Alimentation des tiques sur les animaux pour la transmission et Xénodiagnostic dans la recherche la maladie de Lyme

Résumé

La maladie de Lyme est la maladie à vecteur la plus couramment rapportés en Amérique du Nord. L'agent causal, Borrelia burgdorferi est une bactérie spirochète transmise par les tiques Ixodid. Transmission et détection de l'infection dans des modèles animaux est optimisé par l'utilisation de nourrissage des tiques, que nous décrivons ici.

Résumé

Transmission de l'agent étiologique de la maladie de Lyme, Borrelia burgdorferi, se produit par la fixation et l'alimentation sanguine des espèces Ixodes tiques à des hôtes mammifères. Dans la nature, cette bactérie pathogène zoonotique peut utiliser une variété d'hôtes réservoirs, mais la souris à pattes blanches (Peromyscus leucopus) est le principal réservoir tiques larvaires et nymphes en Amérique du Nord. Les humains sont des hôtes accidentels les plus fréquemment infectés par B. burgdorferi par la morsure de tiques au stade larvaire. B. burgdorferi s'adapte à ses hôtes tout le cycle enzootique, de sorte que la possibilité d'explorer les fonctions de ces spirochètes et de leurs effets sur les hôtes mammifères nécessite l'utilisation de nourrissage des tiques. En outre, la technique de xénodiagnostic (en utilisant le vecteur naturel pour la détection et la récupération d'un agent infectieux) a été utile dans les études d'infection cryptique. Afin d'obtenir des nymphes ticks ce port B. burgdorferi,tiques sont alimentés spirochetes vivants dans la culture à travers des tubes capillaires. Deux modèles animaux, les souris et les primates non humains, sont les plus couramment utilisés pour les études de la maladie de Lyme impliquant le nourrissage des tiques. Nous démontrons les méthodes par lesquelles ces tiques peuvent être alimentés sur, et récupérés à partir d'animaux pour infection ou xénodiagnostic.

Introduction

En 2011, la maladie de Lyme est la 6ème maladie à déclaration obligatoire à l'échelle nationale la plus courante en Amérique du Nord ( http://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html ). B. burgdorferi est un microbe polyvalent, à la fois génétique et antigénique (revu dans ^1). Sa constitution génétique comprend un grand chromosome (> 900 ko) et jusqu'à 21 plasmides (12 linéaires, circulaires 9), dont la teneur en plasmide variant parmi les isolats. Il ya beaucoup à apprendre sur ce spirochète, plus de 90% du plasmide cadres ouverts de lecture ne sont pas liés à des séquences bactériennes connues ^2,3. B. burgdorferi présente une grande variété d'antigènes en tant que cibles potentielles de l'immunité de l'hôte. Toutefois, une infection non traitée persiste souvent. L'interaction des spirochètes avec le milieu de la tique et de l'environnement de l'hôte vertébré nécessite une adaptation de B. burgdorferi dans tout le processus d'infection. Plusieurs plasmidiquedes gènes sont connus pour être exprimé de manière différentielle en réponse à des variations de température, le pH, la densité cellulaire et la même phase du cycle de vie de la tique ^4-8.

L'étude de B. burgdorferi adaptation tout au long de son cycle enzootique, et réponses de l'hôte après infection par la voie naturelle repose sur la capacité à nourrir des tiques sur des modèles animaux appropriés. Ces études sont remplies avec les défis techniques de génération de tiques qui abritent B. burgdorferi, et assurant la transmission et / ou alimentation efficace des tiques sur le modèle hôte. En outre, le confinement et la récupération des tiques infectées est essentielle. Parmi les modèles utilisés sont des souris et des primates non humains, dont chacun constitue un outil précieux dans la recherche de la maladie de Lyme. Comme avec la souris à pattes blanches, qui est un hôte réservoir naturel de B. burgdorferi, la souris de laboratoire est un hôte très sensible qui prend en charge l'infection persistante par B. burgdorferi ^9. FolLowing infection des souris sensibles à la maladie, telles que la souche C3H, les spirochètes de diffuser vers plusieurs tissus, y compris la peau, de la vessie, des muscles, des articulations et du cœur. Réponses inflammatoires à l'infection conduisent à cœur malade et les tissus des articulations. Alors que les spirochètes persistent dans cet hôte et restent infectieux, les lésions inflammatoires peuvent devenir intermittente, n'est pas sans rappeler le processus chez les humains. Le modèle de souris a ainsi fourni beaucoup d'informations sur B. pathologie induite burgdorferi, y compris l'arthrite et cardite et accueillir les réponses immunitaires ^10-12. Du point de vue de l'agent pathogène, certains gènes exprimés de manière différentielle lors de l'infection chez les mammifères ont été caractérisés, comme certains nécessaire pour la transmission à partir du vecteur de tique ^13-21.

Bien que plusieurs espèces animales ont été utilisées pour étudier la maladie de Lyme ²² macaques rhésus imitent plus étroitement le caractère multi-organe de la maladie humaine ^23. Contrairement à d'autresdes modèles animaux, la largeur de manifestations de la maladie, tels que l'érythème migrateur, une cardite, l'arthrite et la neuropathie du système nerveux périphérique et central sont observés chez les macaques. Chez la souris, l'hôte de réservoir pour B. burgdorferi, la maladie varie selon la souche de souris et ²⁴ ans, tandis que les manifestations précoces et tardives, diffusées sont rares ^9. En outre, d'autres rongeurs, lagomorphes, et les canines tous ne parviennent pas à présenter une maladie neurologique de B. infection burgdorferi ^25. Surtout, les macaques présentent des signes qui caractérisent les trois phases de la borréliose de Lyme, à savoir, au début localisé, en début de diffusion, et à un stade avancé la maladie de Lyme ^26-28. L'érythème migrant (EM) est pensé pour se produire dans 70-80% des cas humains ^29, et est également considérée dans macaques rhésus ^28,30. Après l'infection, les spirochètes diffuser à partir du site d'inoculation à de multiples organes. Spirochetal ADN a été détecté dans mu squelettiquescles, coeur, de la vessie, et le plexus nerveux périphérique, ainsi que dans le système nerveux central (cerveau, le tronc cérébral et le cervelet, la moelle épinière et la dure-mère) ^31.

Cochez alimentation sur des souris a été utilisé par nous et d'autres équipes de recherche pour la propagation des colonies de tiques, en étudie compétence réservoir ^32-36 et dans les études de B. burgdorferi pathogenèse ^37-40. Cette technique a aussi été utilisée pour xénodiagnostic et l'essai de l'efficacité du vaccin chez des souris ^{de 41 à 44.} Nous avons nourri tiques Ixodes sur les primates non humains pour le développement de modèle ^28, une étude de l'efficacité du vaccin ^45, et pour xénodiagnostic dans l'évaluation de la persistance du traitement post-antibiotique ^46. Tiques port B. burgdorferi peut être maintenue dans un cycle enzootique naturel en alimentant les larves sur des souris infectées et en utilisant les nymphes pour les études, les spirochètes sont transmises à travers les étapes de la vie. Dans ce rapport,, Nous demandons sur la façon de générer des tiques infectées par type sauvage ou mutant B. burgdorferi, à l'aide capillaire gavage. Ceci peut également être accomplie par micro-injection ⁴⁷ et ⁴⁸ par immersion. Le but de l'introduction artificielle de B. burgdorferi dans les tiques peuvent être d'étudier les souches mutantes dont la transmissibilité est inconnu, pour générer un groupe de tiques avec un taux élevé d'infection, et de réduire les risques d'erreur par le maintien d'une colonie de tiques propres et autrement non infecté. En outre, nous démontrons le nourrissage des tiques sur des souris et des primates non humains, de manière à assurer le confinement et la récupération des tiques regorgent. L'utilisation de nourrissage des tiques est essentiel pour de futures études des réponses immunitaires à B. infection burgdorferi, le potentiel de Lyme efficacité du vaccin, et xénodiagnostic pour la détection des infections occultes.

Protocole

Un schéma expérimental de la tique inoculation et l'alimentation des animaux lors de la recherche de la maladie de Lyme est représenté sur la figure 1.

Une. Inoculation larvaire tiques Ixodes avec B. burgdorferi Utilisation capillaire Tube d'alimentation

Lorsque vous effectuez des manipulations avec des tiques, des blouses blanches avec des manches élastiques, gants et bonnets bouffants jetables sont portés.

1. Notre technique est une version modifiée de celle décrite par Broadwater et al. ^49. Préparer des tubes capillaires en chauffant et en tirant des pipettes Pasteur à la minceur de tomber à l'aide d'un extracteur de la pipette. En utilisant des pinces et la dissection étendue, briser les conseils pour le diamètre optimal (environ 0,2 mm). Un tube normalisée à la taille de la pièce buccale tique est utilisé comme un guide de dimensionnement. Un écran facial doit être porté lors de la préparation des pipettes.
2. Cultivez B. burgdorferi à entre 2-8 x 10 ⁷ / ml (phase mi-log) dans BSK-H moyen (Sigma) concontenant du sérum de lapin à 6%.
3. Utilisez tiques larvaires qui ont été stockés à 23 ° C pendant 4-6 semaines de la mue post-larvaire. Lieu tiques sur un petit 60 x 15 mm boîte de Pétri avec du ruban adhésif double face sur la surface extérieure de fond du plat. Placez le côté ventral tiques vers le haut.
4. Trempez la pointe du tube capillaire dans le B. tube de culture burgdorferi après le mélange. Placer le tube capillaire sur le hypostome des parties tic de la bouche à l'aide d'un microscope à dissection. Utilisez la pâte à modeler pour fixer le tube en place, comme le montre la figure 2A.
5. Placez les boîtes de Pétri avec une marque apposée à l'intérieur d'une grande baignoire en plastique transparent pour un niveau de confinement. Serviettes en papier humide sont ajoutés pour fournir l'humidité. Placez les tiques dans un incubateur thermique 37 ° C pendant 30 min-2 h jusqu'à ce que la défécation est apparente. Cela indique que les médias contenant des spirochètes a traversé la tique.
6. Reposez les tiques pour 2-4 semaines à 23 ° C pour permettre l'adaptation à l'environnement de la tique avant de nourrirles sur les animaux.

2. Infecter des souris avec B. burgdorferi par Tick

1. Diluer la kétamine actions à 1:10 dans de l'eau stérile. Anesthésier chaque souris à 100 mg / kg de kétamine par injection intra-péritonéale avec une seringue à tuberculine
2. Une fois que la souris est totalement anesthésié, se raser la souris des oreilles pour le milieu du dos à l'aide d'une amende (Remington lisse et soyeux) tondeuse électrique.
3. Dans une casserole blanc avec aucun autre objet à proximité, transférer les tiques larvaires (ce port B. burgdorferi) par un pinceau humidifié à la zone chauve de la souris. Alternativement, les tiques non infectées peuvent être placés sur des souris pour xénodiagnostic de souris à l'infection suspect. L'utilisation d'une surface propre, blanc pour le placement de la tique permet de s'assurer que seules les tiques seront facilement visibles.
4. Placez la souris dans des cages spécialisé (Allentown Cages, Allentown, Pennsylvanie). La cage est constituée d'une grille en acier inoxydable surélevée par rapport au fond de la cage. Til en haut de la cage a été modifié par notre maison-atelier d'usinage pour élever le support suffisant pour permettre la libre circulation de la souris sous la bouteille d'eau. Le bac est rempli d'environ ½ pouce d'eau pour piéger les tiques qui tombent souris (figure 3A). Pour minimiser le risque d'hypothermie, coussins chauffants réutilisables, au micro-ondes avant de les utiliser, sont placés sous les cages jusqu'à ce que la souris se réveillent complètement de l'anesthésie. Les animaux sont souvent ataxique qu'ils se remettent de l'anesthésie et de frotter contre les aliments et les plateaux de l'eau, de sorte que ceux-ci doivent être enlevés. Le niveau d'eau est suffisamment faible pour empêcher les membres de souris de submersion.
5. Placez la cage dans un plateau qui a été doublé de Tangle piège pâte (Contech, Victoria, BC, Canada) et la bande pour assurer le piégeage des arthropodes. Les souris sont mises en cage individuellement et observés en continu au cours de la période d'anesthésie.
6. Dans deux heures, lorsque les souris sont complètement éveillé de l'anesthésie, le plateau de la nourriture et une bouteille d'eau sont remplacés à la cage. Après 24 h, l'enrichissement de boîtier constitué d'une cabane en plastique et Nylabone est remplacé.
7. Après 3, 4, et 5 jours, vérifiez la souris, cage et de l'eau de la cage pour les tiques nourris. L'eau de la cage est passée à travers un pan de métal blanc (c'est à dire "orpaillage"). Rincer nourris tiques dans de l'eau propre et stocker dans des pots en plastique (figure 3B). Les jours 3 et 4, remplacer l'eau dans la cage avec de l'eau propre. Au jour 5, vérifier non seulement la cage, mais la souris bien pour les tiques. Habituellement, à ce point toutes les tiques ont nourri et les souris peuvent être retournés à la mise en cage régulière.
8. Placer tous les déchets des cages de souris, y compris les liquides, dans des conteneurs de risque biologique pour l'autoclave et l'élimination. Tenir un journal du nombre de tiques placés sur des souris et ceux récupérés à tout moment.

3. Nourrir les tiques sur primates non humains d'infection par B. burgdorferi ou xénodiagnostic

1. Préparez l'appareil tique de confinement: Coupez un 1 ¾ po de diamètre dans le cercle de 3 pouces x3 pouces LeFlap (rabat) à l'aide d'un scalpel propre et le guide de mesure. Utilisez la découpe comme un modèle pour découper des cercles de taille identique dans la mousse Biatane et Duoderm. La mousse est utilisée pour élever rabat sur la surface de la peau et éviter tout risque d'écrasement tique. Le Duoderm ajoute une autre couche de rembourrage et recouvre les bords du dispositif de confinement pour une sécurité accrue de tiques évasion. Un schéma du dispositif de confinement est représentée sur la Figure 4.
2. Personnel vétérinaire sera anesthésier l'animal avec 5-8 mg / kg par injection intramusculaire Telazol.
3. Couper les poils de l'animal à l'aide tondeuse électrique (Oster) équipé de la taille 40 lames. Tous les domaines qui seront couverts par l'enveloppe sont coupées: dos, avant, les bras. Utilisation de la crème à raser et double-lames rasoirs jetables, de se raser de près une superficie d'environ 25 cm x 20 cm vertical horizontal. Essuyer avec des serviettes en papier humide et sécher à basse température pour sécher la peau.
4. Placez le volet sur til animale de dos, juste en dessous de l'omoplate, de part et d'autre de la colonne vertébrale. Utilisez un marqueur pour tracer le cercle à cet endroit. Préparer la zone de peau autour du cercle en l'essuyant avec SkinPrep. Cela supprime l'huile dans la peau qui pourraient nuire à l'adhérence de la colle et des dispositifs de confinement. Laissant environ 1 cm de circonférence de l'espace autour du cercle, appliquer une couche de colle de peau (SkinBond) d'une largeur de 4 cm ~.
5. Retirez la bande adhésive de la mousse Biatane et apposer sur la peau à l'endroit approprié. Les animaux sont de nouveau anesthésiés par le personnel vétérinaire avec 5 mg / kg Telazol. Sceller les bords avec de la colle de peau et bande Hypafix. Retirez le support adhésif du volet et apposer sur le dessus de la Biatane. Placez la bande Hypafix sur les bords de la LeFlap, puis scotchez le volet de la maille du volet et placer la veste sur l'animal. Bande et Piège de Tangle pâte est appliquée sur le sol dans un périmètre entourant la mise en cage des primates non humains pour plus de sécurité.
6. Afin de minimiser les effets de chemicmatières utilisées dans l'étape 3.4 sur le nourrissage des tiques, les tiques sont ajoutés 24 heures après que le dispositif de confinement est en place. À ce stade, la sécurité de l'appareil est également inspecté et renforcé si nécessaire. Typiquement, 20 nymphes à jeun (de mue 4-8 semaines de post-larves) sont ajoutés à la peau dans le dispositif à l'aide d'un pinceau.
7. Retirez la bande adhésive de la maille du volet et sceller en place. Enfin, retirez le support de Duoderm pour exposer l'adhésif et placer sur le dessus de l'appareil de confinement. Ajouter un morceau de ruban Hypafix à travers le cercle de mailles ouvertes, et remplacer la veste. Le dispositif de confinement complétée est représentée sur la Figure 5A.
8. Après 5 jours, anesthésier les animaux que ci-dessus et les chemises sont enlevés. Retirer le ruban premier à inspecter le nourrissage des tiques à travers les mailles (figure 5B). Retirer délicatement le Duoderm loin de la trappe.
9. Tirez la partie de maille sur les bords de fournir un accès aux tiques. Tiques de la Fed sont souvent trouvés près ou sousle cercle de mousse (figure 5C) et sont retirés et placés dans l'eau avec un pinceau. Retirez le dispositif une fois tous les tiques nourris visibles sont collectées (figure 5D).

Remarque: Souvent, le dispositif de retenue peut être simplement décollée de la peau. Si l'adhérence est forte et pourrait potentiellement endommager la peau, solvant Unisolve est appliqué à la zone pour l'élimination douce. La peau est nettoyée avec de l'isopropanol et les tiques sont stockés à 23 ° C. Si utilisé pour l'infection, les tiques peuvent être écrasés pour confirmer le numéro qui contenait B. burgdorferi. S'il est utilisé pour xénodiagnostic, les tiques sont conservés pendant 1-3 semaines avant l'analyse du contenu de l'intestin moyen.

Résultats

Après l'achèvement de l'alimentation capillaire, les tiques sont généralement reposer à 23 ° C pendant 2-3 semaines avant qu'ils ne soient introduits sur les animaux pour la transmission. En utilisant la technique capillaire d'alimentation, nous avons constaté que plus de 90% de la Fed ticks port B. burgdorferi. Le pourcentage de tiques positives est déterminée par les tiques lavage dans du peroxyde et de l'éthanol, puis les écraser dans du PBS stérile avec un pilon en forme de t...

Discussion

Afin d'obtenir les tiques que le port B. burgdorferi pour les études en aval, les tiques peuvent être: (1) alimentée sur des souris infectées au stade larvaire (2) immergé dans B. cultures burgdorferi, soit au stade larvaire ou nymphal ^48; (3) micro-injection B. ⁴⁷ burgdorferi, ou (4) le tube capillaire alimenté B. burgdorferi ^49. Bien que chacune de ces méthodes a son but, de veiller à ce qu'une grande partie des tiqu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
BSK-H	Sigma	B-8291
Ketamine HCl
Tangle Trap coating Paste	Ladd research	T-131
SkinPrep	Allegro Medical Supplies	177364
LeFlap, 3" x 3"	Monarch Labs
Hypafix tape	Allegro Medical Supplies	191523
SkinBond	Allegro Medical Supplies	554536
UniSolve	Allegro Medical Supplies	176640
Biatane Foam, adhesive 4"x4"	Coloplast	3420
DuoDerm CGF Dressing - 4" x 4", (3/4)" adhesive border	Convatec	187971
Nonhuman primate jackets with flexible 2" back panels; add drawstrings at top and bottom	Lomir Biomedical Inc.
EQUIPMENT
Pipet puller	David Kopf Instruments	Model 700C
Dark field microscope	Leitz Wetzlar	Dialux
Dissecting microscope	Leica	Zoom 2000
Mouse caging	Allentown caging