Entérique invasion bactérienne des cellules épithéliales intestinales<em&gt; In Vitro</em&gt; Est considérablement améliorée en utilisant une chambre diffusion verticale du modèle

Résumé

Effectuer des essais de culture cellulaire pour étudier l'adhésion bactérienne et l'invasion dans des conditions aérobies est généralement représentatif de la In vivo Environnement. Un modèle de chambre de diffusion verticale permet d'étudier les interactions de l'agent pathogène humain Campylobacter jejuni Avec des cellules épithéliales intestinales moins plus In vivo Des conditions similaires, résultant en une meilleure invasion bactérienne.

Résumé

Les interactions des bactéries pathogènes avec les cellules hôtes ont été étudiés largement en utilisant des méthodes de culture cellulaire in vitro. Cependant, comme ces essais de culture de cellules sont réalisées dans des conditions aérobies, ces modèles in vitro peuvent ne pas représenter exactement l'environnement in vivo dans lequel les interactions hôte-pathogène du lieu. Nous avons développé un modèle in vitro de l'infection qui permet la co-culture des bactéries et des cellules hôtes dans des conditions différentes de gaz moyenne et. La Chambre de diffusion verticale (VDC) modèle reproduit les conditions de vie dans l'intestin humain où les bactéries seront dans des conditions de très faible teneur en oxygène des tissus, tout sera alimenté en oxygène du sang. Placer cellulaires monocouches épithéliales intestinales polarisées (IEC) cultivés dans des inserts Snapwell dans un VDC crée compartiments apical et basolatéral séparés. Le compartiment basolatéral est rempli avec un milieu de culture cellulaire, étanche et perfusé avec de l'oxygène WHILST le compartiment apical est rempli avec du bouillon, maintenu ouvert et incubés dans des conditions micro-aérobies. Les deux Caco-2 et T84 les IEC peuvent être maintenus dans le VDC dans ces conditions, sans aucun effet nocif apparent sur la survie de la cellule ou à l'intégrité de la monocouche. expériences de co-culture réalisées avec différents C. souches de type sauvage jejuni et les différentes lignes d'IEC dans le modèle VDC avec des conditions microaérobies dans le compartiment apical résultent reproductible par une augmentation du nombre d'interagir (près de 10 fois) et des bactéries intracellulaires (presque 100 fois) par rapport aux conditions de culture aérobies ^1. L'environnement créé dans le modèle VDC rapproche le plus de l'environnement rencontrés par C. jejuni dans l'intestin humain et souligne l'importance d'effectuer des essais d'infection in vitro dans des conditions qui imitent de plus près la réalité dans vivo. Nous proposons que l'utilisation du modèle VDC permettra de nouvelles interprétations des interactions parierWeen bactéries pathogènes et des cellules hôtes.

Introduction

Les interactions des bactéries pathogènes avec les cellules hôtes ont été étudiés largement en utilisant des méthodes de culture cellulaire in vitro. L'utilisation de ces tests en culture cellulaire, l'adhérence des bactéries aux cellules hôtes, l'identification des récepteurs de la cellule hôte, la cellule hôte voies de signalisation et l'invasion bactérienne des cellules hôtes ont tous été étudiés en détail, ce qui entraîne de nombreuses observations importantes. Cependant, ces essais de culture de cellules sont réalisées dans des conditions aérobies qui peuvent ne pas être représentatifs de l'environnement in vivo. Une limite importante de modèles in vitro utilisés pour étudier les infections gastro-intestinales est que les conditions de culture, y compris des niveaux élevés d'oxygène sont généralement favorables à la survie des cellules eucaryotes. Toutefois, les conditions dans la lumière intestinale seront presque anaérobie. Pathogènes entériques dans un environnement très pauvre en oxygène expriment des gènes de virulence dont l'expression change dans des conditions aérobies ^2. Ainsi, les données obtenues en utilisant la norme de culture cellulaire modèles may donner une indication inexacte des interactions bactériennes avec des cellules hôtes.

Campylobacter jejuni est la principale agent causal de la gastro-entérite aiguë bactérienne dans le monde entier, avec des symptômes allant de la diarrhée légère à grave entérite inflammatoire. La majorité des C. jejuni infections suite à une gastro-entérite sans complication, cependant C. jejuni est également agent infectieux le plus souvent mentionné dans les neuropathies périphériques, y compris le syndrome de Guillain-Barré (SGB). Au Royaume-Uni, on estime qu'il ya plus de 500.000 cas d'entérite causées par C. jejuni chaque année avec un coût prévu de l'économie britannique de 580 millions de livres sterling. Dans le monde en développement, C. jejuni est la principale cause de mortalité chez les enfants. Malgré l'importance incontestable de l'infection à Campylobacter et des décennies de recherche, y compris l'analyse fondée sur la génomique complète, C. jejuni pathogénie est encore mal understood, contrairement à d'autres pathogènes entériques tels que Salmonella, Escherichia coli, Shigella et Vibrio cholerae. L'absence d'un modèle pratique des petits animaux est l'une des principales raisons de cette ^3. Aussi le largement utilisé dans les modèles d'infection in vitro sont plus inapproprié pour étudier microaerophilic C. jejuni que pour d'autres pathogènes entériques qui sont anaérobies facultatives. Alors que C. jejuni est reconnu comme un pathogène invasif, les mécanismes de C. jejuni invasion des cellules épithéliales intestinales (SAVA) sont encore peu claire ^4,5. C. invasion jejuni a été montré pour être dépendant soit microfilaments, microtubules, une combinaison des deux, ou ni ^5. La confusion dans ce domaine est très probablement dû à l'utilisation d'inapproprié dans des conditions d'essai in vitro.

Un certain nombre d'essais de culture de cellules ont été utilisées pour étudier les interactions de C. jejuniavec des cellules hôtes. Caco-2 ⁶ INT 407 ^{7, 8} et T84 lignées cellulaires ont été utilisées pour étudier les capacités d'adhérence et l'invasion de différentes C. souches jejuni. Toutefois, les niveaux d'adhérence bactérienne et l'invasion de C. jejuni avec les IEC sont considérablement inférieurs à ceux des autres pathogènes entériques ^9. La co-culture de C. jejuni avec les IEC est normalement effectuée dans un incubateur à CO ₂ dans des conditions proches de la teneur en oxygène dans l'atmosphère, nécessaire pour la survie des CEI. C. l'expression du gène jejuni sera très différent dans l'environnement pauvre en oxygène de la lumière intestinale par rapport aux conditions de l'oxygène atmosphérique.

L'utilisation d'un système de chambre de diffusion verticale (VDC) a été développé qui permet la co-culture des bactéries et des cellules hôtes dans des conditions différentes de gaz ^1,10,11 et moyennes. Ce système imite les conditions de vie dans l'intestin humain où les bactéries seront nonder conditions de très faible d'oxygène des tissus tout en seront alimentés en oxygène du sang. IEC monocouches polarisées cultivées dans des filtres de 0,4 um spéciaux ont été placés dans un VDC créant un compartiment apical et basolatéral, qui ont été remplis individuellement avec le bouillon bactérien et un milieu de culture de cellules, respectivement (figure 1). Le VCC a été placée dans l'atmosphère variables incubateur contenant 85% de N _2, 5% de O _2, et 10% de _CO2 à 37 ° C, ce qui représente les conditions optimales pour C. jejuni. Le compartiment apical a été laissée ouverte et exposée à l'atmosphère microaérobies à l'intérieur de l'atmosphère variables incubateur, tandis que le compartiment basolatéral scellé a été alimenté avec de l'oxygène par l'administration constant de 5% de CO ₂ / O mélange gazeux de 95% _2, avec un tube de sortie empêchant l'accumulation de pression . Caco-2 survie cellulaire et l'intégrité de la monocouche dans ces conditions ont été confirmées par le suivi élément transepithelialrésistance ctrical (TEER) à travers la monocouche de plus de 24 h de démontrer la survie des cellules Caco-2, la monocouche cellulaire et la séparation physique des compartiments basolatéral et apical dans des conditions pauvres en oxygène dans le compartiment apical. Le TEER de monocouches dans CDV entretenues dans l'atmosphère incubateur variable (conditions microaérobies) et dans une culture cellulaire CO ₂ incubateur standard (conditions aérobies) n'a pas montré de différences significatives, ce qui indique l'intégrité de la monocouche cellulaire sous différentes conditions atmosphériques ^1. Dans des conditions microaérobies, jonctions serrées sont restés présents et répartis uniformément entre les bordures de cellules avec un motif de coloration occludine similaire à des cellules maintenues dans des conditions aérobies ^1.

Les interactions de C. jejuni avec Caco-2 et T84 cellules dans le VDC a été étudiée en évaluant l'interaction bactérienne (adhésion et l'invasion) et l'invasion. Deux différente C. jejuni de type sauvage strains ont été utilisés ^1. C. jejuni 11168H est un dérivé hypermotile de la souche de la séquence originale NCTC11168. La souche 11168H montre les niveaux de colonisation beaucoup plus élevées dans un modèle de colonisation de poussin et est donc considérée comme une souche appropriée à utiliser pour les études sur les interactions hôte-pathogène. 81-176 est d'isoler un humain et est l'une des souches de laboratoire largement étudiés les plus envahissantes. C. souches jejuni ont été ajoutés au compartiment apical d'un VDC vertu soit des conditions micro-aérobies ou aérobie. Nous avons observé des taux plus élevés pour les deux interaction et l'invasion ont été enregistrées pour C. jejuni dans des conditions microaérobies ^1. L'augmentation C. interactions jejuni n'étaient pas dues à une augmentation du nombre de bactéries dans des conditions microaérobies ^1. Ces données confirment notre hypothèse que l'environnement faible en oxygène dans le compartiment apical de la VDC améliore les interactions bactéries-hôte et indique que les propriétés invasives de C. jejuni sont incrassouplies dans ces conditions. Ce fut le premier rapport de l'utilisation du modèle VDC pour étudier une bactérie pathogène invasif et souligne l'importance d'effectuer des essais d'infection in vitro dans des conditions qui imitent de plus près la situation in vivo. Le modèle VDC pourrait être utilisée pour étudier les interactions hôte-pathogène pour de nombreuses espèces bactériennes différentes.

Protocole

1. La croissance de monocouches CEI sur spéciaux 0.4 Filtres um

1. Cellules Caco-2 Culture en milieu essentiel modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% (v / v) de sérum de veau foetal, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine et 1% (v / v) les acides aminés non essentiels dans un incubateur de culture tissulaire standard à 37 ° C dans 5% de CO ₂ et 95% d'air. Seed 4 x 10 ⁵ cellules Caco-2 par les IEC 0,4 um filtrent et poussent à la polarisation pendant 21 jours, en changeant les médias tous les 2-3 jours.
2. Mesurer la TEER pour confirmer l'état de polarisation de la monocouche en utilisant un appareil de mesure de résistance Volt-Ohm. Dans nos études, le TEER de 21 jours Caco-2 des cellules cultivées dans ces filtres de 0,4 um est 700-800 ^Qcm2.

2. Préparation de C. jejuni et le milieu bactérien pour le test de co-culture

1. 24 heures avant le point de départ souhaitée du test de co-culture VDC, préparer une plaque de gélose au sang frais de C. jejuni et incuber à 37 ° C dans des conditions microaérobies (85% de N _2, 5% de O _2, et 10% de CO ₂₎ dans l'atmosphère variables incubateur.
2. Dans le même temps, préincuber 30 ml de bouillon Brucella à 37 ° C dans des conditions microaérobies dans une atmosphère incubateur variable.

3. Préparation et stérilisation de la moitié Chambers VDC avant l'essai

1. Chambres immerger complètement VDC demi ainsi que les joints toriques et les bouchons dans la solution de stérilisation.
2. Utilisation d'une seringue de 20 ml stérile, rincer la solution de stérilisation à travers les arrivées de gaz dans les deux demi-chambres. Ne pas le faire peut entraîner la contamination des échantillons au cours de co-culture.
3. Laisser tous les composants immergés dans la solution de stérilisation à> 1 h.
4. Rincer tous les composants avec de l'eau stérile frais, en utilisant une autre seringue de 20 ml stérile pour rincer les entrées de gaz.

4. Préparationde l'inoculum bactérien

1. Récolter un demi-plaque de C. croissance jejuni à partir de la plaque de gélose au sang préparé la veille dans 1 ml de bouillon de brucella préincubé. Ceci devrait vous donner ~ ¹⁰ 10 UFC / ml.
2. Mesurer la densité optique de la suspension bactérienne à 600 nm à semiquantify unités formatrices de colonies bactériennes (UFC).
3. Régler la suspension bactérienne au niveau de l'inoculum désiré dans 4 ml de bouillon de brucella préincubé.
4. Effectuer une dilution en série de cette suspension bactérienne finale suivie par placage des dilutions appropriées sur des plaques de gélose au sang en trois exemplaires, puis incuber à 37 ° C dans l'atmosphère variables incubateur pendant 48 heures afin de quantifier le nombre d'UFC bactériennes présentes dans l'inoculum.

5. Mise en place du VDC

1. Placez la moitié inférieure de la chambre un appartement VDC sur le banc. Monter un joint torique sur la demi-chambre basse.
2. Détacher un filtre portant les IEC de til porte et laver trois fois avec 400 pi de PBS stérile. Placer le filtre sur la moitié chambre basse, en s'assurant que le joint torique reste en place.
3. Abaissez doucement la demi-chambre supérieure en place. Une fois les deux demi-chambres sont assemblées, serrer ensemble à l'aide des plaques de serre-joints. Placez le VDC horizontalement sur la paillasse, avec les deux ouvertures vers le haut.
4. Ajouter les 4 ml d'inoculum bactérien dans la moitié apicale chambre.
5. Ajouter 4 ml de milieu de culture de cellules dans la demi-chambre basolatérale.
6. Placer les pièces d'extrémité dans les ouvertures sur les deux demi-chambres.

6. Fixation du VDC pour le collecteur de gaz au sein de l'incubateur d'Atmosphere variable

1. Placer le VCC dans l'atmosphère variables incubateur à proximité du collecteur de gaz.
2. Ouvrir le régulateur d'alimentation en gaz relié au collecteur de gaz. Fixer le tube à partir du collecteur dans l'entrée de gaz sur la demi-chambre basolatérale de la VDC. Fixez le gas tuyau de sortie menant hors de l'atmosphère variables incubateur à l'une des sorties de l'embout sur la demi-chambre basolatérale.
3. Fermez l'autre sortie dans l'embout sur la demi-chambre basolatérale. Ouvrez le flux de gaz sur le collecteur de gaz, en prenant soin de l'ouvrir très lentement pour éviter de surpression de gaz, car cela peut conduire à l'expulsion du milieu basolatéral.
4. L'objectif est un débit de gaz de 1 bulle toutes les 2-5 secondes. Vérifiez périodiquement le débit de gaz au cours de l'expérience et de l'ajuster si nécessaire.

7. Démontage de la VDC après Coculture

1. Après la période de co-culture approprié, fermer le régulateur d'alimentation en gaz relié au collecteur de gaz. Fermez le flux de gaz dans le VDC au niveau du collecteur. Déconnecter l'entrée de gaz, la sortie de gaz et le bouchon du VDC.
2. Retirez le VDC d'une atmosphère incubateur variable. Retirer le surnageant apical et basolatéral et conserver à -80 ° C pour subsequenanalyse t.
3. Enlevez les colliers de serrage et de prendre doucement à la VDC. Retirez le filtre de la chambre de moitié et le transfert d'une boîte de culture de cellules de 6 puits stérile. Laver les IECS trois fois avec 400 pi de PBS stérile.
4. Pour le dénombrement du nombre total de bactéries interagissent, ajouter 400 pi de PBS stérile contenant 0,1% (v / v) de Triton X-100 à les IEC et incuber pendant 20 min à température ambiante pour lyser la CEI. Effectuer une dilution en série de ce lysat cellulaire suivie par placage des dilutions appropriées sur des plaques de gélose au sang en trois exemplaires, puis incuber à 37 ° C dans l'atmosphère variables incubateur pendant 48 heures afin de quantifier le nombre d'interagir UFC bactériennes.
5. Pour le dénombrement du nombre total de bactéries envahissent, ajouter 400 ul de milieu de culture cellulaire DMEM contenant 150 ug / ml de gentamicine pour les IEC et les incuber pendant 2 heures dans un incubateur de culture tissulaire standard à 37 ° C dans 5% de CO ₂ et 95% air pour tuer les bactéries extracellulaires,puis suivre comme pour l'étape 7.4 ci-dessus.

8. Nettoyage de la VDC après Coculture

Laver le VDC avec de l'eau stérile et stocker pour la prochaine série d'expériences.

Résultats

expériences de co-culture effectuées avec un C. jejuni souche et les IEC dans le modèle VCC avec des conditions microaérobies dans le compartiment apical de type sauvage ont montré une augmentation du nombre d'interaction (près de 10) et les bactéries intracellulaires (près de 100 fois) par rapport à des conditions de culture aérobies dans un temps ^une manière dépendante. Cette observation était reproductible en utilisant deux différents C. jejuni souches de type sauvage (1...

Discussion

L'utilisation de méthodes de culture cellulaire in vitro pour étudier les interactions entre les pathogènes bactériens avec des cellules hôtes est une technique largement utilisée dans de nombreux laboratoires de recherche. Cependant, comme ces essais de culture de cellules sont réalisées dans des conditions aérobies, ces modèles in vitro peuvent ne pas représenter exactement l'environnement in vivo dans lequel les interactions hôte-pathogène du lieu. La largement...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts	Harvard Apparatus	66-0001	Manifold & six Snapwell chambers
Caps	Harvard Apparatus	66-0020
O-rings	Harvard Apparatus	66-0007
Clamps	Harvard Apparatus	66-0012
Snapwell filters (pore size 0.4 μm)	Corning Costar	3407
Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter	Millipore	MERS00002
WPA Lightwave II spectrophotometer	Biochrom	80-3003-72