Technique pour l'étude des arthropodes et communautés microbiennes dans les tissus des arbres

Résumé

We provide a technique to preserve intact tree phloem and prepare it for observation. We create an apparatus called a phloem sandwich that allows for the introduction and observation of arthropods, microbes, and other organisms that inhabit phloem tissues.

Résumé

Phloem tissues of pine are habitats for many thousands of organisms. Arthropods and microbes use phloem and cambium tissues to seek mates, lay eggs, rear young, feed, or hide from natural enemies or harsh environmental conditions outside of the tree. Organisms that persist within the phloem habitat are difficult to observe given their location under bark. We provide a technique to preserve intact phloem and prepare it for experimentation with invertebrates and microorganisms. The apparatus is called a ‘phloem sandwich’ and allows for the introduction and observation of arthropods, microbes, and other organisms. This technique has resulted in a better understanding of the feeding behaviors, life-history traits, reproduction, development, and interactions of organisms within tree phloem. The strengths of this technique include the use of inexpensive materials, variability in sandwich size, flexibility to re-open the sandwich or introduce multiple organisms through drilled holes, and the preservation and maintenance of phloem integrity. The phloem sandwich is an excellent educational tool for scientific discovery in both K-12 science courses and university research laboratories.

Introduction

Les tissus du phloème et l'écorce de conifères sont l'hôte de milliers d'organismes. Phloeophagy, l'alimentation sur les tissus du phloème de l'écorce interne, est une habitude généralement associée à des scolytes, insectes xylophages, et plusieurs autres taxons d'invertébrés et microbienne qui vivent dans les arbres ²³ scolytes. (Coleoptera: Curculionidae) développer et vivre dans le phloème, sauf pour de courtes périodes lorsque les adultes cherchent de nouveaux arbres. ³¹ scolytes ont été largement étudiés en raison de leurs impacts économiques sur les arbres ^18,19, mais les observations directes du comportement des insectes dans les matériaux d'arbres ont été limitées. ⁴ En outre, les galeries construites par les scolytes devenir un habitat pour une multitude d'espèces. ¹¹ Un grand nombre de champignons, de bactéries ^{30 3,} les acariens et les nématodes ^{10,21, 16,19} avec d'autres arthropodes prédateurs et parasites ^22,24 habitent la matière phloème. Les techniques proposées icipermettre une observation directe de scolytes, les acariens et les insectes xylophages qui vivent habituellement dans des environnements sous-corticales. De légères modifications au protocole peuvent être faites pour étudier les champignons et les bactéries.

Les scolytes et les organismes associés au sein de tissus d'arbres ont été étudiés à l'aide d'un "phloème sandwich." L'utilisation précoce de cette technique peut être trouvé dans la littérature remonte à 1933, quand il a été utilisé pour observer les stades larvaires de dendroctone du Douglas (Dendroctonus pseudotsugae). ² Le sandwich phloème a traversé de nombreuses dérivations que différents matériaux sont devenus disponibles. A l'origine, ce dispositif se composait d'un morceau de phloème placé entre deux plaques de verre, maintenues en contact par des bandes élastiques. ² Plus tard, pinces, ruban adhésif, de la colle, de plastique et d'autres matériaux ont été utilisés dans la construction du sandwich. ^{13,14 , 15,17,26,28} Le protocole décrit ici offre des améliorations sur certains des dessins passés. Par exemple, dansle passé, les espèces d'essai ont été entrées dans le côté du sandwich, entre les plaques de verre ou de plastique. Cette limite la construction de galeries à une direction. L'utilisation de trous d'entrée dans la plaque supérieure permet une plus grande liberté pour l'espèce utilisée pour initier la construction de la galerie naturelle. Un autre avantage du protocole présenté sa conception est simplifiée, ce qui peut être facilement réalisé avec peu d'outils. L'utilisation du sandwich phloème a permis des observations directes du comportement alimentaire, la reproduction, le développement, et les interactions des organismes qui seraient autrement pas été possible. ^{1,5, 22} Cette méthode est également un excellent outil pour K-12 l'éducation et de la science des programmes et des écrans.

Il ya plusieurs subtilités de la création d'un sandwich phloème qui sont difficiles à interpréter à partir ou non déclarés dans les manuscrits. Nous pensons qu'une (c.-à-vidéo) description visuelle de la production d'un sandwich phloème est nécessaire et seraitde valeur pour les scientifiques et les éducateurs intéressés à étudier les organismes de phloème. Notre protocole fournit un moyen simple et peu coûteux à observer les arthropodes, des microbes et autres organismes qui vivent dans les tissus du phloème.

Protocole

1. phloème Sélection et suppression de l'arbre

1. Sélectionnez un arbre avec des caractéristiques particulières. Recueillir phloème de pins (c.-à-arbres du genre Pinus) car ils ont une couche distinctif phloème qui est de plusieurs millimètres d'épaisseur. ^18,27 Une fois un arbre se trouve qui a peu de branches basses, l'inspecter pour d'autres défauts tels que des attaques d'insectes et / ou des agents pathogènes. Vous pouvez également utiliser le phloème d'autres conifères comme les épinettes dans les sandwichs du phloème. ⁹ autres espèces d'arbres peuvent être appropriés pour l'élimination phloème comme les feuillus.
   NOTE: Les conifères avec de grandes couronnes ont généralement le tissu du phloème épais. Pour maximiser la quantité de phloème, il est préférable de couper les arbres qui ont peu de défauts et de branches sur le tronc (tronc). espèces de pins qui sont de travail auto-élagage meilleur. Phloème est généralement plus épais au cours de la saison de croissance est plus épais et plus haut sur le tronc que près du sol. Phloème est parfois difficile de REMOVe des arbres pendant les saisons d'automne et d'hiver.
2. Couper un arbre vers le bas ou utiliser les journaux récemment coupés pour obtenir le phloème. Choisissez une direction de la chute qui permettra de minimiser les dommages à l'arbre ainsi que les arbres à proximité. Branches couper le tronc pour permettre un accès plus facile aux matériaux de l'écorce lors de l'enlèvement du phloème.
3. Une fois qu'un arbre est coupé (abattu; chuté sur le sol) commencer gratter l'écorce du tronc avec une lame de tirage forte (figure 1A).. Gratter une zone de l'écorce jusqu'à ce que le phloème est atteint.
   REMARQUE: Le phloème est généralement de couleur plus claire (par exemple, la couleur de la crème) et humide, tandis que l'écorce externe est plus sèche et de couleur plus foncée (Fig 1B.). Faites attention de ne pas égratigner le phloème. Le domaine de l'écorce raclée dépend de la taille de la pièce phloème (s) requis.
4. Après l'écorce est enlevée, couper un contour de la pièce phloème avec un couteau pointu. Assurez-vous que le couteau coupe tout le chemin à la xylème (Fig. 2A).
5. Pour supprimer le phloème, commencer dans un coin de la pièce phloème avec les doigts pour décoller délicatement l'phloème. Utilisez un couteau pour aider à racler le phloème de xylème. Continuer à tirer le phloème jusqu'à ce que la totalité de la pièce est retirée.
   REMARQUE: phloème pèle généralement hors de l'arbre le plus facile en été. Pour phloème qui est extrêmement difficile à enlever, un outil en forme de spatule peut aider à l'effort.
6. Placez le morceau phloème immédiatement dans un sac stérile. Pour de meilleurs résultats, sceller le sac vide (Fig. 2B) ou, si vous utilisez des sacs Ziploc, enlever tout l'air du sac. Cela augmente la longévité du phloème. En option, placez plusieurs morceaux de phloème dans un sac. phloème de magasin dans des sacs hermétiques légèrement au-dessus de congélation (entre 1 et 10 ° C) pour conserver sa fraîcheur.

2. Création du phloème Sandwich

1. Coupez deux morceaux égaux en acrylique transparent, le polycarbonate, ou un matériau dur et clair similaire (par exemple, le verre) légèrement grandr que le morceau de phloème (Fig. 2C). Sur les bords de l'acrylique pour empêcher les coins de déchirement du joint Parafilm. Ce protocole utilise un 1/8. Acrylique épais et clair.
   REMARQUE: La taille des morceaux coupés est fonction des besoins de l'organisme sujet et la durée de l'étude. Par exemple, une paire de scolytes utilise 4 dm ² de phloème sur une période d'un mois, mais seulement besoin de 1 dm ² si l'étude a lieu dans quelques jours.
2. Percez un trou dans l'une des pièces d'acrylique pour permettre l'entrée de l'organisme (s) de l'étude. La taille et le nombre de trous dépend des objectifs (Fig. 2D).
3. Avant de placer le phloème entre les pièces acryliques, stériliser la surface acrylique (avec> 70% d'éthanol) ou, si vous utilisez nouvelle acrylique, retirez le film de protection.
4. Placez le morceau frais de phloème entre les pièces d'acrylique stériles. Orienter la pièce d'acrylique avec le trou (s) sur la face intérieure ou extérieure du phloème, whichever est nécessaire. Typiquement, face à la face extérieure de la phloème (côté que l'écorce a sur elle) vers les trous d'entrée.

3. Sceller le phloème Sandwich

1. Pour créer un joint d'étanchéité temporaire autour du sandwich phloème, en utilisant deux. Larges bandes de Parafilm tiré sur les bords de la liber en sandwich (Fig. 2C). En variante, en utilisant une pellicule de chlorure de vinylidène pour sceller les bords. ⁶ Ensuite, placer un dispositif de serrage de chaque côté du sandwich à presser la acrylique pour le phloème. Assurez-vous que toute la surface est serrée vers le bas pour éviter l'espace aérien entre l'acrylique et le phloème (figure 2C). Si pas serré correctement, les échantillons peuvent se déplacer entre l'acrylique et le phloème.
2. Pour créer un joint d'étanchéité semi-permanent ajouter un époxy ou de pétrole non-collant gelée autour du phloème. Assurez-vous que le matériau entoure complètement le phloème. Ensuite, utilisez des pinces ou vis à vis (peut-être besoin de percer des trous à l'avance) pour maintenir le acrylique serré pour le phloème.Les sandwiches ne restent viables pendant un ou deux mois.
3. En fonction des besoins en oxygène des organismes d'étude, ajouter un filtre à air sur un ou plusieurs côtés du sandwich. Cela permettra à l'air de pénétrer dans le sandwich phloème mais de limiter la perte de la phloème de l'eau. Nous utilisons des filtres à charbon simples qui réduisent également le risque de contamination fongique et bactérienne.
4. Pour les échantillons de l'étude qui nécessitent entrée et sortie à volonté, remplacer l'un des morceaux de bois ou acrylique avec un matériau similaire qu'un insecte peut ennuyer en. Ceci est particulièrement important pour l'observation des insectes xylophages, car après leur état larvaire est terminée dans le phloème, ils ont ensuite porté dans le xylème.
5. Pour éviter des sujets d'essai de sortir des trous d'entrée, placer des petites boîtes de Pétri (ou d'autres objets, ruban) sur les trous, évasion blocage. Depuis organismes qui résident dans ces espaces sont habituer à des niveaux faible luminosité, il peut être nécessaire de placer les sandwichs dans une chambre ou boîte noire, ou le lieu omatériau paque sur le dessus pour bloquer la lumière.

4. Constatant organismes dans le phloème Sandwich

1. Présentez spécimens d'étude en entrée trou du sandwich phloème (Fig. 2D). Observer des spécimens en utilisant un microscope de dissection sous une lumière rouge ou lumière blanche fixée à un niveau faible (Fig. 2E).
2. Pour enregistrer les activités ou la croissance de spécimens dans le sandwich phloème fixer un appareil photo ou une caméra vidéo pour le microscope. Fixez caméras vidéo spéciales au microscope oculaire (Fig. 2E et F). Pour les très petits organismes tels que les acariens, les nématodes et pseudoscorpions, utiliser une caméra vidéo haute définition fixée au microscope.
3. Pour enregistrer des sons, des microphones insérer dans le trou du sandwich phloème d'entrée ou par le côté du sandwich phloème. Parce que le trou d'entrée est petit, utiliser un petit microphone comme un microphone à condensateur électret.
4. Pour enregistrer sur la face ou de la surface dele sandwich phloème utilise un élément piézo-électrique (Fig. 3B). Pour lire le son, utiliser le même élément piézo ou joindre un transducteur tactile (excitateur) à la surface de la partie supérieure ou inférieure de l'acrylique.

Résultats

Le protocole décrit ci-dessus permettra à un chercheur d'observer des organismes qui vivent dans l'environnement cryptique sous l'écorce d'un arbre. Pour illustrer l'utilisation de cette technique, nous décrivons une étude représentative de notre laboratoire qui utilise cette technique. ¹² Dans cette expérience, des sandwichs phloème ont été utilisés pour observer les effets des traitements acoustiques sur la reproduction, la distance de tunnel, et la survie des scolytes (Fig . 2E et 2F). L'observation directe des coléoptères, rendue possible par l'utilisation d'un sandwich phloème, a révélé plusieurs conclusions intéressantes. Tout d'abord, nous avons enregistré des distances quotidiennes de tunnels en marquant l'emplacement des coléoptères sur l'acrylique avec un marqueur toutes les 24 heures. Ce processus a révélé des différences significatives entre les traitements sonores qui auraient été dissimulées sans le sandwich phloème. Ensuite, nous avons observé une réduction de la production d'œufs avec notamment les traitements sonores. Le caractère mobile du sandwich phloème permis pour eobservations gg à être accomplies sous un microscope à dissection sans déranger les coléoptères. Au cours de ces observations, nous avons capturé comportement dendroctone du ponte avec une caméra haute définition fixée au microscope. Autres observations notables inclus le meurtre de copains et l'initiation de vol associés à des traitements acoustiques. Le dosage en sandwich phloème était crucial pour notre étude de scolytes réponses aux traitements acoustiques. Ces découvertes, ce qui serait impossible à observer sous l'écorce d'un arbre, sont de précieuses contributions à l'élaboration d'options de gestion pour la lutte contre les épidémies de scolytes.

Figure 1. A) Outils nécessaires pour enlever l'écorce de l'arbre. Articles 1 et 2 sont des lames de traction utilisés pour racler écorce de l'arbre. Articles 3 (hache) et 4 (pull scie) sont utiles pour enlever les brancheszone de rasage près. B) Utilisation de la lame de tirage au sort pour enlever l'écorce de l'arbre. Notez la couleur de la lumière du phloème sous l'écorce rougeâtre.

Figure 2. A) Retrait de phloème après écorce est grattée de l'arbre. B) phloème douce stockée dans le vide sac scellé. C) Phloème sandwich avec des pinces tenant les pièces acryliques ensemble et parafilm autour des bords pour éviter la contamination et à la dessiccation du phloème. D ) scolytes près trou percé dans acrylique. E) utilisant un microscope pour observer phloème sandwich. affichage F) Vidéo de scolytes dans le phloème sandwich.

Figure 3. A) acquisition de phéromone de coléoptères dans le phloème sandwich. L'air est aspiré par des tubes contenant Super-Q absorbant. B) Enregistrement et lecture du son via un transducteur piézo-électrique (centre de la photo) pour le dendroctone du pin de montagne dans le phloème sandwich.

Discussion

Le sandwich phloème permet l'introduction et l'observation des arthropodes, des microbes et autres petits organismes qui vivent dans les tissus du phloème ^{1,7,8,9,17,18} Cette technique a donné lieu à de nouvelles découvertes et une meilleure compréhension des comportements., Vie traits d'histoire, le développement, et les interactions des organismes au sein d'arbre phloème. ^1,5,10 Le protocole sandwich décrite ici est un hybride de conceptions passées, et fournira un sandwich à économique qui est facilement construit avec des équipements et des matériaux minime. Les morceaux de verre, acrylique, polycarbonate ou peuvent être réutilisés, et les seules matières consommables sont les Parafilm et le phloème.

Bien que toutes les étapes du protocole sont importantes, certaines étapes doivent être suivies strictement afin d'assurer le plus haut degré de succès. Tout d'abord, un arbre qui doit être située comporte une partie libre du fût, ou relativement libre, des branches. Les arbres qui ont de nombreuses branches sont difficiles à raser et la volonté yDOMAINE quelques morceaux phloème viables, comme chaque branche doit être coupé autour lors du retrait du phloème. Ensuite, il est important de minimiser l'exposition à l'air du phloème. Nous mettons rapidement chaque pièce phloème dans un sac lors de l'enlèvement. Après trois à six pièces sont enlevées, elles sont transférées dans un sac scellé sous vide; nous utilisons un variateur de puissance pour exécuter le scellant avec une batterie de véhicule sur le terrain. Dernière, la désinfection des pièces en acrylique et propreté générale lors de l'exécution de ce protocole permettra de réduire la croissance fongique dans le sandwich. Ceci est particulièrement important pour les observations prolongées.

Comme mentionné ci-dessus, il existe des limitations de l'appareil sandwich phloème. Etant donné que la couche mince est phloème, seuls de petits organismes qui restent généralement dans le phloème peuvent être introduits dans le sandwich. Grandes insectes tels que les insectes xylophages (c.-à-buprestid, espèces Cerambycid) peuvent être introduits et observés pendant les premiers stades de leur cycle de vie. Ce délai est généralement limité à deux pourde trois semaines; après ce point les larves nécessitent bois xylème pour percer pour la nymphose. En revanche, pour les scolytes, en particulier ceux dans le genre Ips, un cycle de vie complet peut être observée, y compris l'accouplement, l'éclosion des œufs, l'alimentation, la nymphose et l'éclosion dans un coléoptère adulte. À ce stade, la viabilité du sandwich est généralement épuisé en raison de la dessiccation et de la croissance fongique. ²⁸ En outre, cet appareil ne permet pas les insectes de coloniser ou quitter le sandwich phloème librement et naturellement. ²⁷

Notre protocole est flexible en termes de taille, la forme et le type de phloème utilisé. Les études à court nécessitent moins de matériel phloème et la taille sandwich peuvent être réduites en conséquence. De nombreuses espèces de conifères ont été utilisés comme donneurs phloème dans un sandwich phloème (par exemple, le pin ponderosa ^12, Douglas-sapin ^2, l'épinette ^{29, 27} pin à encens, pin des marais ^27). Matériaux dans le sandwich peut également être modifiée; pour exspacieuses, plaques de verre peuvent être utilisés à la place de l'acrylique et époxy ou du ruban à la place de parafilm.

La partie la plus difficile de ce protocole est le processus de suppression phloème. Les arbres à côté de l'autre peuvent différer dans la difficulté de leur phloème est à supprimer. Quand un arbre a phloème difficile, la patience est critique. Dans ces cas, exécutez soigneusement un couteau entre le xylème et le phloème dur spongieux. Ce processus se sent littéralement comme le dépouillement de l'arbre.

Après avoir maîtrisé la technique sandwich de base, des modifications au protocole peuvent aider à besoins spécifiques ajustement. Par exemple, en affinant les techniques nécessaires pour enlever le phloème, les gros morceaux peuvent être enlevés et utilisés pour créer de plus grands sandwichs. En outre, des modifications peuvent être faites pour accueillir des instruments spécifiques, par exemple, des trous supplémentaires pour surveiller les émissions de produits chimiques (Fig. 3A), ou enregistrement ou de lecture des sons (Fig. 3B). Des modifications peuvent être apportées afin de permettre à la préservation semi-permanent de la phloème et son orgueismes, ou pour les observations provisoires des organismes qui peuvent ensuite être remis en liberté.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Draw blade	Big Horn Brand	20265	11” blade
Fillet Knife	American Angler	30530	9” blade
Polycarbonate	Nexan	GE-33	0.093 in. thickness
Parafilm M	Fisher Scientific	S37441	2” wide
Clamps	Pony Jaw Opening	3201-HT-K	4” x 1”
Vacuum Sealer  and bags	FoodSaver	V2840; FSFSBF0742-015	VacLoc vacuum  bags in rolls