Microscopie intravitale pour l'imagerie Subcellular ouvrages chez des souris vivantes exprimant des protéines fluorescentes

Résumé

Microscopie intravitale est un outil puissant qui permet l'imagerie de divers processus biologiques chez les animaux vivants. Dans cet article, on présente un procédé détaillé pour l'imagerie de la dynamique des structures sous-cellulaires, telles que les granules de sécrétion, dans les glandes salivaires des souris vivantes.

Résumé

Nous décrivons ici un procédé pour l'image des structures sous-cellulaires chez les rongeurs vivants qui est basé sur l'utilisation de la microscopie intravitale confocale. En tant qu'organe de modèle, nous utilisons les glandes salivaires des souris vivantes, car ils offrent plusieurs avantages. Tout d'abord, ils peuvent être facilement exposées à permettre l'accès à l'optique, et stabilisés pour faciliter la réduction des artefacts de mouvement à cause de battement de coeur et de la respiration. Ceci facilite considérablement l'imagerie et de suivi de petites structures sous-cellulaires. En second lieu, la plupart des populations de cellules des glandes salivaires sont accessibles à partir de la surface de l'organe. Ceci permet l'utilisation de la microscopie confocale qui a une résolution spatiale plus élevée que d'autres techniques qui ont été utilisées pour l'imagerie in vivo, tels que la microscopie à deux photons. Enfin, les glandes salivaires peuvent être facilement manipulées génétiquement et pharmacologiquement, fournissant ainsi un système robuste d'étudier les processus biologiques au niveau moléculaire.

Dans cette étude, nous nous intéressons à un protocole conçu pour suivre la cinétique de l'exocytose des granules de sécrétion dans les cellules acineuses et la dynamique de la membrane plasmique apicale où les granules sécrétoires fusionnent lors de la stimulation des récepteurs bêta-adrénergiques. Plus précisément, nous avons utilisé une souris transgénique qui co-exprime cytosolique GFP et un peptide de la membrane cible fusionnée à la protéine fluorescente tandem tomate. Cependant, les procédés que nous avons utilisés pour stabiliser et de l'image des glandes salivaires peuvent être étendus à d'autres modèles de souris et couplé à d'autres approches pour étiqueter les composants cellulaires in vivo, ce qui permet la visualisation des différentes structures sous-cellulaires, tels que les endosomes, les lysosomes, les mitochondries, et le cytosquelette d'actine.

Introduction

Dans les deux dernières décennies, l'avènement de la microscopie en direct et l'utilisation de protéines fluorescentes ont conduit à des avancées majeures sur chaque processus cellulaire imaginables, faisant ainsi progresser notre compréhension de la biologie des cellules ^1. Ce champ a considérablement bénéficié de l'utilisation de cultures de cellules de mammifères qui sont des systèmes modèles très puissants, en particulier quand il s'agit de manipulations expérimentales. Cependant, ils ne fournissent pas souvent une représentation fidèle de la biologie des organismes multicellulaires complexes ^2. Cette question a commencé à être abordées par le développement de la microscopie intravitale (IVM), qui a ouvert la porte à l'analyse des questions biologiques clés dans des domaines tels que la neurobiologie, l'immunologie et de la biologie de la tumeur ^3. Jusqu'ici, la plupart des études fondées sur l'IVM ont été réalisées au niveau des tissus et des cellules individuelles, sans fournir aucune information sur la dynamique des compartiments sous-cellulaires. Récemment, notre laboratoire et d'autress ont développé des techniques capables d'IVM imagerie structures sous-cellulaires chez les rongeurs vivants ^{4-7, 13-15} et permettant des manipulations pharmacologiques et génétiques in vivo. Cette approche a été utilisée par nous pour étudier le trafic membranaire in vivo, et plus particulièrement l'endocytose et exocytose régulée ^6,7.

Notre système de modèle expérimental est basé sur l'exposition, la stabilisation et l'imagerie des glandes salivaires sous-maxillaires (SG) de rongeurs anesthésiés. Le choix de la SG en tant qu'organe de modèle pour IVM est dû au fait que les glandes sont facilement accessibles en effectuant une chirurgie mineure, peut être externalisé sans compromettre leur physiologie, et stabilisé pour réduire les artefacts de mouvement en raison de battement de coeur et la respiration. En outre, SG peut être manipulée génétiquement de façon sélective soit par l'injection de vecteurs viraux ou non viraux basés à travers le canal salivaire ^8,9. Enfin, SG sont des glandes exocrines composées de epith polariséeElial cellules qui forment les acini et canaux, les cellules myoépithéliales, et une population complexe de cellules stromales. Pour cette raison, ils sont un excellent modèle pour étudier l'exocytose, l'endocytose, la livraison de gènes, et le cytosquelette d'actine, comme l'a souligné dans nos études récentes ^10, et offrir la possibilité d'étudier les aspects de la biologie cellulaire, tels que la polarité cellulaire, la division cellulaire, la cellule jonctions cellulaires, et des canaux ioniques.

Dans cet article, nous décrivons en détail un protocole d'imagerie pour la réalisation de la résolution subcellulaire dans l'épithélium des SG d'une souris vivante. Plus précisément, nous montrons comment l'imagerie des granules de sécrétion dans les cellules acineuses des SG durant l'exocytose régulée. Comme montré précédemment, lors de la stimulation par des agonistes du récepteur bêta-adrénergique, les granules de sécrétion fusionnent avec la membrane plasmique apicale et s'affaissent peu à peu, libérant leur contenu dans les cellules acineuses canalicules ^6. Notre objectif est de fournir les outils de base pour enquêteurs mexpérience inimal dans les procédures chirurgicales et la manipulation des animaux, afin qu'ils puissent effectuer avec succès IVM à une résolution subcellulaire. Depuis la partie la plus difficile dans l'IVM est la préparation de l'animal, ici nous nous concentrons sur la description des procédures chirurgicales de base qui sont utilisées pour exposer et immobiliser les SG sans compromettre leur fonction. En ce qui concerne les procédures pour étiqueter les structures sous-cellulaires, plusieurs stratégies, telles que l'administration systémique de sondes fluorescentes, l'utilisation d'animaux transgéniques, ou une combinaison des deux, ont été décrits ailleurs ^7,11.

Protocole

Partie 1: Microscope et la préparation de l'installation d'imagerie

1. Toute microscope confocal inversé doit être adaptée à l'IVM. Dans cette étude, un microscope Olympus IX81 inversé, équipé d'une unité Fluoview-1000 confocal à balayage laser a été utilisé. Pour atteindre la résolution la meilleure possible, l'utilisation d'objectifs à grande ouverture numérique, tel que l'immersion dans l'eau UPLSAPO 60x/1.20 NA, et l'immersion dans l'huile Plan-Apo 60x/1.42 NA est recommandée. objectifs à immersion dans l'huile ont des efficacités de collecte et, bien qu'ils nécessitent l'utilisation d'une lamelle couvre-objet entre le tissu et l'objectif, elles offrent une meilleure qualité de formation d'image lorsqu'il est utilisé pour des zones d'image à l'intérieur de 15 à 20 um à partir de la surface. En outre, l'utilisation d'huile élimine le souci de l'évaporation de l'eau au cours de séances d'imagerie plus longues. Afin de maintenir la température et l'humidité, le microscope doit être entièrement fermé et alimenté en air chaud et humidifié. En variante, l'animal, la platine du microscope, et l'objectif doit être réchauffé par d'autres moyens. Par exemple, les plaquettes de chaleur chimique peuvent être utilisées pour l'animal et de la scène, et chauffe spécifiquement conçus objectives peuvent être utilisés pour l'objectif (figure 1A). Le chauffage objectif doit être activée 30 min avant de commencer la procédure. Remarque: lorsque les plaquettes de chaleur sont utiliser pour garder l'animal réchauffer une gaze doit placer entre le coussin et la peau. La peau doit être surveillée pour des brûlures.
2. Les étapes standard dans la plupart des microscopes confocaux disponibles dans le commerce ont une ouverture qui est utilisé pour insérer divers supports qui sont utilisés pour s'adapter à des diapositives, des boîtes de Pétri, et des plaques de différentes tailles. Pour effectuer IVM, un insert de platine standard 35 mm boîtes de Pétri est inversé à l'envers, recouvert d'une lame de verre de 40 mm, qui est ensuite fixé par de la graisse à vide poussé de silicone ou du ruban adhésif (figure 1A). Un logement d'insertion personnalisé peut également être fabriqué à partir de 3 mm de la plaque d'aluminium épais. La surface du verre est alors cleaned avec 70% d'éthanol et glissée avec un Kimwipe.
3. Fabrication d'un support personnalisé pour l'immobilisation SG (stabilisateur). Le but de la porte est de stabiliser les SG en place et de manière rigide les deux à l'étage et la lamelle. Le support peut être fabriqué à partir d'une boîte de Pétri de 60 mm de matière plastique. Tout d'abord, le fond de la boîte est cassée à distance des parois et découpé en rectangles de 15 x 10 mm. Ensuite, les bords sont arrondis et polis à l'aide de papier de verre fin. Quatre entretoises (1,5-2 mm) sont construits en enlevant les embouts en caoutchouc de 1 ml pistons de seringue. En utilisant du papier abrasif fin, la surface des entretoises et des quatre coins de la pièce de plastique sont polies. Les entretoises sont ensuite collés à l'aide de colle gélatineuse, et plus tard lissées à l'aide du papier de verre sur une surface plane. Notez que pour les animaux plus âgés, la taille des porteurs et les entretoises peuvent être augmentés pour accueillir un peu plus grandes glandes.
4. Préparation du gel de couplage optique. 0,3% Carbomère-940 (Le tableau 2) gel est préparé en chauffant 100 ml d'eau ultra-pure et en dissolvant 5,47 g de D-sorbitol. Ensuite, on ajoute 0,3 g de Carbomère-940. Le bécher doit être couvert et placé sur une plaque chauffante agitation (plus bas du réglage de chaleur) pendant plusieurs heures ou jusqu'à ce que tous les bouquets carbomer sont complètement dissous. Enfin, Trietanolamine est goutte à goutte, tout en agitant doucement ajouté, jusqu'à un pH d'environ 7,4 est atteint. Le gel est stocké à 4 ° C ^13.

Partie 2: Animaux et anesthésie

1. Avant de procéder à des expériences sur des animaux, les protocoles devraient être approuvés par le comité de protection des animaux et de l'éthique local. Surtout, les chercheurs doivent être correctement formés pour effectuer des interventions chirurgicales et devraient consulter leur comité de protection des animaux ou de l'établissement vétérinaire avant de procéder à la procédure.
2. Dans cette étude, un modèle de souris (GFP / mTomato-souris) obtenue en croisant des souris FVB exprimant la GFP soluble (GFP-souris) wiDes souris C57B6 e exprimant un peptide membrane-cible fusionnée avec la protéine fluorescente en tandem de tomate (mTomato-souris) ⁶ a été utilisé. Remarque: il faut généralement prendre 20-30 minutes pour l'animal de devenir pleinement anesthésié et préparé pour l'imagerie
3. Les souris sont logées dans un environnement contrôlé à l'animalerie et sont laissées s'acclimater pendant une semaine avant l'expérience. Cette étape est nécessaire pour l'imagerie de la SGS depuis tous les résultats de détresse à une meilleure activité sécrétoire ^12. L'eau et la nourriture sont fournis ad libitum. Les mâles de 2 à 5 mois sont utilisés pour des expériences d'imagerie (20-30 g).
4. Avant l'anesthésie, peser les animaux pour déterminer la dose appropriée de l'anesthésie.
5. Etant donné que la contrainte induite par l'administration d'anesthésiques injectables peut altérer l'activité sécrétoire de la GV, induire pré-anesthésie par inhalation d'isoflurane, suivie de l'injection d'anesthésiques. Pour cela, placer les souris très doucement dans la chambre de vaporisation, ettourner sur le débit d'oxygène (800-900 mmHg). Réglez les niveaux isoflurane à 3% pour commencer l'induction de pré-anesthésie.
6. Une fois que les animaux sont inconscients, injecter un mélange de 100 mg / kg de kétamine et 20 mg / kg de xylazine dans la cavité péritonéale (25 aiguille G). Anesthésiques sont préparés par dilution de 100 mg / ml de xylazine à 20 mg / ml dans une solution saline, puis mélanger avec la kétamine. Ce mélange est dilué à 1:1 avec du sérum physiologique et une quantité appropriée est injectée sur la base du poids de l'animal. Cette dilution aide à prévenir une surdose accidentelle. A noter que le mélange perd de son efficacité au bout de 20 min.
7. Observer les animaux pour des signes d'éveil et injecter plus de mélange anesthésique si elles sortent de l'anesthésie (environ 75% de la dose initiale dans les 45 minutes après la première injection, et 50% toutes les heures par la suite). Contrôler la profondeur de l'anesthésie toutes les 15 min en pinçant la patte et en observant la réponse. Remarque: Toujours administrer pommade ophtalmique à évitersécheresse oculaire.
8. Anesthésiques induisent hypothermie, ce qui peut affecter la reproductibilité des expériences et la santé de l'animal. Par conséquent, les souris doivent être maintenus sous la lampe chauffante ou sur un bloc chauffé pendant toute la durée de l'expérience. Remarque: la lampe de chaleur doit être d'au moins 12-18 cm de l'animal pour éviter de brûler
9. La température corporelle des animaux doit être contrôlée avec un thermomètre équipé d'une sonde de température rectale.

Partie 3: Chirurgie des animaux et de positionnement pour Microscopie intravitale

1. Préparer l'espace de travail avec tous les instruments chirurgicaux (tableau 1) qui doit être propre et stérile.
2. Rasez la zone du cou de la souris avec une tondeuse électrique. Essuyer la face ventrale de la région du cou de la souris anesthésiée avec une éponge de gaze trempée dans 70% d'éthanol. Sécher l'excédent avec un Kimwipe.
3. Avec des pincettes courbes ternes soulèvent un petit morceau de peau sur la ligne médiane (approximativementron à l'extrémité inférieure des muscles masséters), et une petite incision (figure 1B).
4. Insérez les ciseaux dans l'ouverture et séparer la peau loin du tissu sous-jacent en ouvrant les lames de ciseaux. Éviter d'endommager le tissu glandulaire sous-jacent en pointant les ciseaux vers le côté inférieur de la peau. Répétez cette étape plusieurs fois jusqu'à ce que la peau est séparée des tissus profonds (figure 1B).
5. Avec des ciseaux, découpez une bande de peau qui se détache d'environ 3 mm de large et 10 mm de long. La peau doit être coupée de sorte que l'ouverture commence près de la base des SG où le nerf, le conduit et les vaisseaux sanguins relient la glande au reste du corps. Après le nettoyage de la surface de la plaie, l'ouverture résultante sera de forme ovale et mesure environ 8 x 12 mm. Les deux Commissions d'études seront visibles après l'ouverture (figure 1B).
6. Avec une seringue appliquer le gel de couplage optique dans le milieu de la découpe et de l'essuyer versl'extérieur avec de la gaze stérile. Nettoyer les morceaux de gaze doit être utilisé pour chaque lingette pour empêcher l'introduction de cheveux ou de sang dans le tissu exposé. Répétez cette étape jusqu'à ce que tout le sang et lâche poil est enlevé.
7. Utilisation # 7 pincettes, séparer le tissu conjonctif loin de glande sous-maxillaire droit tout le chemin à la base de la glande (variante de ce protocole peut être utilisé sur la SG de gauche). Tout d'abord, trouver la pointe de la SG et de saisir le tissu conjonctif quelques millimètres au-dessus de la pointe de la glande. Déchirer le tissu conjonctif autour de la glande sans blesser le parenchyme. (Figure 1B). Une fois la glande est exposé, séparer délicatement le tissu conjonctif de la glande. En cas de saignement, laver le sang avec une solution saline. Assurez-vous que tous les tissus conjonctifs sont séparées et la glande est entièrement exposés. Gardez la glande humide en appliquant un gel de couplage optique régulièrement.
8. Avant de mettre l'animal au microscope, placer un morceau épais de gaze et la HEAt emballer sur la platine du microscope afin de maintenir une température de 38 ± 2 ° C. La température du bloc à chaleur chimique peut être ajustée par la taille des coupes qui exposent la poche interne à l'atmosphère. Gaze procure une certaine protection de l'emballage de la scène métal de chaleur. Couvrez le dessus du paquet de la chaleur avec un mince morceau de gaze ainsi.
9. Placez l'animal sur son côté (côté droit pour le droit glande) et sur la toile. Placer l'animal avec la glande salivaire sous-maxillaire placé au milieu de la lamelle couvre-objet (Figure 1C).
10. L'animal doit être fixé et stabilisé dans cette position avant de l'immobiliser la glande. Placez un morceau de ruban adhésif de masquage sur la face ventrale de la patte avant droite de la souris. Accrocher les incisives de la souris par une suture de soie (figure 1C, encart). Créer une certaine tension entre le fil de soie et la patte et les fixer sur la scène par du ruban adhésif. Le SG doit reposer naturellement dans le milieu de l'lamelle. La tête et le thorax doivent être en outre stabilisées par des cales en matière plastique qui peut être couplé à l'étage.
11. Placer un petit morceau de tissu de nettoyage pour lentille sur la glande (figure 1C). Elargir la glande légèrement et placez un support personnalisé sur la glande. Associer étroitement le stabilisateur de la scène avec du ruban adhésif. Le couplage peut être amélioré par une pince métallique reliée à l'étage (figure 1C). Tension et des angles aigus doivent être évités car ils peuvent compromettre la circulation sanguine. Immédiatement après la stabilisation inspecter le flux sanguin soit en examinant visuellement la glande (il convient de conserver une coloration rose) ou par épifluorescence. Chez la souris GFP / m-tomate, des altérations brut de l'écoulement du sang peuvent être facilement évalués depuis à la fois les vaisseaux sanguins et plusieurs des cellules du sang sont marquées avec le m-tomate.
12. Couvrir l'animal avec de la gaze et un coussin chauffant. Mesurer la température de la glande exposée à l'aide d'un thermomètre équipé wvec une petite sonde à thermocouple souple mis en contact avec un côté de la glande exposé.

Partie 4: Paramètres d'imagerie

1. En utilisant un éclairage à épifluorescence focalisation sur la surface de la glande soit en utilisant la GFP ou de l'ensemble de filtre de la DP. Trouver la surface de la SG, et évaluer le débit sanguin dans les capillaires et la morphologie globale du tissu. Les signes de lésions tissulaires comprennent bourgeonnement de la membrane ou de l'apparition de grandes vacuoles.
2. Évaluer la stabilité du tissu soit par épifluorescence ou en pré-balayage de la zone sélectionnée. Une préparation stable est essentiel, puisque la plupart des artefacts de mouvement ne peut être enlevé ou corrigés pour l'analyse des données de post-traitement. Si la préparation n'est pas stable, des ajustements sont nécessaires.
3. Pour trouver l'image focale bon plan les glandes en mode pré-balayage (1X zoom), et passer progressivement de l'objectif vers la lamelle jusqu'à ce que les structures acineuses, les granules de sécrétion et la pmembrane Lasma devenir visible (Figure 2).
4. Les paramètres d'imagerie pour le time-lapse dépendent de l'expérience individuelle. À l'image de la dynamique des granules sécrétoires utilisent une vitesse de balayage de 0,5-2 sec / cadre, et 256 x 256 pixels avec un 0,2 um / pixel échelle spatiale (champ de vision d'environ 50 um x 50 um). Afin de visualiser correctement les granules et la membrane plasmatique, l'épaisseur optique doit être réglé entre 0,9 à 1,2 um. Pour exciter la GFP et le tandem de tomate, on peut utiliser une longueur d'onde de 488 nm et 561 nm, respectivement. La puissance de crête est d'environ 0,5 mW pour le 488 nm et 1 mW pour le 561 nm. Ceci assure un minimum de photoblanchiment.
5. Les réglages du détecteur doivent être ajustées pour maintenir le signal dans la gamme dynamique et dépend de la luminosité de l'échantillon.
6. Une fois que tous les paramètres sont réglés, l'imagerie peut être démarré. Tout d'abord, prendre un instantané du champ de vue pour être utilisé comme un point de référence. Tandis quel'imagerie in laps de temps, la dérive du tissu en XY et Z peut se produire. Ceci peut être compensé en ajustant manuellement la zone de balayage et la position de Z. Les réglages doivent être effectués progressivement et par petits incréments pour éviter les artefacts. En outre, l'image de référence peut être utilisée pour déterminer si le photoblanchiment se produit. Si photoblanchiment significatif est détecté (réduction de plus de 15 à 20% de la fluorescence), de réduire la puissance du laser de 0,1 mW.
7. Pour stimuler l'exocytose, injectables par voie sous cutanée de 0,1 mg / kg d'une solution fraîchement préparée de l'isoprotérénol dans une solution saline. Exocytose est déclenchée environ 1 minute après l'injection. Les granules de sécrétion de fusion avec la membrane plasmatique seront détectés par l'augmentation de fluorescence de la GFP dans les granules et la diffusion des peptides tandem de tomate dans leurs membranes de limitation (Figure 3). Nous recommandons l'acquisition de 3-4 séquences time-lapse dans la même région, 10 min chacune.
8. Après la séance d'imagerie, euthanasier l'anesthetized animaux par inhalation de CO ₂ dans une chambre d'euthanasie (10-12 mm de Hg pendant 10 min).

Résultats

Dans la GFP / mTomato souris, les acini apparaissent comme des structures bien distinctes, qui expriment la GFP cytosolique et membranaire ciblée tandem tomate peptide (figure 2, ligne brisée). En acini individu, les cellules acineuses sont délimitées par le peptide tandem tomate. GFP est également détecté dans les noyaux qui sont clairement visibles à l'intérieur des cellules acineuses (figure 2, les flèches). GFP cytosolique est exclue des granules de sécrétion des vé...

Discussion

Jusqu'à présent, les structures sous-cellulaires ont été imagées essentiellement in vitro (c'est à dire des cultures de cellules) ou ex vivo (c.-à-orga-cultures, des tranches de tissus, préparations acineuses) systèmes modèles qui souvent ne récapitulent les caractéristiques des tissus vivants intacts ^6. À cet égard, l'approche présentée ici représente une percée majeure car elle permet l'imagerie de la dynamique d'une étape de trafic membranaire spéci...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Isoflourane (Forane)	Baxter	101936-40	Handle under chemical hood
Ketamine (ketaved)	Fort Dodge Animal Health	57457-034-10	Stock solution 100 mg/ml
Xylazine (Anased)	Akorn, Decatur	61311-481-10	Stock solution 100 mg/ml
Neomycin/Polymyxin B	Bausch and Lomb	24208-785-55	Use to lubricate the eye of the mouse
Carbomer-940	Ashalnd, Inc.	4607-1
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	90279	Add drop wise to prevent the solution to solidify
Isoproternol	Sigma-Aldrich	16504	Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 °C
Instrument
Isoflurane V 1.9 (Vaporizer)	Braintree Scientific	190AF
Portable Downdraft table equipped with HEPA filter	Hazard Technology	PDDT
Heat lamp, Model HL1	Braintree Scientific	HL-1 US
MicroTherma 2T Thermometer	Braintree Scientific	TW2
Operating Scissors (11.5 cm straight	World Precision Instruments	5003708-12
#7 curved tip tweezers	World Precision Instruments	14187
Microscissors	World Precision Instruments	503365
Black Braided Silk suture #4.0	George Tiemann Co	160-1219-4
Gauze sponges 2" x 2"	Tyco Healthcare	9022
Lens cleaning tissue	Olympus	CL-TISSUE (M97) AX6476