Mise en place d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; Système d&#39;étudier le comportement intracellulaire de<em&gt; Candida glabrata</em&gt; En droits macrophages THP-1

Résumé

Le présent article décrit un protocole pour établir un système de modèle de culture cellulaire in vitro pour étudier l'interaction d'un champignon pathogène intracellulaire facultatif humain Candida glabrata avec les macrophages humains qui sera un outil utile pour faire progresser notre connaissance des mécanismes de virulence des champignons.

Résumé

Un système modèle de culture cellulaire, si un synoptique proche des conditions d'environnement de l'hôte, peut servir comme une alternative peu coûteuse, facilement manipulable et reproductible pour des systèmes de modèles animaux pour l'étude d'une étape spécifique de l'infection par le pathogène microbien. Une lignée cellulaire monocytaire humaine THP-1 qui, lors du traitement de l'ester de phorbol, se différencie en macrophages, a déjà été utilisé pour étudier les stratégies de virulence de nombreux pathogènes intracellulaires, y compris Mycobacterium tuberculosis. Ici, nous discutons d'un protocole d'adopter un modèle in vitro de culture cellulaire dans système à l'aide de macrophages THP-1 pour délimiter l'interaction d'un agent pathogène opportuniste humain de la levure Candida glabrata avec des cellules phagocytaires de l'hôte. Ce système de modèle est simple, rapide, prête à écrans mutantes à haut débit, et ne nécessite pas de matériel sophistiqué. Un THP-1 expérience d'infection des macrophages typique prend environ 24 heures avec un 24-48 heures supplémentaires pour permettre intracellulaire récupérélevure de se développer sur un milieu riche pour colony forming analyse de la viabilité à base de parts. Comme d'autres systèmes modèles in vitro dans une éventuelle limitation de cette approche est la difficulté d'extrapoler les résultats obtenus à un circuit de cellule immunitaire très complexe existant dans l'hôte humain. Cependant, malgré cela, le protocole actuel est très utile pour élucider les stratégies d'un agent pathogène fongique peut employer pour échapper / contrecarrer réponse antimicrobienne et survivre, s'adapter, et de proliférer dans l'environnement pauvre en nutriments des cellules immunitaires de l'hôte.

Introduction

Espèces de Candida sont la principale cause des infections fongiques invasives potentiellement mortelles chez les patients immunodéprimés ^1. Candida glabrata, un pathogène nosocomial émergents, est la deuxième ou troisième plus fréquemment isolés espèces de Candida chez des patients de l'unité de soins intensifs en fonction de la situation géographique ^1-3. Phylogénétiquement, C. glabrata, une levure bourgeonnante haploïde, est plus étroitement liée aux Saccharomyces non pathogène modèle cerevisiae que de pathogène Candida spp., y compris C. albicans ^4. Conformément à cela, C. glabrata manque quelques traits de virulence fongiques clés, y compris l'accouplement, l'activité protéolytique sécrétée et la plasticité morphologique ^4-5.

Bien que C. glabrata ne fait pas hyphes, il peut survivre et se répliquer dans les macrophages murins et humains ^6-8 suggérant qu'il a développé des mécanismes de pathogenèse uniques. Peu d'informations sont disponibles sur les stratégies que C. glabrata emploie pour survivre environnement macrophages intracellulaire pauvres en éléments nutritifs et de contrer oxydation et réponses de l'hôte non oxydants montés par les cellules immunitaires de l'hôte ^5. Un système de modèle de macrophage pertinente est une condition préalable pour délimiter l'interaction de C. glabrata avec des cellules phagocytaires de l'hôte par des approches génomiques et protéomiques fonctionnels. Les cellules mononucléées du sang (PBMC) et des macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDMs) d'origine humaine et murine, respectivement, ont précédemment été utilisées pour étudier l'interaction de C. glabrata avec des cellules immunitaires de l'hôte ^7,9. Cependant, la difficulté à obtenir les CMSP et BMDMs, leur durée de vie limitée et variation intrinsèque entre les différents bailleurs de fonds de mammifères limitent l'utilisation de ces cellules des systèmes modèles comme polyvalents.

Ici, nous décrivons une méthode pour l'établissement d'un système in vitro pour étudier la intracellulcomportement ar de C. glabrata cellules dans les macrophages issus de la lignée cellulaire monocytaire humaine THP-1. L'objectif global de ce protocole était d'adopter un système de modèle de culture cellulaire simple, peu coûteux, rapide et reproductible qui peut être facilement manipulé pour étudier différents aspects du pathogène interaction hôte-fongique.

Cellules THP-1 ont déjà été utilisées pour déchiffrer la réponse immunitaire de l'hôte contre une large gamme d'agents pathogènes, notamment des bactéries, des virus et des champignons ^10-12. Cellules monocytaires THP-1 sont faciles à entretenir et peuvent être différenciées, par traitement de l'ester de phorbol, de macrophages qui imitent les macrophages dérivés de monocytes humains et des macrophages expriment des marqueurs appropriés ^13. Les principaux avantages de THP-1 système de modèle de macrophage sont la facilité d'usage et l'absence d'exigence d'un équipement sophistiqué.

Le protocole présenté ici est facilement adaptable pour étudier l'interaction d'autres agents pathogènes fongiques humains avec host cellules immunitaires. La procédure de courant peut également être utilisée pour identifier des facteurs de virulence de l'agent pathogène d'intérêt en utilisant des écrans de mutants à haut débit. Cette preuve de concept a été illustré par l'utilisation réussie de THP-1 système de modèle de culture pour identifier un ensemble de 56 gènes qui sont nécessaires pour la survie de C. glabrata dans les macrophages humains ^8.

Protocole

Il est recommandé d'effectuer C. glabrata expériences d'infection dans un laboratoire avec un niveau de biosécurité de confinement 2 (BSL-2).

1. Préparation des cellules THP-1 macrophage monocouche.
2. C. Préparation d' glabrata suspension cellulaire.
3. L'infection des macrophages THP-1 avec C. cellules glabrata.
4. Mesure du taux de phagocytose et de la réplication intracellulaire par l'intermédiaire de formation de colonies dosage unitaire.
5. Surveillance de la réplication intracellulaire en utilisant la microscopie confocale à balayage laser.

Une. Préparation de THP-1 macrophages monocouche

1. THP-1 est une lignée de cellules monocytes humains provenant du sang périphérique d'un 1 ans garçon atteint de leucémie aiguë monocytaire ^14. THP-1, une lignée de cellules en suspension, est habituellement maintenue à 37 ° C humidifié à 5% _de CO2 dans du milieu de culture RPMI-1640 supplémenté avec 10% de FBS (sérum bovin fœtal). Le traitement avec du phorbol 12-myrista13-acétate de te (PMA, un ester de phorbol) aboutit à une différenciation terminale des cellules THP-1 de monocytes en macrophages. Fait important, le traitement PMA n'affecte pas la viabilité des cellules et les cellules différenciées ne se divisent pas.
2. Graine d'environ 1,5 x 10 ⁶ cellules THP-1 de monocytes dans 100 boîtes de culture mm de milieu RPMI-1640 complet (milieu RPMI-1640 additionné de 10% de sérum, 2 mM de glutamine et 1x antibiotiques; 10 ml / boîte) et laisser les cellules se développent à 37 ° C dans 5% _de CO2 pendant 2 jours.
3. Une fois cellules THP-1 ont atteint une densité de 8 x 10 ⁵ cellules / ml, transférer la boîte de culture de la hotte à flux laminaire de culture cellulaire et agiter doucement pour remettre les cellules installées.
4. Introduire à la pipette la suspension cellulaire, placez dans un tube stérile de 15 ml et centrifuger à 1000 rpm (130 xg) pendant 4 min. Rejeter le surnageant et suspendre THP-1 culot cellulaire dans 5 ml, préchauffé, milieu complet RPMI-1640 frais.
5. Énumérer les cellules avec un hémocytomètre et diluer le cell suspension à une densité finale de 10 ⁶ cellules / ml avec du milieu complet préchauffé RPMI-1640
6. Ajouter 1 pl de 160 mM PMA actions (phorbol 12-myristate 13-acétate solution préparée dans du diméthylsulfoxyde) à 10 ml THP-1 cellule suspension (concentration finale de 16 nM) et bien mélanger. Distribuer 1 ml de suspension cellulaire dans chaque puits d'une plaque de culture tissulaire à 24 puits et incuber la plaque dans l'incubateur maintenu à 37 ° C avec 5% _de CO2 pendant 12 heures.
7. Enlever le vieux médium, ajouter 1 ml préchauffé milieu RPMI-1640 complet et permettent aux cellules de récupérer pendant 12 heures à 37 ° C dans 5% de CO _2.
8. Observer les cellules sous un microscope inversé pour s'assurer que les cellules THP-1 monocytaires de forme ovale en suspension ont été différenciés en macrophages aplatis, en forme de fuseau et adhérentes. Ces cellules différenciées sont maintenant prêts à mener C. études d'infection glabrata.

2. C. Préparation d' glabrata & #160; suspension cellulaire

C. glabrata souche sauvage Bg2 sera utilisé pour infecter les macrophages THP-1. C. glabrata cellules sont cultivées en routine en milieu YPD liquide (extrait de levure (1%)-peptone (2%), de dextrose (2%)) moyenne. Milieu YPD solide est préparé en ajoutant 2% de gélose avant l'autoclavage milieu.

1. Pour préparer une culture de C. glabrata, choisissez une seule colonie à partir de la plaque de gélose avec une boucle stérile à usage unique et inoculer dans 10 ml de milieu liquide YPD et incuber pendant 14-16 heures avec agitation (200 rpm) à 30 ° C.
2. Centrifugeuse de cette culture (1 ml) à 4 000 tours par minute (1800 x g) pendant 5 min dans une microcentrifugeuse de table, de lavage des cellules trois fois avec du PBS (solution saline tamponnée au phosphate, pH 7,4) et la suspension stérile culot cellulaire dans 1 ml de PBS.
3. Mesurer la DO ₆₀₀ C. glabrata suspension de cellules et on dilue avec un volume approprié de PBS stérile pour obtenir une densité de 2 x 10 ⁶ cellules / ml _(DO600= 0,1). En variante, la densité de cellules désirée peut être obtenue par comptage des cellules de levure en utilisant un hémocytomètre.

3. L'infection des macrophages THP-1 avec C. Cellules glabrata

1. Ajouter 50 ul C. glabrata suspension de cellules THP-1 pour les macrophages (10 ⁶ cellules ensemencées par puits d'une plaque de culture à 24 puits) pour obtenir une MOI (multiplicité d'infection) de 0,1 et incuber la plaque à 37 ° C avec 5% de CO _2.
2. Pour déterminer les chiffres de levure viables, diluer 50 pi C. glabrata cellule suspension de 100 fois dans du PBS stérile et de la plaque 100 pl sur milieu YPD solide. Incuber les plaques à 30 ° C et compter manuellement le nombre de colonies de levures apparaissant après 1-2 jours. Ces chiffres seront, désormais, être appelés à 0 h C. glabrata UFC (unités formant colonie).
3. Après 2 heures de co-culture des cellules THP-1 avec C. glabrata cellules, le milieu de culture des rejets en inversant la plaque à 24 puits pour culture de tissus iréservoir na et lavez doucement trois fois avec PBS préchauffé stérile pour éliminer nonphagocytosed extracellulaire C. cellules glabrata. Lavages doux avec du PBS sont absolument essentiels pour accomplir l'élimination complète de toute la levure extracellulaire sans causer aucun dommage à la THP-1 macrophages monocouche.

4. Mesure de la phagocytose taux intracellulaire et Réplication via Colony Forming Unit Test

1. Lyse C. glabrata infecté THP-1 macrophages dans 1 ml de H ₂ O stérile pendant 2 min, gratter doucement pour enlever les débris des macrophages du bien et de recueillir lysat de cellules dans un tube à centrifuger. Vérification microscopique de lyse complète des macrophages est essentiel pour la récupération de toute la levure intériorisé.
2. Préparer une dilution de 100 fois de lysat dans du PBS stérile, la plaque 100 pi sur milieu YPD solide et incuber les plaques à 30 ° C.
3. Après 1-2 jours, compter manuellement le nombre de C. glabrata colonies qui appeared sur milieu YPD, multiplier par le facteur de dilution (2 h de UFC) et de calculer le taux de phagocytose qui se réfère au pour cent de C. glabrata cellules qui sont ingérés par les cellules THP-1 macrophages après co-incubation de 2 h à l'aide de la formule suivante.
   % Phagocytose = [(UFC à 2 h) / (UFC à 0 h)] X 100
4. Pour mesurer le taux de réplication intracellulaire de C. cellules glabrata dans les macrophages THP-1, recueillir la levure intracellulaire à des moments différents de points après l'infection dire. 4, 6, 8, 10, 12, et 24 heures, en répétant les étapes 3.3 à 4.3.
5. Calculer fois survie / reproduction de C. cellules glabrata dans les macrophages THP-1 en divisant UFC total, à tout point de temps donné avec ceux à 2 h (levure phagocytés).

5. Surveillance de la réplication intracellulaire confocale Laser microscopie à balayage

1. Suivant les étapes décrites dans la section 1, de semences traitées au PMA 5 x 10 ⁵ cellules THP-1 dans chaque puits de deux lames de chambre de quatre puits et incuber à 37 ° C avec 5% de CO ₂ pendant 12 heures.
2. Remplacer ancien milieu de préchauffé milieu RPMI-1640 complet et permettent aux cellules de se remettre de traitement au PMA pendant 12 heures.
3. Préparer la GFP (green fluorescent protein) marqués C. glabrata suspension cellulaire tel que décrit à la section 2 et à infecter les macrophages THP-1 à une MOI de 1. Si C. glabrata souches exprimant la GFP ne sont pas disponibles, les cellules de levure marqués au FITC (isothiocyanate de fluorescéine) peuvent être utilisés pour surveiller les événements précoces après l'infection savoir. taux de phagocytose et phagolysosomique maturation à 2 h.
4. Incuber les lames pendant 2 heures à 37 ° C avec 5% de CO _2, inverser les soigneusement à jeter moyen et laver 3 fois avec stérile, préchauffé PBS.
5. Ajouter 500 ul préchauffé RPMI-1640 medi completum à chaque chambre d'un toboggan et incuber à 37 ° C avec 5% de CO ₂ pendant 22 heures.
6. Pour fixer 2 h C. glabrata infectés macrophages THP-1, ajouter 500 ul de 3,7% de formaldéhyde (préparé dans du PBS) pour chaque chambre de l'autre lame et incuber à température ambiante pendant 20 minutes dans l'obscurité.
7. Laver glisser trois fois avec du PBS, ajouter 500 ul de Triton-X (0,7%), et incuber à température ambiante pendant 5 min dans l'obscurité.
8. Laver les diapositives 3x avec PBS, supprimer chambre de lame de culture et sécher à l'air pour 3-5 minutes dans l'obscurité.
9. Enfoncer délicatement une lamelle en utilisant un milieu Vectashield montage contenant du DAPI (4 ',6-diamidino-2-phénylindole) sur la glissière en évitant la formation de bulles. Retirez doucement le liquide en excès avec Kimwipe et sceller les bords de lamelle avec du vernis à ongles. glissière de magasin dans l'obscurité à 4 ° C jusqu'à utilisation.
10. Répétez les étapes 5.4 et 5.6 à 5.9 pour traiter cellules THP-1 24 h post infection.
11. les cellules de l'éditeur en utilisant un confo à balayage lasercal microscope (60X objectif à immersion d'huile, une excitation à 405 nm et 488 nm pour la GFP et DAPI tache, respectivement).

Résultats

Analyse infection de PMA-traités macrophages THP-1 avec C. les cellules de type sauvage glabrata (wt) ont révélé que les cellules wt ont été phagocytés par des macrophages à un taux de 55-65% au bout de 2 h co-incubation. En outre, C. glabrata cellules étaient capables de résister à mort par les macrophages THP-1 et ont subi une moyenne de 5 - à 7 fois plus dans UFC après 24 heures de co-culture avec des macrophages THP-1 ^8. La réplication intracellulaire de c...

Discussion

Système immunitaire inné joue un rôle important dans le contrôle des infections fongiques opportunistes. Macrophages contribuent à la défense antifongique par ingestion et la destruction de l'agent pathogène fongique. Ainsi, l'élucidation des facteurs qui sont nécessaires pour la survie et / ou contrecarrer les fonctions antimicrobiennes des macrophages fera progresser notre compréhension des stratégies de virulence des champignons. Dans ce contexte, nous avons établi un système modèle in vitro...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
THP-1	American Type Culture Collection	TIB 202	Human acute monocytic leukemia cell line
RPMI-1640	Hyclone	SH30096.01	For maintaining THP-1 cells
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P 8139	Caution: Hazardous
YPD	BD-Difco	242710	For growing Candida glabrata cells
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages
Phosphate buffered saline (PBS)			Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl,  pH 7.4) for washes
Saline-sodium citrate (SSC)			Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes
Prehybridization buffer			Buffer (50% formamide, 5x Denhardt’s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization
VECTASHIELD mounting medium	Vector Labs	H-1200	For mounting slides for confocal microscopy
32P-labeled α-dCTP	JONAKI-BARC	LCP-102	For radiolabeling of signature tags
100 mm tissue culture dishes	Corning	430167	To culture THP-1 cells
24-well tissue culture plate	Corning	3527	To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages
4-chamber tissue culture-treated glass slide	BD Falcon	REF354104	To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages
Hemocytometer	Rohem India		For enumeration of cells
Table top microcentrifuge	Beckman Coulter	Microfuge 18	For spinning down cells in microtubes
Table top centrifuge	Remi	R-8C	For spinning down cells in 15 ml tubes
Spectrophotometer	Amersham Biosciences	Ultraspec 10	To monitor absorbance of yeast cells
Plate incubator	Labtech	Refrigerated	To grow C. glabrata cells
Shaker incubator	New Brunswick	Innova 43	To grow C. glabrata cells
Water jacketed CO2  incubator	Thermo Electron Corporation	Forma series 2	To culture THP-1 cells
Confocal microscope	Carl Ziess	Ziess LSM 510 meta	To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages
Compound microscope	Olympus	CKX 41	To observe C. glabrata and THP-1 macrophages
PCR machine	BioRad	DNA Engine	To amplify unique tags from input and output genomic DNA
Hybridization oven	Labnet	Problot 12S	For hybridization
PhosphorImager	Fujifilm	FLA-9000	For scanning hybridized membranes
Thermomixer	Eppendorf	Thermomixer Comfort	For denaturation of radiolabeled signature tags
Gel documentation unit	Alphainnontech	Alphaimager	To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels