distribution de taille des pores avec un microscope électronique à balayage (MEB) ^20. Pour la vérification de la pente des pores, cryofracturation les échantillons et observer la coupe avec SEM.
12. En raison de la nature poreuse ouverte des implants utilisés, et la capacité à réfléchir la lumière de titane, il est possible de faire z empilements de cellules marquées dans les implants poreux. Marquer les cellules avec PKH26 ou Calcein-AM et de visualiser les implants avec la microscopie confocale à balayage laser.

2. Revêtement de surface des implants métalliques poreux avec le collagène / alginate Multilayers

1. Pour accumulationde multicouches, la plus haute reproductibilité est obtenue avec des robots trempage. Toutefois, si un robot trempage n'est pas disponible ces étapes peuvent être effectuées manuellement.
2. Utilisation médicale de type I de collagène de qualité et de l'alginate de sodium. Les concentrations optimales sont de 0,5 g / L pour chaque dans 150 mM de NaCl dans un tampon citrate à pH 3,8.
3. Dissoudre la solution de collagène pendant une nuit afin d'assurer l'homogénéité de la solution. PH acide de 3,8 est nécessaire pour la stabilité accumulation des couches de la structure est instable, avant réticulation, de pH neutre.
4. Déposer les couches par un système de robot trempage par immersion de l'implant dans des solutions de collagène et de l'alginate en variante. Temps de dépôt est de 15 min pour chaque couche successive. Rincer la structure entre les deux étapes de dépôt avec NaCl 150 mM à pH 3,8 pendant 5 min.
5. titulaire spécifique de conception pour l'utilisation des implants avec des robots trempage utilisés dans la production multicouche de polyélectrolytes. Déposer les couches sur la surface de titane soit seulement implants ou des implants modifiés comme décrit dans la section 1.
6. La stabilisation de la membrane basale imiter avec génipine: Préparer la solution de réticulation dans un diméthylsulfoxyde (DMSO) / tampon citrate (NaCl 150 mM, pH 3,8) à 01:04 v: rapport v. Une large gamme de concentrations peut être utilisé et 100 mm est suffisante pour la réticulation. Dissoudre génipine première dans le composant DMSO et ajoutez le composant de l'eau afin d'éviter une agglutination.
7. Réticuler les échantillons par l'immersion dans la solution de réticulation entre 12-24 heures. Ensuite rincer abondamment avec de tampon citrate (pH 3,8).
8. Après les étapes de lavage, la stérilisation des échantillons soit avec traitement UV (30 min) ou un bain antibiotique / antifongique (pénicilline / streptomycine, Fungizone).
9. Les principaux paramètres qui déterminent la qualité de la membrane basale imiter sont son épaisseur et le diamètre des fibres. Calculer les diamètres de fibres par microscopie images de force atomique (AFM) obtenus en mode contact. Sécher les échantillons avec unun courant d'azote avant de l'imagerie. Quantifier l'épaisseur d'au moins 10 fibres par image afin de déterminer l'épaisseur moyenne des fibrilles avec un logiciel de J de l'image.
10. L'épaisseur des films peut être déterminée par des essais de zéro en utilisant l'AFM. Dry (COL / ALG) ₂₄ films multicouches / COL. Utiliser une aiguille de seringue à la hauteur du film. Après localisation de la rayure avec un microscope optique, obtenir des images avec l'AFM sur 10 x 10 um ² surfaces à la limite de la rayure. Calculer les hauteurs des profils obtenus avec le logiciel AFM, ce qui fournit de l'épaisseur de la couche de film.

3. Contrôle indirect de l'intégration de l'implant in vivo par l'analyse du plasma sanguin

1. Toutes les approbations des comités nécessaires devraient être prises pour l'expérimentation animale, conformément aux règles régissant dans chaque pays ^21. Dans notre cas, le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (National Research Council, 2010) est suivie et eOn obtient l'approbation du e de l'Université du comité d'éthique de Strasbourg.
2. Réaliser l'implantation sur le site cible. Le protocole de surveillance du sang donnée ici a été utilisé pour le remplacement trachéal en Nouvelle-Zélande lapins blancs de 15 mm résection trachéale.
3. Suite à l'implantation d'un suivi quotidien est nécessaire comme montioring le bien-être des animaux (guérison autour des sites chirurgicaux, le taux de respiration) général et l'enregistrement de leur poids.
4. Pour valider le test sanguin, utilisez une méthode bien établie, comme les tests ELISA pour la CRP dans le sang. Essais CRP pour beaucoup d'animaux sont disponibles et le test spécifique utilisé pour les lapins sont énumérées dans le tableau 1. De même, utiliser Western blot pour la détermination des niveaux de CGA. Anticorps anti-CGA monoclonaux (anti-CGA _47-68) ont été utilisés dans ce protocole.
5. Pour la caractérisation du plasma, d'obtenir des échantillons de sang provenant des veines auriculaires des lapins. Centrifuger à 5000 rpm pendant 20 min à 4 °; C. Utilisation du surnageant obtenu à l'analyse. Dans notre procédure, ces tests sont effectués sur une base hebdomadaire, mais des tests plus fréquents sont également possibles.
6. Inverser purification par HPLC en phase de la teneur en protéines du plasma: Extraire le plasma de lapin avec 0,1% d'acide trifluoroacétique (1:1, v: v). Purifier l'extrait en utilisant un système HPLC Dionex (Ultimate 3000, Sunnyvale, CA USA) sur une phase inverse nucléosil 300-5C18-colonne (4 x 250 mm, granulométrie 5 um, porosité, 300 Å).
7. Lire l'absorbance à 214 et 280 nm. Le système solvant utilisé est i) Solvant A: 0,1% (v / v) d'acide trifluoroacétique (TFA) dans l'eau et ii) le solvant B: 0,09% (v / v) TFA dans 70% (v / v) d'acétonitrile et d'eau.
8. Utiliser un débit de 700 pi / min en utilisant des gradients pour élutions. Recueillir les fractions de pointe. Concentrer les fractions par évaporation par l'application speed-vide. Il est important d'arrêter la vitesse à vide avant de sécheresse complète.
9. Corréler les pics obtenus à différents points de temps sur la coopérationURSE de la période de l'implantation. Utilisez les peptides purifiés qui montrent des tendances cohérentes au cours d'implantation pour l'identification automatique par séquençage d'Edman.
10. Automatique d'Edman séquençage des peptides: déterminer la séquence N-terminale des peptides purifiés par dégradation d'Edman automatique à l'aide d'un microséquenceur Procise. Chargez l'échantillon à des filtres en fibre de verre polybrene traités. La prochaine étape est l'identification des Phenylthiohydantoin acides aminés (PTH-Xaa) par chromatographie sur colonne C ₁₈ (PTH C-18, 2,1 x 200 mm) ^22. Après la séquence est obtenue, il peut être identifié par le logiciel Blast avec base de données Swiss-Prot.

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Résultats

Formation des gradients pores

En modifiant la concentration de la solution PLLA, il est possible de contrôler la taille des pores du côté extraluminal des implants. La taille des pores et la forme a été significativement affectée par la présence d'implants en titane (figures 1a et 1b). Taille des pores varie de 40 à 100 um et l'utilisation de plus faibles concentrations ont donné lieu à des pores plus petits. Considérant que, la taille des po...

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Discussion

Gradients pores sont des outils importants dans l'ingénierie tissulaire de l'interface et le système décrit ici peut être utilisé seul ou en combinaison avec des implants métalliques pour former des pores gradient d'étudier la migration cellulaire. Le système ne nécessite aucun réglage supplémentaire ou matériel supplémentaire, sauf une hotte à manipuler des solvants organiques, donc elle peut être appliquée dans les laboratoires de biologie. Polymères similaires tels que le poly (acide glyc...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Dioxane	Sigma-Aldrich	360481	Toxic material, Strictly under chemical hood
PLLA i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g	Sigma-Aldrich	94829, 81273	The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent.
PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate)	Novamatrix	4200006	Low viscosity(20-200 mPa.s)
Collagen type I (Bovine)	Symatese	CBPE2US100
Pen/Strep, Fungizone	Promocell	C42020
Genipin	Wako	0703021
Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1.	Bruker	MSCT
Trifluoroacetic acid for HPLC ,≥99.0%	Sigma-Aldrich	302031	Hazardous Material, Please follow MSDS carefully
Acetonitrile, for HPLC ,≥99.9%	Sigma-Aldrich	34998
Calcein-AM	Invitrogen	C3100MP
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich	PKH26GL
Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit	Genway Bio	GWB-9BF960
DMSO, Bioreagent, ≥99.7%	Sigma-Aldrich	D2650
Equipment
Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope	Bruker
Procise microsequencer	Applied Biosystems
Ultima 3000 HPLC system	Dionex
Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100	Hitachi
Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510	Zeiss
Table 1. List of Materials and Reagents.