Synthèse, Livraison cellulaire et<em&gt; In vivo</em&gt; Utilisation de capteurs de pH à base de dendrimères

Résumé

capteurs de fluorescence sont des outils puissants en sciences de la vie. Nous décrivons ici une méthode pour synthétiser et utiliser des capteurs fluorescents à base de dendrimères pour mesurer le pH dans les cellules vivantes et in vivo. L'échafaudage dendritique améliore les propriétés de colorants fluorescents conjugués conduisant à des propriétés de détection améliorées.

Résumé

Le développement d'indicateurs fluorescents représenté une révolution pour les sciences de la vie. Codées génétiquement et fluorophores synthétiques avec des capacités de détection permis la visualisation d'espèces biologiquement pertinentes avec une résolution spatiale et temporelle. Colorants synthétiques sont particulièrement intéressants grâce à leur grande accordabilité et la vaste gamme d'analytes mesurables. Cependant, ces molécules souffrent de plusieurs limitations liées à petite molécule comportement (faible solubilité, les difficultés de ciblage, souvent sans imagerie quotientométrique autorisé). Dans ce travail, nous introduisons le développement des capteurs à base de dendrimères et de présenter un mode opératoire pour la mesure du pH in vitro, dans des cellules vivantes et in vivo. Nous choisissons dendrimères comme plate-forme idéale pour nos capteurs pour leurs nombreuses propriétés souhaitables (de monodispersité, propriétés accordables, polyvalence) qui en font un échafaudage largement utilisé pour plusieurs dispositifs biomédicaux faites. La conjugaison de pH fluorescentindicateurs à l'échafaud des dendrimères ont conduit à une amélioration de leurs performances de détection. En particulier dendrimères exposition réduite fuite de cellule, un meilleur ciblage intracellulaire et permettre des mesures ratiométriques. Ces nouveaux capteurs ont été utilisés avec succès pour mesurer le pH dans la vie des cellules HeLa et in vivo dans le cerveau de la souris.

Introduction

L'utilisation de molécules fluorescentes pour marquer des molécules biologiquement pertinentes spécifiques a complètement changé la façon dont nous étudions les systèmes biologiques. Widefield et la microscopie confocale a permis un temps réel à haute résolution de visualisation de processus biologiques et sont aujourd'hui parmi les techniques les plus populaires pour étudier les événements biologiques in vitro, dans des cellules et in vivo. ¹ Une amélioration pertinente a été représentée par l'élaboration d'indicateurs de fluorescence , c'est à dire des colorants dont la fluorescence dépend de la concentration d'une entité moléculaire spécifique. pH et de calcium indicateurs en particulier ont eu un impact dramatique sur l'étude de la physiologie de la cellule en raison de l'énorme importance de H ⁺ et Ca ^{2 +} dans la biologie. ^2,3

Cependant, la plupart des colorants de détection présentent plusieurs limites intrinsèques liés à leur petite molécule comportements tels que: i) des difficultés à targeti subcellulaireng, ii) une faible solubilité dans l'eau et par conséquent une mauvaise biocompatibilité,., et iii) des fuites de cellules et donc un manque de capacité à long imagerie time-lapse ⁴ En outre, le signal de plusieurs sondes ne peut pas être corrigée en fonction de la dépendance de la concentration de colorant (non Imagerie ratiométrique) et, par conséquent, une mesure absolue dans des cellules ou in vivo n'est pas possible.

Nous avons récemment décrit une méthode simple et efficace pour surmonter ces limitations, en fonction de la conjugaison de colorants de détection sur un échafaudage de dendrimère. ⁵ Les dendrimères sont des polymères hyper-ramifiés monodispersés avec des propriétés très attrayantes pour des applications biologiques. ⁶ en particulier plusieurs architectures dendritiques ont été mis au point et utilisé pour le médicament ⁷ et la livraison de gènes. ⁸ n'est que très récemment plusieurs groupes ont commencé à explorer le potentiel de ces molécules comme échafaudage pour dispositifs de détection. ^9,10,11

Nous avons déjàdécrit une voie de synthèse facile vers la fonctionnalisation différente de polyamidoamine (PAMAM) des échafaudages à base d'esters de NHS-activées. conjugués peuvent ¹² être obtenus en une seule étape au moyen d'une dialyse en tant que purification. Fait intéressant, cette approche peut facilement être appliquée à une variété d'échafaudages dendritiques ou polymères. ^13,14

Pour atteindre les dendrimères d'imagerie ratiométrique étaient doublement marquée avec deux ensembles de colorants: i) un indicateur de pH (par exemple la fluorescéine) et ii) un fragment fluorescent indépendante du pH (par exemple la rhodamine). Cela nous a permis d'effectuer une imagerie précise du pH comme le rapport entre la fluorescéine et la rhodamine est seulement dépendante du pH et de pas plus de la concentration de la sonde. Une autre approche intéressante à ce sujet est représenté par l'utilisation de sondes à base de vie. ¹⁵ Comme la durée de vie ne dépend pas de la concentration de la sonde ces mesures n'ont pas besoin d'une correction de quotient. Cependant, lifmesures de etime nécessitent une configuration instrumentale plus complexe et leur résolution temporelle est sous-optimale pour les processus physiologiques rapides, limitant ainsi leurs applications potentielles.

Dans le but d'effectuer une imagerie intracellulaire, la sonde doit être délivré à travers la membrane plasmique dans le cytosol. Comme les dendrimères sont pas perméable en raison de leur taille et leur caractère hydrophile, la délivrance intracellulaire pourrait être réalisé par électroporation. Au moyen de cette technique, largement utilisé en biologie pour la transfection, les macromolécules marquées peuvent être exécutés de manière efficace dans des cellules d'effectuer une imagerie de haute qualité. En outre, l'électroporation avec les complications liées à dendrimère endocytose peuvent être évités en tant que les macromolécules sont directement remis au cytoplasme. Intéressant après électroporation différents dendrimères montre localisations distinctes à l'intérieur des cellules, même en l'absence de toute séquence de ciblage spécifique. ⁵ Ce passife ciblage, seulement en raison des propriétés physico-chimiques du dendrimère, pourrait être exploitée pour obtenir un pH d'imagerie spécifiques à des organites.

Imagerie ratiométrique peut être effectuée en utilisant la microscopie confocale. La fluorescéine et la rhodamine, conjugué de manière covalente à l'échafaud dendritique, ont été séparément imagées et un rapport carte pixel par pixel a été créé. Plusieurs procédures de contrôle le pH intracellulaire dans les cellules vivantes au moyen d'ionophores ont été signalés. Ionophores sont de petites molécules hydrophobes capables de transporter des ions à travers la membrane plasmique; ionophores pour ion H ^+, comme nigéricine, sont disponibles et peuvent être utilisés pour étalonner les capteurs à base de dendrimères ¹⁶ Ces mesures ont révélé une réponse linéaire de pH similaire à ce qui est observé. in vitro. Sur la base de l'étalonnage du pH intracellulaire peut être mesurée avec précision. Ces mesures ont démontré que le capteur à base de dendrimères peut être un outil précieux dans l'étude H ⁺ homeostasis dans les cellules vivantes et les processus pathologiques qui impliquent pH dysfonctionnements de régulation.

Nous avons récemment démontré que les capteurs de pH à base de dendrimères peuvent également être appliqués in vivo, effectuer une imagerie de pH dans le cerveau de souris anesthésiées. ¹⁷ En raison de l'environnement complexe des tissus vivants de haute qualité dans la détection in vivo est techniquement difficile. Ici, nous montrons une description détaillée de la procédure expérimentale in vivo pour pH imagerie avec un accent des questions cruciales à traiter pour effectuer une imagerie précise du pH dans le cerveau. Microscopie à deux photons a été utilisé pour deux raisons principales: i) l'utilisation de la lumière infrarouge permet de pallier le manque de pénétration tissulaire de la microscopie confocale norme; ii) la large absorption à deux photons de la fluorescéine et de la rhodamine permettre leur excitation simultanée d'éviter la les complications liées à l'utilisation de deux longueurs d'onde pour l'excitation. des mesures de pH dans le cerveau de la souris étaientmenées à bien; capteurs répondent que difficilement à l'hypoxie induire des changements de pH dans l'espace extracellulaire du cerveau. Ces mesures montrent que les indicateurs à base de dendrimères peuvent être utilisés avec succès pour mettre en évidence les changements physiologiques et pathologiques de pH in vivo dans un modèle animal.

Protocole

Une. Synthèse des capteurs

1. Dans la section suivante, nous proposons une procédure pour la conjugaison d'indicateurs de pH de dendrimères PAMAM. Le même protocole peut être appliqué avec une modification minimale de substitution amine dendrimères porteurs. ^5,17,13,14 dendrimères et les colorants disponibles dans le commerce peuvent être utilisés sans autres purifications.
2. Dissoudre le dendrimère dans du DMSO anhydre (50 uM de concentration finale). Préparer des solutions de 10 mM d'achat d'actions de la fluorescéine NHS et tétraméthyl-rhodamine-NHS (TMR) dans DMSO anhydre.
3. Ajouter à la solution de dendrimère la quantité désirée de la fluorescéine et TMR. Le rapport molaire dans le mélange va tenir compte de la quantité de colorants chargées sur le dendrimère. Typiquement, 1 ml de solution de dendrimère de PAMAM G4 dans un microtube est mis à réagir avec 8 eq (40 ul) de la fluorescéine et 8 eq (40 ul) de la TMR. Agiter la solution à la température ambiante pendant 12 heures.
4. Diluer à 1:10 avec de l'eau déminéralisée et charger la réactionmélange dans un sac de dialyse (MWCO = 10 kDa). Dialyser pendant 24 heures contre de l'eau désionisée le remplacement fréquent de l'eau dans le réservoir.
5. Transférer la solution dans un flacon et lyophiliser pendant 24 heures. Une poudre pourpre devrait être obtenu. Poids du solide obtenu et dissoudre dans de l'eau milliQ à une concentration finale de 10 uM. Aliquoter la solution et conserver à -20 ° C.

2. Mesures in vitro de pH

1. Pour vitro étalonnage en préparer une solution de 500 nM de dendrimère dans du PBS (phosphate 2 mM) dans une cuvette en quartz. L'utilisation d'un tampon PBS très diluée (2 mM) afin d'éviter des changements brusques de pH au cours de la titration est recommandée.
2. Mesurer les spectres d'émission de la fluorescéine (exc 488 nm) et TMR (exc 550 nm) et d'optimiser les paramètres optiques du fluorimètre pour obtenir un bon rapport signal-sur-bruit.
3. Effectuer un titrage pH en ajoutant de petites quantités de NaOH 0,1 N et HCl 0,1 N. Après chaque ajout secouer la cuvettepour mélanger, attendre 1 min pour atteindre l'équilibre et de mesurer le pH au moyen d'une micro-électrode de pH. Les spectres d'émission de la fluorescéine et TMR doivent être enregistrées pour chaque étape sans aucun changement dans les paramètres optiques.
4. Tracer l'intensité de la fluorescence en fonction du pH pour le titrage. Le signal de la rhodamine devrait pas être affecté par le pH (<10%). Le signal de la fluorescéine doit être une courbe sigmoïde et doit être équipé d'un modèle unique de liaison avec pK = 6,4.

3. Culture cellulaire et électroporation

1. Cultiver des cellules HeLa dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal et 100 U / ml de pénicilline et 100 mg / ml de streptomycine (Invitrogen). Maintenir une culture de cellules à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée _de CO2 à 5%.
2. Pour dendrimère électroporation, lorsque les cellules sont confluentes, retirez le support et laver les cellules en utilisant DPBS (tampon phosphate salin de Dulbecco). Retirez le DPBS et ajouter la trypsine-EDTA. Neutraliser le tryppécher par addition de milieu contenant du sérum mais pas d'antibiotiques. Centrifuger à 900-1,200 rpm pendant 2 min à température ambiante. Retirez le support et rincer les pastilles en utilisant DPBS.
3. Compter les cellules et prendre 4 * 10 ⁶ cellules. Centrifuger à 1.200-1.500 tours par minute pendant 2 min à température ambiante.
4. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 200 pi de tampon de microporation (fourni par le fabricant du microporateur) et transférer les cellules dans un tube de 1,5 ml.
5. Ajouter solution aqueuse dendrimère dans les cellules remises en suspension. La quantité de dendrimère requis par échantillon dépend du type PAMAM (typiquement de 250 nM pour le cationique et 2 uM de dendrimères neutres).
6. Ajouter du tampon d'électroporation (fourni par le fabricant de microporateur) dans un tube de microporation. Introduire à la pipette les cellules et les dendrimères mélanges avec la pointe d'électroporation de 100 pi volume de taille. Insérer la pipette d'microporateur dans le poste de pipette. Définir l'état d'impulsion pour microporation: tension d'impulsion = 1,005 V; impulsion wide = 35 ms, le nombre d'impulsions = 2.
7. Après que les cellules de transfert de l'impulsion à une 1,5 ml, tube à centrifuger et centrifuger les cellules pendant 5 min à 1200 rpm pour éliminer l'excès de dendrimère dans le milieu. Plaque 10 pi de cellules par électroporation sur des boîtes à fond de verre de 35 mm (WillCo-plat GWSt-3522) avec du milieu frais w / o des antibiotiques.

4. pH de détection dans les cellules vivantes HeLa

1. cellules d'image avec un microscope confocal 12 heures après l'électroporation.
2. Jeu de filtres standard pour la fluorescéine et la rhodamine peuvent être utilisés. Si des filtres accordables sont disponibles ensemble un canal vert 500-550 nm et un canal rouge de 580 nm à 650 nm. Excitation à 488 nm est optimale pour la fluorescéine pendant rhodamine peut être imagée soit avec le 543nm ou de la ligne de laser 561.
3. Focus sur l'échantillon et ajuster les lasers de puissance et détecteurs acquérir pour maximiser le rapport signal-sur-bruit. Si l'électroporation des cellules était de succès devraient être fluorescent brillamment dans les deux canaux. Lalocalisation dépend de la taille et la charge du dendrimère utilisé. Souvent certains localisation lysosomale (petites vésicules périnucléaires) est présent en raison d'endocytose ou cloisonnement. Si la localisation lysosomale est prédominant, c'est à dire la majeure partie de la fluorescence est localisée à l'intérieur des vésicules et un signal faible est observée dans le cytosol, cela indique une toxicité et de mesure doivent être jetés. Acquérir successivement les deux canaux, si nécessaire l'acquisition de plusieurs images et la moyenne des images pour améliorer la qualité de l'image.
4. Pour l'étalonnage pince cellule pH en utilisant des tampons avec des ionophores à différents pH et à acquérir au moins 20 cellules par un pH tel que décrit ci-dessus. Pour une description détaillée de la procédure et la composition des tampons s'il vous plaît se référer à Bizzarri et Collègues. ¹⁶ Nous proposons de mesurer au moins 5 points de pH = 5,5 à pH = 7,5. pH inférieur à 6 sont toxiques pour les cellules, mais toléré pour peu de temps, nous vous proposons d'acquérir les images aussi vite que possible. Si les cellulesmontrer des signes d'apoptose, jetez les cellules et redémarrer.
5. Utilisez ImageJ ou un logiciel analogue pour l'analyse des données. Importez les images de la voie verte et rouge, soustraire fond et créer un pixel par pixel rapport imagerie avec l'outil "Calculateur de l'image".
6. Dessiner une région d'intérêt (ROI) en sélectionnant la cellule souhaitée et mesurer le rapport du vert au rouge intracellulaire. Analyser toutes les images acquises puis tracer le ratio par rapport au pH. Dans la gamme de 5,5 à 7,5 la tendance devrait être linéaire. L'ajustement linéaire des points obtenus donnera la courbe d'étalonnage qui sera utilisé pour convertir le rapport du vert au rouge à pH.
7. En outre le contrôle acquérir plusieurs cellules non traitées (sans ionophores) et essayer de calculer le pH de la courbe d'étalonnage obtenue. Une valeur comprise entre 7,2 et 7,4 soit obtenu.

5. In Vivo Préparation de l'échantillon

1. Les expériences ont été effectuées sur C57BL/6J (mâles et femelles) entre postnatale day 28 et 70. Anesthésiés la souris par une injection intrapéritonéale d'uréthane (c'est-carbamate d'éthyle) (20% p / v dans une solution saline physiologique, 20 mg / kg d'uréthane). Les animaux ont été sacrifiés après essai avec une surdose d'uréthane suivie d'une injection intracardiaque de la même anesthésique.
2. Effectuer une injection intramusculaire de phosphate sodique de dexaméthasone (2 mg / kg de poids corporel) pour réduire la réponse au stress et l'oedème cérébral cortical au cours de la chirurgie.
3. Raser la tête de l'animal et appliquer le gel de lidocaïne à 2,5% sur le cuir chevelu.
4. Utilisez des ciseaux pour couper le lambeau de peau recouvrant le crâne des deux hémisphères
5. Laver l'os exposé avec une solution saline et retirez délicatement le périoste avec une pince. Cela permettra une meilleure base pour la colle et ciment dentaire à adhérer avec.
6. Appliquer un acier poste de chef fait sur mesure avec une chambre d'imagerie centrale et coller avec cyanoacrylate dans un plan sensiblement parallèle avec le crâne sur la région corticale de intérêt et le fixer en place avec du ciment dentaire blanc (Paladur).
7. Fixez la tête de la souris pour effectuer une craniotomie de 2-3 mm de diamètre foré sur la région d'intérêt.
8. Essayez de minimiser l'échauffement du cortex pendant la chirurgie, les larmes dural, ou des saignements.
9. Maintenir le cortex superfusées avec ACSF stérile (NaCl 126 mM, KCl 3, 1,2 mM KH ₂ PO _4, 1,3 mM _MgSO4, 26 mM _NaHCO3, 2,4 mM de _CaCl2, glucose 15 mM, HEPES 1,2 dans _H2O distillée , pH = 7,4).

6. imagerie de pH dans le cerveau de souris

1. Au cours de la respiration des animaux de l'aide de l'expérience fournissant O ₂ de l'air enrichi. L'oxygène est enrichi jusqu'à 80%. O ₂ pression partielle et la circulation est fréquemment ajustés pour obtenir une aide à la respiration adéquate. Maintenir constante la température du corps à 37 ° C avec une couverture chauffante contrôlée rétroaction.
2. Fixer l'animal par la poste en acier sous l'objectif d'un deux-photoconfiguration n d'imagerie.
3. Afin d'injecter la sonde dans le cortex cérébral charger une pipette en verre contenant une électrode AgCl (diamètre de pointe de 4 mm) avec la solution de dendrimère (1 uM). L'électrode permet d'enregistrer les potentiels de champ extracellulaires.
4. Avec une installation de micro-injection insérer la pipette dans le cortex à environ 150 um de profondeur. Injecter pendant 1-2 min à une pression de 0,5 psi.
5. Optimiser le montage optique pour l'imagerie. Puissance du laser doit être ajustée pour minimiser photoblanchiment et le photovieillissement. Typiquement, la puissance du laser utilisé est de l'ordre de 20 mW et le gain PMT a été maintenue constante à 667 V depuis les étalonnages précédents ont montré que cette tension donne le meilleur rapport signal / bruit.
6. Pour l'imagerie exciter le capteur à 820 nm et de détecter simultanément la fluorescéine et la fluorescence de la rhodamine à travers des filtres FITC et TRITC standard.
7. Pour le temps des mesures résolues acquérir série laps de temps de 2 Hz.
8. Pour la correction de fond acquérir un cadre noir avec le laser obturateur fermé pour mesurer le bruit thermique moyenne survenant dans les PMT et le piédestal généralement ajoutées par l'électronique.
9. Pour l'analyse des données selon la même procédure indiqué à la section 4.

Résultats

La figure 1 montre une représentation schématique de la détection de la conjugaison de colorants différents échafaudages dendritiques. Les indicateurs qui en résultent peuvent être obtenues dans une étape de synthèse simple à partir de produits disponibles dans le commerce. Dendrimères amine portant sont mis à réagir avec des colorants NHS activés dans le DMSO et purifiés par dialyse. Ce mode opératoire général a déjà été utilisé avec succès pour le marquage de plusieurs dendrim?...

Discussion

Les étapes essentielles pour l'imagerie de pH réussie avec des capteurs à base de dendrimères sont: i) la sélection de l'échafaudage dendritique correct et le nombre d'indicateurs conjugués à elle et ii) l'optimisation du protocole de distribution de capteur dans des cellules ou in vivo.

Le mode opératoire de synthèse est relativement simple et peut être appliquée à pratiquement tous polymère hyperbranché amine portant. Les capteurs peuvent être obten...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
PAMAM G4	Sigma-Aldrich	412449
Carboxyfluorescein NHS ester	Life technologies	C-1311
TMR NHS ester	Life technologies	C-1171
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dyalsis bags	Spectrum Labs	132117
WillCo Dishes	WillCo Wells	GWSt-3512
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500