Détection, visualisation et la quantification de la production d'espèces réactives de l'oxygène dans un système modèle Amoeba

Résumé

Nous avons adapté un ensemble de protocoles pour la mesure d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) qui peuvent être appliqués dans différents modèles cellulaires amibes et de mammifères pour les études qualitatives et quantitatives.

Résumé

Espèces réactives de l'oxygène (ROS) comprennent une gamme de molécules contenant de l'oxygène réactif et de courte durée, qui sont dynamiquement interconvertis ou éliminées soit catalytique ou spontanément. En raison de la durée de vie courte de la plupart des ROS et la diversité de leurs sources et localisations subcellulaires, une image complète peut être obtenue que par des mesures précises en utilisant une combinaison de protocoles. Ici, nous présentons un ensemble de trois protocoles différents à l'aide OxyBurst vert (OBG) revêtu perles, ou dihydroethidium (DHE) et Amplex Ultrared (AUR), de suivre qualitativement et quantitativement différents ROS dans les phagocytes professionnels tels que Dictyostelium. Nous avons optimisé les procédures de revêtement de perles et perles occasion OBG-enduits et microscopie en direct de visualiser dynamiquement intraphagosomal génération de ROS au niveau d'une seule cellule. Nous avons identifié le lipopolysaccharide (LPS) de E. coli comme un puissant stimulateur de la production de ROS dans Dictyostelium. En outre, nous Dtemps réel eveloped, essais à moyen débit utilisant DHE et AUR à mesurer quantitativement dismutase intracellulaire et H ₂ O ₂ de production extracellulaire, respectivement.

Introduction

Les espèces réactives de l'oxygène (ROS) sont impliqués dans une grande variété de processus biologiques tels que la défense de l'hôte, la signalisation, le développement tissulaire et réponse à la lésion, ainsi que l'hypertension artérielle et du cancer. Le mécanisme de la NADPH oxydase phagosome bien étudié est dédié à la génération de ROS rapide, connu sous le burst oxydatif, pour tuer les bactéries ingérées dans les phagosomes de neutrophiles ^1. En outre, les fuites d'électrons comme un sous-produit de la chaîne respiratoire mitochondriale a déjà été pensé pour être responsable que d'une source non réglementée de ROS. Mais récemment, il a été identifié comme un mécanisme important pour contribuer à la mise à mort intraphagosomal de bactéries dans les macrophages de souris ^2. Au cours des dernières années, l'amibe sociale, Dictyostelium, est devenu un modèle puissant et populaire pour étudier les mécanismes intrinsèques cellulaires de la réponse immunitaire innée. En effet, Dictyostelium et phagocytes humains partagent un niveau étonnamment élevé de conservation dans moleculales mécanismes responsables de la détection des bactéries, l'engloutissement et tuer ^3,4 r. Les homologues des protéines et des enzymes liées à la production ou à la détoxification des ROS, tel que NADPH oxydases, les catalases, les superoxyde dismutases, peuvent être trouvés à la fois humaine et de Dictyostelium. Comme l'amibe mieux étudié, Dictyostelium présente plusieurs avantages uniques sur le système de modèle de mammifère. Ils se développent à la température ambiante sans la nécessité pour le CO _2, avec un temps de doublement de 8-10 h. Ils peuvent être facilement conservées sous forme de cultures adhérentes ou en suspension. En outre, grâce à leur génome haploïde entièrement séquencé et annoté, et à la manipulation génétique facile, Dictyostelium est devenu un modèle expérimental très attrayant organisme.

Dans des études antérieures, divers dérivés chlorés et fluorés de fluorescéine (collectivement connu sous le nom OxyBurst Green, OBG) qui émettent une fluorescence après oxydation par ROS, ont été utilisés en tant que reporter ROS. Cellulaire infiltrant intérêtdérivés erified sont utilisés pour mesurer cytoplasmique ROS, alors-ou les dérivés du dextran couplés aux protéines cellulaires imperméant sont utilisés pour mesurer extracellulaire ROS. En particulier, des perles OBG BSA revêtues ont déjà été utilisés pour détecter la production de ROS phagosomale dans les cellules de mammifères ^5. Cependant, l'approche basée sur lecteur microplaque ne peut donner une courbe de génération de ROS moyenne d'une population de cellules. Avec le présent protocole, en utilisant Dictyostelium, un phagocyte professionnel, et les conditions expérimentales optimisées, nous obtenons la phagocytose stable et efficace sans la conjugaison tout opsonine sur les billes. DHE a été utilisée dans divers systèmes modèles, tels que les neutrophiles et les macrophages de mammifères, pour détecter la production de ROS ^9.6. Pendant ce temps, il ya des controverses sur la spécificité et la sensibilité de la méthode ^8,10. Comme une version améliorée de Amplex Red, l'intensité de fluorescence de AUR est moins sensible au pH, ce qui le rend plus approprié pour mesurerROS dans les milieux non-neutres ou faiblement acides. AUR a récemment été appliquée dans plusieurs systèmes de mammifères ^11,12, mais son utilisation dans les modèles non-mammifères, qui nécessitent souvent des milieux de croissance faiblement acide, n'a pas encore été signalé. En outre, il n'existe pas de protocole publié à mesurer quantitativement et dynamiquement la production de ROS et la localisation dans l'amibe sociale Dictyostelium.

Le but du jeu présenté des protocoles est de fournir une solution simple et souple pour surveiller divers ROS et leur localisation, et en outre donner un aperçu des mécanismes cellulaires ROS-liés. Pour le dosage OBG, nous avons utilisé la microscopie en direct pour surveiller l'ensemble du processus de génération de ROS phagosome après absorption de perles OBG revêtues par des cellules Dictyostelium, et proposons une nouvelle approche pour étudier le mécanisme de destruction intraphagosomal de bactéries. Nous avons optimisé moyen débit DHE et AUR essais dans Dictyostelium, pour mesurer superoxyde intracellulaireide et de H ₂ O ₂ extracellulaire production, respectivement, à l'aide de LPS comme un stimulateur puissant de ROS. Notez que le LPS a été récemment montré pour augmenter l'activité bactéricide de Dictyostelium vers bactéries phagocytées ^13. En outre, le traitement par DEDTC et de la catalase a confirmé explicitement que ces deux méthodes mesurent spécifiquement différents types et localisations subcellulaires de ROS dans Dictyostelium. Enfin, le dosage OBG peut être adapté à n'importe quelle cellule phagocytaire adhérente, par opsonisation en outre les perles avec des ligands pour les récepteurs phagocytaires des cellules animales. En principe, les tests DHE et AUR peuvent également être affiné pour les mesures dans une cellule adhérente ou non adhérente dans des conditions expérimentales appropriées.

Protocole

Une. Visualisation et de mesure qualitative de la production de ROS dans phagosomes

Les perles OBG enduits doivent être préparés à l'avance. Les procédures de revêtement de perles et technique de gélose sont adaptés de références publiées ^5,14.

1. Ajouter 1 ml de la suspension de 3,0 um billes de silice carboxylés (environ 1,8 x 10 ⁹ billes) dans un tube de 1,5 ml, laver les billes 3 fois avec 1 ml de PBS par centrifugation rapide et tourbillonnement.
2. Remettre en suspension les billes dans 1 ml de PBS contenant 25 mg / ml de cyanamide (pour activer les perles de silice se lient de manière covalente à carboxylés préalablement marqué BSA), sur une roue incuber pendant 15 min.
3. Laver 3 fois avec 1 ml de tampon de couplage (0,1 borate de sodium M, pH 8,0) par rotation rapide (centrifugeuse à pleine vitesse dans un dessus de table mini-centrifugeuse pendant 5 secondes ou encore centrifuger à 2000 g pendant 1 min dans une centrifugeuse de table) et vortex pour enlever l'excès de cyanamide.
4. Mélanger les billes lavées avec 500 ul de ctampon contenant 1 mg de OxyBurst vert (OBG) H2HFF (dihydro-2 ', 4,5,6,7,7'-hexafluorofluorescein)-BSA oupling, remplir le tube avec de l'azote gazeux à partir d'une norme gaz peut avant plafonnement, et incuber sur une roue pendant 14 heures (la nuit) à la température ambiante dans l'obscurité.
5. Laver les billes avec 2x 1 ml de tampon de trempe (250 mM de glycine dans du PBS) pour éliminer OBG n'ayant pas réagi, et deux fois avec du tampon de couplage pour éliminer le tampon de trempe par rotation rapide et tourbillonnement.
6. Ajouter 1 ml de tampon de couplage contenant 50 pg de l'Alexa Fluor 594 ester de succinimidyle de conjuguer à la BSA. Remplir le tube avec de l'azote avant plafonnement, et incuber sur une roue pendant 1,5 heure à température ambiante dans l'obscurité.
7. Laver les perles 3x avec 1 ml de tampon trempe par tour rapide et vortex pour arrêter la réaction, puis lavez les perles 3x avec 1 ml de PBS par centrifugation rapide et vortex.
8. Enfin, la remise en suspension des billes dans 1 ml de PBS avec 2 ul de 10% p / v d'azide de stockage à long terme. Mesurer la concentration des perles dans la suspension avec un hématimètre (généralement autour de 1-2 x 10 ⁹ billes / ml), remplir le tube avec de l'azote avant plafonnement, et conserver à 4 ° C dans l'obscurité.
9. L'efficacité du revêtement de la fluorescéine OBG peut être testée en contrôlant le spectre d'émission en utilisant une excitation à 500 nm. Lorsqu'il est oxydé par H ₂ O ₂ en présence de peroxydase de raifort (HRP), l'intensité de fluorescence des billes oxydées, au pic d'émission (538 nm), est de 11-12x plus élevée que celle des billes revêtues non oxydés.
10. Récolte croissance exponentielle des cellules Dictyostelium d'une boîte de 10 cm de Pétri, plaque différentes densités de cellules sur 3 cm plats avec un plastique optiquement transparent ou à fond de verre, et les cultiver pendant la nuit. Choisissez les plats qui sont environ 80% de confluence de l'expérience. Un protocole détaillé pour cultiver des cellules Dictyostelium a été publié ^{le 15.}
11. Remplacez le milieu de culture avec un milieu LoFlo (milieu de LF), incuber pendant2 heures avant l'expérience, afin de diminuer l'auto-fluorescence extracellulaire et intraendosomales du milieu de culture de HL5C.
12. En parallèle, faire fondre bacto agar 10 ml de 1,5% en milieu LF, verser l'agar sur une surface plane (une plaque de verre de 10 cm x 10 cm) pour former une couche d'agar environ 1 mm d'épaisseur, attendre 10-15 min se solidifier. Couper la couche d'agar dans 2 cm x 2 cm carrés et placer dans un milieu LF pour une utilisation ultérieure.
13. Pendant ce temps, préparer le disque tournant ou large microscope de champ, régler la température de la chambre de l'environnement à 22 ° C et ajuster les paramètres de cette expérience. (Voir les commentaires supplémentaires dans la discussion).
14. Après 2 h d'incubation, aspirer le milieu de la LF à partir de 3 cm plat, mais la monocouche cellulaire doit toujours être recouvert d'une mince pellicule de support. Diluer les billes revêtues à 1,5 x 10 ⁷ perles / ml et ajouter 10 ul sur la couche cellulaire.
15. Prenez une feuille agar carré, drainer l'excès de liquide mais garder humide. Placez délicatement ee agar carré sur le dessus de la couche de cellules. Ne pas déplacer le carré agar quand il est couché sur les cellules. La gélose est utilisée pour augmenter le contact entre les billes et les cellules, ce qui améliore l'absorption, et elle comprime légèrement les cellules, en les maintenant mieux dans le plan focal de l'objectif.
16. Placer le couvercle sur le plat, placez-le sur la platine du microscope, et automatiquement prendre des photos dans les canaux rouge, vert et de phase chaque 1 min pendant 2 heures ou plus.
17. Sélectionner et se concentrer sur les événements cellulaires qui contiennent l'ensemble du processus de phagocytose. Fusionner les 3 canaux optimisés et assembler les images dans un film en utilisant un logiciel professionnel de traitement d'image. Quantifier l'intensité de fluorescence de chaque perles choisies dans les canaux rouge et vert, et le rapport de vert / rouge reflète la dynamique phagosome la production de ROS des cellules.

2. Quantitative et moyen débit Mesure de la production de superoxyde intracellulaire

1. Recueillir o80% ne plat confluent de Dictyostelium dans 10 ml de milieu de HL5C. Cellules Centrifugeuse Dictyostélium à 850 g pendant 5 min, avec soin et excès du milieu aspirer complètement. Resuspendre les cellules dans un tampon de SS6.4 [0,12 M de sorbitol dans le tampon Sorensen (14,69 mM KH ₂ PO ₄ et 6,27 mM Na ₂ HPO _4), pH 6,4], compter les cellules et diluer à une densité finale de 6 x 10 ⁶ cellules / ml (voir les commentaires supplémentaires dans la discussion).
2. Ajouter 50 pi de suspension cellulaire dans chaque puits d'une plaque de 96 puits opaque blanc (voir les commentaires supplémentaires dans la discussion).
3. Diluer DHE actions (30 mM dans le DMSO) 500 fois avec SS6.4, pipette 50 ul de dilution DHE dans chaque puits à l'aide d'une pipette multicanaux si nécessaire. La concentration finale de la DHE est de 30 uM. La réaction commence immédiatement.
4. Stimuli ou inhibiteurs peuvent être ajoutés à ce moment, ou à d'autres points dans le temps en fonction des besoins spécifiques.
5. Utilisez le point final "top lecture & #34, le mode d'un lecteur de microplaques à fluorescence, avec une fluorescence excitation / émission à 522 nm nm/605, lire toutes les 2 min pendant 1 heure, le tremblement moyenne 5 sec / min, à 22 ° C.

3. Quantitatif à haut débit et la mesure de extracellulaire H ₂ O ₂ Production

1. Suivez les mêmes étapes décrites à la section 2.1 et 2.2.
2. Préparer HRP dilué par addition de 5 pi de HRP actions (100 U / ml dans l'eau distillée) dans 10 ml de SS6.4, vortex ou inverser le tube pour bien mélanger et garder sur la glace pour une utilisation ultérieure. La solution HRP dilué est de 0,05 U / ml.
3. Préparer le mélange réactionnel en mélangeant l'AUR AUR magasin (AUR 10 mM dans du DMSO) et la solution HRP dilué dans du tampon de SS6.4 aux concentrations finales de 6,25 uM, et 0,005 U / ml, respectivement. Par exemple, pour préparer le mélange de réaction pendant 40 réactions, mélanger 1 600 pi de SS6.4 avec 400 pi de HRP dilué et 2,5 pi de AUR solution stock.
4. Ajouter 50 ul de mélange AURture dans chaque puits en utilisant une pipette à canaux multiples, si nécessaire. Maintenant, la réaction démarre.
5. Stimuli ou inhibiteurs peuvent être ajoutés à ce moment, ou à d'autres points dans le temps en fonction des besoins spécifiques.
6. Utilisez le point le mode de fin "haut de lecture" d'un micro lecteur de plaque de fluorescence, avec une fluorescence excitation / émission à 530 nm nm/590, lisez toutes les 2 min pendant 1 heure, le tremblement moyenne 5 sec / min, à 22 ° C.

Résultats

La génération de ROS dans les phagosomes peut être visualisé qualitativement et de façon dynamique par microscopie (S1 du fichier). La fluorescence rouge émise par Alexa Fluor 594 est insensible au pH et reste constante dans le milieu de phagosome, tandis que l'oxydation de OBG augmente sa fluorescence dans le canal vert. Les spectres d'émission de oxydé in vitro et non oxydés OBG perles revêtues sont comparées sur la figure 1B, montrant une augmentation sign...

Discussion

Par rapport aux procédés décrits précédemment, le dosage OBG visualise dynamiquement le processus de génération de ROS phagosome au niveau de la cellule unique, au lieu de mesurer un signal moyen ROS partir d'une population de cellules. Ces méthodes population moyennes ont tendance à occulter des informations critiques causés par phagocytose non synchrone. Nous avons adapté avec succès DHE et AUR essais de Dictyostelium et optimisé les protocoles. Plus important encore, nous avons précisé les...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
OxyBURST Green H2HFF BSA	Invitrogen	O-13291
Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-20004
Carboxylated silica beads	Kisker Biotech	PSi-3.0COOH
HL5C medium	ForMedium	HLC0102
LoFlo medium	ForMedium	LF1001
Bacto agar	BD	204010
Dihydroethidium	Sigma	37291-25MG
Amplex UltraRed	Invitrogen	A36006
Horseradish peroxidase	Roche	10108090001
Diethyldithiocarbamate (DEDTC)	Sigma	D3506-100G
Catalase	Sigma	C9322-1G
Cyanamide	Sigma	187364-25G
Lipopolysaccharides	Sigma	L2630-25G
EQUIPMENT
ibidi μ-Dish 35 mm, high	ibidi	81156	Bottom made of optically clear plastic
MatTek dish 35 mm	MatTek corporation	P35G-1.5-14-C	Bottom made of a glass coverslip
Scepter Cell Counter	Merck Millipore	PHCC00000
White 96 well plate	Nunc	236108
Centrifuge	SORVALL	Legend RT
Microplate reader	BioTek	Synergy Mx