Un tégument Literie dosage à explorer génétiquement<em&gt; In Vitro</em&gt; Comment la germination des contrôles endosperme des semences dans<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

Résumé

Nous présentons la procédure pour assembler une literie de manteau essai de semences (ARA) de Arabidopsis thaliana graines. L'ARA s'est révélée être un outil puissant pour explorer génétiquement in vitro et la façon dont la germination des contrôles de l'endosperme de graines en dormance des graines et en réponse à des signaux lumineux. L'ARA est en principe applicable en vertu d'une situation où l'endosperme est soupçonné d'influencer la croissance embryonnaire.

Résumé

L'endosperme de Arabidopsis est constitué d'une seule couche de cellules entourant l'embryon mature et jouant un rôle essentiel pour empêcher la germination des graines ou dormants que des graines non dormantes irradiés par une impulsion de lumière rouge lointain (FR). Afin d'obtenir d'autres renseignements sur les mécanismes génétiques moléculaires qui sous-tendent l'activité répressive de germination exercée par l'endosperme, un test "graines de literie de manteau" (ARA) a été conçu. L'ARA est une procédure de dissection séparer physiquement les téguments et les embryons de graines, qui permet de surveiller la croissance des embryons sur une couche sous-jacente de téguments. Remarquablement, l'ARA reconstitue la germination activités répressives de l'enveloppe de la graine dans le contexte de la dormance des graines et de contrôle FR-dépendante de la germination des graines. Depuis l'ARA permet l'utilisation combinatoire de manteau de graines dormantes, dormantes et génétiquement modifiés et matériaux embryonnaires, les voies génétiques contrôlant la germination et spécifiquement operating dans l'endosperme et de l'embryon peut être disséqué. Ici, nous détaillons la procédure d'assembler un appareil respiratoire autonome.

Introduction

Dans les graines matures Arabidopsis, le tégument est composé de la testa, une couche externe de tissu mort d'origine maternelle, et l'endosperme, une seule couche de cellules de tissus vivants entourant directement l'embryon ^1. L'endosperme et l'embryon sont dérivés d'événements de fertilisation distinctes: l'endosperme est un tissu triploïde avec deux maternel et un génome paternel tandis que l'embryon est un tissu diploïde avec une mère et un génome paternel ^2.

La fonction principale traditionnellement attribué à l'endosperme est celui d'un tissu nutritif. Cependant, il est de plus en plus évident que l'endosperme joue également un rôle central pour contrôler la germination des graines. Cette notion est devenue la première apparente dans le cas de dormance, un trait présentée par graines nouvellement produites. Graines dormantes ne germent pas, malgré la présence de conditions favorables de germination. Graines perdent leur dormance après une période de maturation et deviennent nondormant, c'est à dire qu'ils vont germer lorsqu'il est exposé à des conditions favorables de germination. Chez de nombreuses espèces de plantes, y compris la plante modèle Arabidopsis, le tégument est absolument nécessaire pour empêcher la germination des graines dormantes depuis élimination du tégument déclenche la croissance embryonnaire et l'écologisation de ^3,4. Chez Arabidopsis, Bethke et al. Observé que la germination est resté refoulé après avoir enlevé le testa tout en maintenant l'endosperme entourant l'endosperme ^5. Ces observations indiquaient fortement que l'endosperme est le tissu à l'intérieur de l'enveloppe de la graine exerçant une activité répressive sur l'embryon. Cependant, semences expériences d'enlèvement de couche ne contribuent pas nécessairement à clarifier la nature de l'activité répressive de germination fournies par le tégument de la graine, ni d'identifier les gènes qui la mettent en œuvre.

Nous avons récemment lancé un essai graines de literie de manteau (ARA) où les téguments et les embryons sont physiquement séparés, mais conservés à promité de sorte que l'activité répressive de la germination fourni par l'endosperme est maintenue ^6. L'ARA permet l'utilisation combinatoire de manteau de graines dormantes, dormantes, et génétiquement modifiés et matériaux embryonnaires. En conséquence, les voies génétiques contrôlant la germination et fonctionnant spécifiquement dans l'endosperme et l'embryon peut être disséqués. L'ARA a été utilisé dans le cadre de la dormance de montrer que l'endosperme libère l'acide abscissique phytohormones (ABA) en direction de l'embryon à réprimer sa croissance ^6. De plus, nous pourrions utiliser l'ARA à identifier les voies de signalisation qui opèrent dans l'endosperme et tissus embryonnaires de promouvoir la dormance.

Le rôle de l'endosperme de contrôler la germination a été renforcée en considérant le cas de semences non dormantes exposés à une impulsion de rouge lointain (FR) lumière. Tôt sur ​​l'imbibition une impulsion de lumière FR est connu pour inhiber la germination ^7,8. Lorsque les téguments ont été retirés de graines d'une impulsion de lumière FRa été incapable d'inhiber la germination, ce qui suggère fortement que l'endosperme peut également réprimer la germination des graines non dormantes ^9. Fait étonnant, l'ARA peut également être utilisé pour récapituler FR-dépendante inhibition de la germination. Cela a permis de montrer que cette FR-dépendante inhibition de la germination des graines est également un processus impliquant ABA libération de l'endosperme ^9. En outre, l'ARA a permis d'identifier les différentes voies de signalisation lumineuse opérant dans l'endosperme et l'embryon de contrôler la germination des graines dormantes en réponse à des signaux lumineux ^9,10.

L'ARA apparaît donc comme une technique fiable pour explorer la fonction de l'endosperme dans le contexte du contrôle de la germination des graines. Il est également un outil puissant pour évaluer in vitro si les gènes soupçonnés de contrôler la germination opèrent dans l'albumen, l'embryon ou les deux tissus. Ici, nous détaillons les différentes étapes nécessaires à l'assemblage d'un appareil respiratoire autonome.

Protocole

Une fois que l'ARA est assemblé, la croissance de l'embryon est surveillé pendant plusieurs jours. Par conséquent, avant la procédure de dissection des semences et de l'assemblage de l'appareil respiratoire, il faut stériliser les semences pour éviter les contaminations futures qui pourraient empêcher une évaluation adéquate de l'effet du matériau d'enveloppe de graine sur la croissance embryonnaire.

Une. Graine de stérilisation

1. Verser 50 à 60 ul de graines d'Arabidopsis matures et sèches, dans un tube de centrifugation de 1,5 ml et de préparer une solution d'éthanol à 70%.
2. Ajouter 1 ml de solution d'éthanol à 70% pour le tube à centrifuger contenant les graines et agiter à température ambiante pendant 10 min à 1200 rpm dans un vortex.
3. Centrifugeuse microtube pendant 3 secondes à 4000 g de concentrer les graines au fond du tube.
4. Aspirer la solution d'éthanol à 70% à l'aide d'un embout d'aspiration sous vide en laissant soigneusement les graines au fond du tube à centrifuger.
5. Ajouter 1 ml d'eau distillée stérile à t il microtube contenant encore des graines.
6. Agiter à température ambiante pendant 10 min à 1200 rpm.
7. Centrifugeuse microtube pendant 3 secondes à 4000 g de concentrer les graines au fond du tube. Aspirer le surnageant de l'eau à l'aide d'un embout d'aspiration sous vide en laissant soigneusement les graines au fond du tube.
8. Ajouter 1 ml d'eau distillée, de l'eau stérile pour le microtube contenant encore des graines. Assurez-vous que le débit d'eau de manière homogène suspend les graines à l'intérieur du tube. Le but ici est d'éviter secouant outre, afin de préserver l'intégrité des graines.
9. Laissez les graines se déposent par gravité au fond du tube, en laissant le tube encore pendant 30 sec. Aspirer le surnageant de l'eau à l'aide d'un embout d'aspiration sous vide en laissant soigneusement les graines au fond du tube.
10. Répétez quatre fois les étapes 1.8 à 1.9. Dans l'ensemble de la procédure de stérilisation dure environ 30 min.

2. Graine de placage

ontenu "> Toutes les étapes suivantes sont exécutées à l'intérieur d'une hotte à flux laminaire afin de préserver des conditions stériles.

1. Préparer une plaque de boîte de Pétri (diamètre de 100 mm, 20 mm de hauteur), contenant 30 ml de milieu de germination préparé par autoclavage d'une solution contenant 4,3 g / L de milieu de Murashige et Skoog à 2,5 mM de 2 - (N-morpholino) éthanesulfonique (MES-KOH ; pH 5,7) et 0,8 g / L d'agar. Laisser la solution refroidir dans un bain d'eau à 50 ° C avant de le verser sur la plaque de boîte de Pétri.
2. Ajouter 200 ul d'eau distillée stérile dans le tube contenant les semences. Remettre en suspension les graines et les transférer sur la surface du milieu de germination à l'aide d'une pipette standard avec une pointe de 1 ml.
3. Éliminer l'eau entourant les graines sur la surface du milieu de germination à l'aide d'un embout d'aspiration à vide.
4. Laissez la boîte de Pétri contenant les graines sans son couvercle intérieur de la hotte à flux laminaire pendant 2 heures pour un séchage supplémentaire. Fermez la boîte de Pétri avec le couvercle et laisser reposer sous la laminaires'écouler armoire pendant environ 90 min de sorte qu'environ 4 heures se sont écoulées depuis l'ouverture de la procédure de stérilisation des semences (étape 1.2).

3. Graine Dissection

Les étapes suivantes nécessitent de travailler avec un stéréomicroscope placé à l'intérieur de l'armoire de la hotte à flux laminaire. Une pince Dumont # 5 avec tronquées (c.-à-franc) conseils facilite grandement la manipulation des graines (figure 1A).

1. Préparez une nouvelle plaque de boîte de Pétri contenant 30 ml de milieu de germination. Placer sur la surface des deux moyennes papiers juxtaposés rectangulaires stériles Whatman 3MM (1,5 cm x 1,0 cm, figure 1B, étape 1). Whatman 3MM papier est stérilisé à l'autoclave.
2. Transfert des graines sur les papiers Whatman 3MM aide de pinces stériles (figure 1B, étape 2).
3. Tenir une graine individuelle contre le papier Whatman 3MM en appuyant doucement sur la graine en utilisant les bouts arrondis juxtaposés de la pince tronquées ( Figure 1B, étape 3).
4. Couper le tégument (testa et endosperme) de la graine à l'aide d'une aiguille de seringue (par exemple l'insuline U100 seringue + 1 ml de seringue, 0,33 mm (29 G) x 12,7 mm) (figure 1B, étape 4). La forme de la graine d'Arabidopsis est ellipsoïdale et il est recommandé de couper l'enveloppe de la graine ainsi que les semi-axe principal plus longues aussi près que possible de l'endroit où les cotylédons sont joints à la radicule (c'est à dire de la pointe radical). Ceci aide à la libération en toute sécurité de l'embryon dans l'étape suivante de la procédure de dissection.
5. Poussez la semence contre le papier Whatman 3MM utilisant les bouts arrondis juxtaposés de la pince tronquées (figure 1B, étape 5). Cette étape libère l'embryon sur le tégument de la graine à travers l'ouverture créée à l'étape 3.4 (figure 1B, étape 6). Il est recommandé d'appliquer la pression sur la graine où la pointe des cotylédons sont en plus proche de la pointe de la radicule (c'est à dire l'écart from l'ouverture).

4. Assemblée de l'enveloppe de la graine Literie Assay (ARA)

Voir la discussion pour le bon choix du nombre de couches de semences et d'embryons.

1. Préparez une nouvelle plaque de boîte de Pétri contenant 30 ml de milieu de germination. Place sur la surface du support une pièce rectangulaire stérile (3,5 cm x 5,0 cm) de la maille en nylon (figure 2, étape 1).
2. Pour éviter des dégâts, les embryons et les téguments peuvent être déplacés à la surface des bords métalliques de la pince en les poussant doucement à l'aide de l'aiguille de la seringue (figure 2, étape 2). embryons de transfert et des téguments sur le maillage en nylon (figure 2, étape 3).
3. Monter une couche circulaire et unique de téguments en utilisant les forceps émoussé et l'aiguille de s'assurer que les graines manteaux sont à proximité comme beaucoup plus proche que possible (figure 2, étape 4). Essayez d'exposer autant que possible l'ouverture d'enveloppe de la graine produite par lel'aiguille vers le haut. Cette étape n'est pas systématiquement testé. Toutefois, on pourrait augmenter l'efficacité de l'ARA depuis substances diffusibles inhibant la croissance de l'embryon sont attendus pour diffuser directement vers l'embryon au lieu de s'en éloigner.
4. Placer les embryons comme une seule couche circulaire sur le centre de la couche de lit de semence assemblé à l'étape 4.3 (figure 2, étape 5). Veiller à ce que les embryons sont à proximité comme beaucoup plus proche possible.
5. Incuber les ARA sous lumière continue (40 pmol / m ² ec) à 20-21 ° C. Dans le cas où une impulsion FR est utilisé pour arrêter la germination, assembler l'appareil respiratoire sous une lumière normale, appliquer l'impulsion de FR comme décrit ⁹ et laissez boîte de Pétri dans l'obscurité.

Résultats

Des travaux antérieurs ont montré que les graines mutantes incapables de synthétiser GA ont été incapables de germer à la suite d'une forte accumulation de l'ABA dans les graines ^11,12. Cependant, l'incapacité à germer nécessite l'enveloppe de la graine depuis son enlèvement déclenche ¹³ de croissance embryonnaire. Ce fortement indiqué que l'endosperme de graines incapables de synthétiser GA publie ABA pour bloquer la croissance embryonnaire. Nous attendons donc gra...

Discussion

Le dosage de la literie de tégument (ARA) décrite ici est en principe applicable à toute circonstance où la germination des graines d'Arabidopsis est bloqué (ou retardée) et où l'endosperme est soupçonné de mettre en œuvre cette arrestation. Ce dernier peut être attestés par enlever le tégument (testa et endosperme) et en observant que le produit de croissance embryonnaires rapides par rapport à celle observée lorsque les embryons sont entourés par l'enveloppe de la graine. La germin...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thermomixer Comfort	Eppendorf AG	5355 000.011	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Vacusafe Comfort	INTEGRA Biosciences AG	158 310	Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland
Petri dish plate (100 mm x 20 mm)	Greiner Bio-One GmbH	664 102	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Murashige and Skoog	Sigma-Aldrich	M5524	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA
MES	Sigma-Aldrich	M3671	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA
Agar (plant agar)	Duchefa Biochemie B.V.	P1001	Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands
Dumont forceps #5	Fine Science Tools GmbH	11251-10	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany
Syringe needle	BD Micro-Fine	324827	BD, Franklin Lakes, NJ USA
Nylon mesh (SEFAR NYTEX)	SEFAR AG	03-50/31	Sefar AG, Heiden, Switzerland
Growth chamber	CLF Plant Climatics	Percival I-30BLLX	CLF plant Climatics, Wertingen, Germany
Paclobutrazol	Sigma-Aldrich	46046	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA