Isolement de tissu adipeux cellules immunitaires

Résumé

Le tissu adipeux (AT) est un site d'activation intense des cellules immunitaires et de l'interaction. Presque toutes les cellules du système immunitaire sont présents dans A et leurs rapports sont modifiés par l'obésité. Une bonne isolation, la quantification et la caractérisation des AT populations de cellules immunitaires sont essentielles pour la compréhension de leur rôle dans la maladie immunometabolic.

Résumé

La découverte de l'augmentation de l'infiltration des macrophages dans le tissu adipeux (AT) de rongeurs obèses et les humains a conduit à une intensification de l'intérêt de la contribution des cellules immunitaires à l'insulino-résistance locale et systémique. L'isolement et la quantification des différentes populations de cellules immunitaires dans minces et obèses AT est maintenant une technique couramment utilisée dans les laboratoires de immunometabolism; soins encore extrême doit être pris à la fois dans l'isolement des cellules vasculaires stromales et dans l'analyse de cytométrie en flux de sorte que les données obtenues sont fiables et interprétables . Dans cette vidéo, nous démontrons comment mâche, digérer, et d'isoler la fraction vasculaire enrichie en cellules stromales immunitaire. Par la suite, nous montrons comment les macrophages de l'étiquette d'anticorps et des lymphocytes T et la manière de porte correctement sur eux des expériences de cytométrie en flux. Représentant parcelles de cytométrie de flux de matières grasses nourris gras nourris obèses souris maigres et élevé sont fournis. Un élément essentiel de cette analyse est l'utilisation d'anticorps qui nepas de fluorescence dans les canaux où AT macrophages sont naturellement autofluorescente, ainsi que l'utilisation des contrôles de compensation appropriées.

Introduction

Historiquement, le tissu adipeux (AT) a été considéré comme un organe inerte de stockage des lipides, qui se dilate et se contracte en réaction à l'équilibre énergétique. Nous comprenons maintenant que AT représente un organe endocrine qui sécrète dynamique activement un certain nombre d'hormones, qui influent directement sur le comportement alimentaire et l'homéostasie du glucose systémique. En outre, au cours de la dernière décennie, il ya eu une appréciation croissante pour les nombreuses populations de cellules immunitaires résidant dans l'AT fraction stroma vasculaire (SVF), ainsi que leur contribution à AT homéostasie.

La capacité de séparer le AT adipocyte et SVF en utilisant une collagénase digest suivie par centrifugation différentielle a d'abord été décrit par Rodbell en 1964 ^1. Collagénase II est le plus souvent utilisé pour la séparation des adipocytes et SVF pour cause de maintenance de récepteurs de l'insuline des adipocytes ^1. Dès le début, le fractionnement enzymatique de AT a été principalement utilisé pour étudier adipoCyte métabolisme et d'isoler les pré-adipocytes. Plus récemment, cette technique, combinée avec la large disponibilité des cytomètres et le nombre sans cesse croissant d'anticorps conjugué à un fluorophore disponibles dans le commerce, a facilité la caractérisation des cellules immunitaires AT.

Bien que la présence de cellules immunitaires dans enflammée AT avait été décrit précédemment ^2, les articles fondateurs de Weisberg et al. et Xu et al. publié en 2003 furent les premiers à documenter l'accumulation de macrophages AT (GAB) dans l'obésité, qui sécrètent des cytokines inflammatoires et en corrélation avec la résistance à l'insuline AT-spécifique et systémique ^3,4. Ces observations ont servi de base d'un nouveau champ d'investigation récemment inventé, "immunometabolism," ⁵ et ont été suivies par des études impliquant différentes populations de cellules immunitaires, dont les cellules dendritiques, les mastocytes ^{6 7, 8} cellules T ^-10, les cellules B, les cellules NKT ^{11 12 13,} les éosinophiles, les neutrophiles et ^14,15 dans le développement de l'obésité associée à une résistance à l'insuline.

Le but de cet article est de fournir une description détaillée de la technique digest collagénase utilisée pour isoler les cellules de la SVF AT et de caractériser les guichets automatiques et AT cellules T via la cytométrie de flux. Ce protocole a été optimisé pour les souris AT; toutefois, les téléspectateurs peuvent bénéficier de la lecture d'un excellent article fournissant de nombreux détails sur l'optimisation de cette technique pour l'homme à ^{16 ans.} Le public cible de cet article comprend des enquêteurs ayant une expérience limitée de travail avec la souris à effectuer et cytométrie de flux. Plusieurs considérations pratiques pour équilibrer le rendement et la viabilité cellulaire avec le temps et les ressources sont présentées ainsi que des contrôles de cytométrie de flux optimales pour caractériser les populations de cellules immunitaires. En plus de notre protocole, les lecteurs sont referred à un article de JoVE récente par Basu et al. pour une excellente discussion de quelques-uns des aspects techniques de cytométrie en flux pour inclure des contrôles et des compensations adéquates ^17.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

1. Réactifs et Consommables

Avant de lancer ce protocole expérimental, préparer les réactifs suivants:

1. Éthanol à 70%
2. PBS 1X
3. 1X DPBS (sans Ca et Mg) supplémenté avec 0,5% de BSA
4. FACS tampon: 1X DPBS (sans Ca et Mg), EDTA 2 mM, et 1% de SVF
5. Tampon ACK: 150 mM NH ₄ Cl, 10 mM KHCO ₃ et 0,1 mM Na ₂ EDTA dans l'eau

2. La récolte et la préparation du tissu adipeux

1. Euthanasier les souris selon des procédures IACUC approuvées propres à chaque institution.
2. Bien mouiller le pelage avec de l'éthanol à 70%.
3. Faire une incision au niveau de l'appendice xiphoïde (partie inférieure du sternum) et ouvrir la cage thoracique pour exposer le cœur, en prenant soin de ne pas couper tous les principaux vaisseaux sanguins.

Remarque: À ce stade, il est également utile de laisser le diaphragme intact autant quepossible et à faire une entaille sur le côté droit de la cage thoracique pour permettre au sang et perfusat de s'écouler hors de la cavité thoracique.

4. Coupez l'oreillette droite pour permettre au sang et perfusat d'échapper au système circulatoire.

Remarque: Lorsque vous traitez avec des souris obèses, l'excès de péricardiques AT devra peut-être être enlevé pour permettre l'accès au cœur.

5. Saisir le cœur avec une pince et insérer doucement une aiguille dans le ventricule gauche par le sommet. Perfuser lentement la souris avec 15 ml de PBS stérile.

Note: réduire le taux de perfusion si les poumons commencent à se remplir et se développer.

6. Ouvrez la cavité péritonéale et retirer les coussinets adipeux perigonadal utilisant soin d'éviter les tissus gonadiques.
7. Placez coussinets adipeux dans un bateau pèse sur la glace contenant 2 ml 1X DPBS (sans Mg, Ca) complémenté avec 0,5% de BSA, et émincez l'AT en petits morceaux.

Note: Limitez la quantité d'AT par bateau pèse 1,2 g. Si le montant de AT dépasse 1,2 g, diviser uniformément entre deux pesées bateaux.

8. Conserver à des échantillons sur la glace et préparer la solution 3 ml de collagénase digest par AT échantillon constitué de 1X DPBS complété avec 0,5% de BSA, 10 mM CaCl ₂ et 4 mg / ml de collagénase de type II.

3. digestion à la collagénase

1. Transfert AT à 50 ml tubes coniques en versant le broyat et le rinçage du bateau peser avec 1 ml de DPBS (BSA à 0,5%) et la solution 3 ml de collagénase II digest.
2. Incuber à broyat dans un shaker rotatif (200 rpm) à 37 ° C pendant 20 min.
3. Ajouter 10 ml (DPBS 0,5% BSA) à tubes coniques et les placer sur la glace.
4. Triturer homogénat de nombreuses fois à l'aide d'une pipette sérologique 10 ml, et de passer des suspensions cellulaires à travers le filtre 100 um dans un nouveau tube conique de 50 ml.
5. Centrifuger la suspension cellulaire à 500 g pendant 10 min à 4 & Dpar exemple; C.
6. Décanter le surnageant et remettre en suspension SVF culot cellulaire dans 3 ml de tampon ACK lyse contaminer les érythrocytes.
7. Ajouter 12 ml de tampon FACS et la suspension cellulaire par centrifugation à 500 g pendant 10 min à 4 ° C.
8. Décanter le surnageant et remettre en suspension SVF culot cellulaire dans un tampon FACS.

Remarque: Utilisez la taille du culot cellulaire comme un guide pour combien de tampon FACS pour remettre po Si le culot cellulaire recouvre le fond du tube conique de 50 ml, utiliser un tampon FACS 0,5-1 ml, sinon, remettre en suspension dans 0,25-0,5 ml.

9. Placer les échantillons sur la glace et préparer les portions de dilution 1:10 de chaque échantillon pour le comptage des cellules en mélangeant 40 pi de tampon FACS, solution de bleu trypan 50 pi (0,2%), et 10 suspension cellulaire ul.
10. Compter les cellules viables sur la base exclusion du bleu trypan et diluer les suspensions cellulaires à une concentration finale de 5-10 x 10 ⁶ cellules / ml.

4. La coloration des antigènes de surface cellulaire

1. Ajouter anti-souris CD16/CD32 anticorps (bloc Fc) à une concentration finale de 0,5-1 μg/10 ⁶ cellules et incuber sur de la glace pendant 10 min.
2. échantillons de transfert (≥ 10 ⁶ cellules) à 12 x tubes à fond rond de polystyrène de 75 mm. Préparer des tubes séparés si l'analyse des cellules T et DAB, et de combiner des cellules supplémentaires pour préparer un nombre suffisant de tubes pour accueillir la compensation requise et la fluorescence modifié Minus One (FMO) contrôles.

Note: Par exemple, lors de la quantification de la proportion de guichets automatiques basé sur F4/80 et CD11b, la rémunération suivante et contrôles FMO devra être préparé:

- Non marqué (cellules)

- DAPI ou l'iodure de propidium (PI) taches simples (cellules; n'ajoutent pas de colorant de viabilité jusqu'à l'étape 5.1)

- F4/80 APC (cellules ou des perles de compensation) simples tache

- CD11b FITC cellules ou simples tache (perles de compensation)

- FMO 1 (cellules): Rat IgG2a κ isotype contrôle APC + CD11b FITC + colorant de viabilité (ajouté à l'étape 5.1)

- FMO 2 (cellules): F4/80 APC + Rat IgG2b κ isotype contrôle FITC + colorant de viabilité (ajouté à l'étape 5.1)

3. Ajouter anticorps primaires fluorophores conjugués et / ou contrôles isotypiques à la concentration appropriée (voir le tableau des réactifs et du matériel).
4. Protéger les échantillons de la lumière et incuber à 4 ° C pendant 30 min.
5. Ajouter 2 ml de tampon FACS et la suspension cellulaire par centrifugation à 500 g pendant 5 min à 4 ° C.
6. Décanter le surnageant et remettre en suspension SVF culot cellulaire dans un tampon FACS 2 ml.
7. Centrifugeuse cellule suspension 500 g pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension SVF culot cellulaire chez ≥ 400 pi de tampon FACS.
8. Transférer des échantillons de 12 x 75 tubes à fond rond de polystyrène mm équipé d'un 35 um cellule passoire bustiers tubulaires.
9. Protéger de conserver les échantillons lumière, et à 4 ° C jusqu'à l'analyse FACS.

Note: Pour des résultats optimaux cellules doivent être analysées immeadiately; toutefois, l'analyse FACS avec ce protocole a été menée avec succès sur des cellules marquées stockées dans un tampon FACS pendant 1-2 heures à 4 ° C. Si les cellules doivent être fixés pour augmenter le temps de stockage, les cellules marquées peuvent être fixés à 2% de paraformaldéhyde à 4 ° C pendant 24 heures avant l'analyse FACS. sociétés d'anticorps suggèrent que les cellules marquées peuvent être stockées pendant une semaine, mais cela n'a pas été testé dans le cadre de cette procédure.

5. Analyse FACS

1. Avant l'analyse FACS, ajouter colorant de viabilité des échantillons et des contrôles appropriés pour permettre la discrimination de cellules vivantes / mortes.

Note: De nombreux colorants de viabilité sont disponibles dans le commerce, mais DAPI et PI sont recommandées en fonction de l'excitation / émission profiles de l'anticorps conjugué à un fluorophore étant utilisés. DAPI et iodure de propidium sont ajoutés à chaque échantillon à une concentration finale de 0,2 mg / ml.

2. Utilisez un échantillon de contrôle négatif sans tache, de préférence des cellules isolées à partir du même tissu que les échantillons expérimentaux, pour ajuster la diffusion latérale (SSC) et diffusion vers l'avant (FSC) de sorte que la population cellulaire (s) d'intérêt sont sur la balance.

Note: Pour l'analyse des AT cellules de la FSV, il est recommandé de SSC être affiché dans une échelle logarithmique en fonction de FSC dans une échelle linéaire. L'utilisation d'une échelle logarithmique pour SSC est particulièrement important lorsque l'on analyse les guichets automatiques, qui sont souvent très importantes et granulaire.

3. Dessiner une grille de diffusion de la lumière initiale basée sur le type de cellule (s) en cours d'analyse, et d'ajuster le tube photomultiplicateur (PMT) gain de sorte que les cellules non colorées sont à l'extrême gauche d'un histogramme à un seul paramètre (environ centrée sur 10 ²⁾ pour les voies appropriées.

Note: Il est recommandé que les lymphocytes et les macrophages (ou d'autres cellules myéloïdes) être analysés séparément en raison de différences dans les auto-fluorescence.

4. Utilisez des commandes simples ou colorés capture anticorps perles de compensation pour effectuer une compensation multi-couleur.

Note: L'utilisation de billes d'indemnisation est recommandée; toutefois, la compatibilité de chaque anticorps doit être assurée. Par exemple, des perles de compensation peuvent pas de réaction croisée avec des anticorps de lapin, dans ce cas, les cellules isolées sont nécessaires pour obtenir un contrôle tache unique approprié.

5. Réglez portes expérimentales basées sur les contrôles FMO modifiés.
6. Réglez le cytomètre de flux pour recueillir le nombre approprié d'événements basés sur la prévalence de la population d'intérêt et enregistrer des données expérimentales.
7. Les fichiers de données exportation FCS pour l'analyse hors ligne. Il existe de nombreux programmes disponibles pour cytometr de débitl'analyse des données y. Nous recommandons Cytobank, une plate-forme basée sur le Web qui permet aux investigatores pour stocker et analyser les données et de générer des chiffres depuis n'importe quel ordinateur avec accès internet ^18. En outre, Cytobank offre la possibilité de rendre accessible données publiques ou restreindre l'accès à des collaborateurs.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Collagénase digestion d'AT suivie par centrifugation différentielle a été utilisée pour isoler le SVF de coussinets adipeux épididymaires de souris C57BL/6J mâles nourris avec une faible teneur en gras (10% kcal provenant du gras) ou riche en graisses (60% kcal provenant du gras) régime (LFD et HFD , respectivement) pendant 16 semaines. Les cellules de la FSV ont ensuite été marquées avec des anticorps primaires fluorophore conjugué à quantifier la proportion de guichets automatiques viable (fig...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

L'intérêt croissant pour le rôle du système immunitaire dans les conséquences métaboliques de l'obésité a conduit à l'utilisation généralisée de la cytométrie en flux pour caractériser les cellules immunitaires de l'AT. Bien que le protocole exact variera entre laboratoires basés sur leur propre expérience et de l'équipement disponible, les étapes essentielles comprennent digestion à la collagénase, centrifugation différentielle, et la surface des cellules antigène étiquetage. ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml	Life Technologies	14190-250
DAPI	Life Technologies	D3571
BSA	Sigma	A2153-100G
collagenase	Sigma	C6885-5G
propidium iodide solution	Sigma	P4864-10 ml
stable stack 20 microliter	Rainin	SS-L10
20 microliter filter tips	Rainin	SRL10F
stable stack 250 microliter tips	Rainin	SS-L250
1000 microliter tips	Rainin	GPS-L1000
1000 microliter filter tips	Rainin	GP-L1000F
250 microliter Filter Tips	Rainin	SR-L200F
FC Block	BD Biosciences	553142
fisher 100mn strainers	Fisherbrand	22-363-549
medium weigh dish	Fisherbrand	02-202B
aluminum foil	Fisherbrand	1213100
mincing scissors	Fisherbrand	089531B
Vortex	Fisherbrand	2215365
50 ml conical tubes	BD Falcon	14-959-49A
filter top FACS tubes	BD Falcon	352235
10 ml pipette case 200	BD Falcon	1367520
round bottom tubes	BD Falcon	352058
5 ml syringe	BD Falcon	309646
V Bottom Plates	Costar	07-200-107
transfer bulb pipette	Thermo Scientific	13-711-22
Shaker	Thermo Scientific	11 676 071
Adhesive mat	Thermo Scientific	1368750
Cell Culture Centrifuge	Sorvall	75253839
Adapters	Sorvall	75003723
Rat anti-mouse CD16/CD32	BD Biosciences	553142	Concentration: 0.5 - 1 μg/ 106 cells
Rat anti-mouse F4/80	eBioscience	17-4801	Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 17-4321
Rat anti-mouse CD11b	eBioscience	11-0112	Fluorophore conjugate: FITC Concentration: 0.5 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 11/1/4031
Armenian Hamster anti-mouse CD11c	eBioscience	12-0114	Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: Dec-88
Goat anti-mouse MGL1/2	R&D Systems	FAB4297P	Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P
Goat anti-mouse CD206	R&D Systems	FAB2535P	Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P
Rat anti-mouse CCR2	R&D Systems	FAB5538P	Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC013P
Armenian Hamster anti-mouse TCRβ	BD Biosciences	553174	Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 553956
Rat anti-mouse CD8a	BD Biosciences	552877	Fluorophore conjugate: PE-Cy7 Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 552784
Rat anti-mouse CD4	BD Biosciences	557956	Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700 Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 557963
Table 1. List of Materials and Reagents.