Analyse systématique des<em&gt; In Vitro</em&gt; Cellule de roulement en utilisant un système microfluidique plaque multi-puits

Résumé

Cette étude a utilisé un système microfluidique plaque multi-puits, ce qui augmente considérablement le débit des études de roulement de cellule sous flux de cisaillement physiologiquement pertinents. Compte tenu de l'importance de laminage de cellules dans la cellule multi-homing étape cascade et l'importance de la prise d'origine cellulaire après une délivrance systémique de populations de cellules exogènes chez les patients, ce système présente un potentiel en tant que plate-forme de criblage pour améliorer la thérapie à base de cellules.

Résumé

Un défi majeur pour la thérapie à base de cellules est l'incapacité à cibler systématiquement une grande quantité de cellules viables avec une grande efficacité pour les tissus d'intérêt après la perfusion intraveineuse ou intra-artérielle. Par conséquent, l'augmentation de la prise d'origine cellulaire est actuellement étudiée comme une stratégie pour améliorer la thérapie cellulaire. Cellule roulant sur ​​l'endothélium vasculaire est une étape importante dans le processus de prise d'origine cellulaire et peut être sondé in vitro en utilisant une chambre d'écoulement à plaques parallèles (PPFC). Cependant, il s'agit d'un essai de débit extrêmement fastidieuse, bas, avec des conditions d'écoulement mal contrôlées. Au lieu de cela, nous avons utilisé un système microfluidique plaque multi-puits qui permet l'étude des propriétés de roulement cellulaire dans un débit plus élevé dans des conditions contrôlées précisément, les flux de cisaillement physiologiquement pertinents ^1,2. Dans cet article, nous montrons comment les propriétés de roulement de HL-60 (leucémie promyélocytaire humaine) des cellules sur des surfaces E-sélectine-P-enduit et ainsi que sur les surfaces de monocouches-enrobées de cellules peuvent être readily examinée. Pour mieux simuler les conditions inflammatoires, la surface du canal microfluidique a été revêtu de cellules endothéliales (EC), qui ont ensuite été activés avec facteur de nécrose tumorale α (TNF-α), ce qui augmente considérablement les interactions avec les cellules HL-60 dans des conditions dynamiques. Le débit amélioré et intégré multi-paramètre plate-forme d'analyse d'un logiciel, qui permet une analyse rapide des paramètres tels que la vitesse de laminage et de chemin de roulement, présente des avantages importants pour l'évaluation des propriétés de laminage de cellules in vitro. Permettant une analyse rapide et précise des approches d'ingénierie conçues pour influer sur roulement cellulaire et homing, cette plate-forme peut aider à la thérapie avance à base de cellules exogène.

Introduction

L'un des principaux défis dans la traduction clinique de succès de la thérapie à base de cellules est la livraison inefficace ou le ciblage des cellules systémique infusées aux sites désirés ^3,4. Par conséquent, il ya une recherche constante des approches visant à améliorer la prise d'origine cellulaire, et plus particulièrement cellule de roulement, comme une stratégie pour améliorer la thérapie cellulaire. Cellule roulant sur ​​les vaisseaux sanguins est une étape clé dans la cascade de ralliement de la cellule, classiquement défini pour les leucocytes qui sont recrutés à des sites de la maladie ^5. Cette étape est gouvernée par des interactions spécifiques entre les sélectines endothéliales, c'est à dire P-sélectine E et leurs contre-ligands sur la surface de leucocytes ^5,6 (P-et E-sel), et. Une meilleure compréhension et une meilleure efficacité de la prise d'origine cellulaire, et plus précisément l'étape de laminage, sont d'une grande importance dans la quête de nouvelles plates-formes pour améliorer la thérapie à base de cellules. À ce jour, cela a été réalisé à l'aide de chambres d'écoulement parallèles de la plaque (les PPFCs), comprenant deux plate plates avec un joint d'étanchéité entre eux, avec un orifice d'entrée et de sortie situés sur la plaque supérieure, à travers lequel une suspension cellulaire est perfusé à l'aide d'une pompe à seringue ^{7,8, 9.} La surface de la plaque de fond peut être revêtue d'une monocouche de cellules / substrats pertinents et l'interaction entre les cellules perfusées et la surface sous écoulement de cisaillement est ensuite exploré ^7. Cependant, PPFC est un débit faible, réactif consommant, et méthode assez fastidieuse, la formation de bulles, de fuite et de flux mal contrôlés présentant des inconvénients majeurs.

Une technique alternative pour la FPNC traditionnel est un système microfluidique plaque multi-puits, ce qui permet de meilleures performances de débit de dosages cellulaires (jusqu'à 10 fois plus élevé que PPFCs) sous précis, le flux de cisaillement contrôlé par ordinateur, avec une faible consommation de réactif ^{de 1,10.} Expériences cellule de laminage sont exécutées à l'intérieur des canaux microfluidiques, qui peut être revêtu avec des monocouches de cellules ou de substrats innovants et usi imagéeng d'un microscope, avec des propriétés de roulement facilement analysée en utilisant un logiciel approprié. Dans cette étude, nous démontrons les capacités de ce système microfluidique plaque multi-puits par l'étude des propriétés de roulement de leucémie promyélocytaire humaine (HL-60) cellules sur différentes surfaces. HL-60 roulant sur des substrats tels que P-et E-sel, ainsi que sur des monocouches de cellules exprimant différents récepteurs de roulement, ont été analysées. En outre, un anticorps (Ab) de blocage a été utilisé pour démontrer l'implication directe des sélectines spécifiques dans la médiation du mouvement de roulement du HL-60 sur ces surfaces. Expériences de roulement ont été réalisées avec un débit accru, sous flux de cisaillement stable, avec un minimum de consommation du réactif / cellulaire, permettant une analyse efficace des paramètres de laminage clés tels que la vitesse de roulement, le nombre de cellules de roulement et roulement propriétés du chemin.

Protocole

Une. Culture cellulaire

1. Leucémie promyélocytaire humaine (HL-60), les cellules
   1. Culture cellules HL-60 en flacons de 75 ^cm2 avec 15 ml d'Iscove Modified Medium (l'IMDM) de Dulbecco, supplémenté avec 20% (v / v) de sérum bovin fœtal (FBS), 1% (v / v) de L-glutamine et 1 % (v / v) de pénicilline-streptomycine.
   2. Changer de support tous les 3 jours en aspirant la moitié du volume de la suspension cellulaire et de la remplacer avec des milieux IMDM complet.
   3. Pour le diacétate de carboxyfluorescéine, ester de succinimidyle (CFSE), la coloration, la centrifugeuse HL-60 suspension de cellules (400 x g, 5 min), remettre en suspension dans une solution à 1 pM de CFSE (préparé dans du PBS préchauffé) et incuber pendant 15 min à 37 ° C. Puis centrifuger les cellules, aspirer le surnageant et remettre les cellules en milieu préchauffé frais pendant 30 min. Laver les cellules dans du PBS et ensuite utiliser pour des expériences de roulement (voir la figure 1B pour image représentative de CFSE colorées cellules HL-60 sur P-sel-surface revêtue).

Note: CFSE coloration est facultative, et est présenté ici pour démontrer le phénomène de roulement dans le canal microfluidique. Analyse des paramètres de laminage présentés dans ce manuscrit a été réalisée sur des cellules non colorées en utilisant l'imagerie en fond clair standard.

2. Cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires (LMVECs)
   1. Manteau de 100 mm des boîtes de Pétri avec une solution de gélatine à 0,1% (v / v dans du PBS) et incuber à 37 ° C pendant au moins 30 min.
   2. LMVECs de culture sur 100 mm plats enrobés de gélatine de Petri dans un milieu complet de croissance de l'endothélium (endothélium milieu de base-2 (EBM-2)), complété par un kit spécifique de supplément de croissance, voir réactifs). Changer de support tous les jours et les cellules sous-culture à 80-90% de confluence.
   3. Pour la sous-culture, laver les cellules avec du PBS, puis détacher les cellules avec 4 ml de trypsine-EDTA 1x pendant 3 min à 37 ° C et neutraliser dans un volume égal d'complets EBM-2 médias. Transférer la suspension cellulaire à un tube de 15 ml et centrifuge (400 xg, 5 min). Après la centrifugation, remettre en suspension le culot dans 1 ml de milieu complet endothéliales et compter les cellules avec un hémocytomètre. Ne pas trop le passage des cellules, car cela affecte leur morphologie et de la fonction d'utilisation seulement des cellules dans le passage 7 pour toutes les expériences.

3. Ovaire de hamster chinois-P-sélectine (CHO-P) Cellules
   1. CHO-P cellules, qui sont des cellules CHO transfectées de façon stable pour exprimer P-sel humaine, ont été fournis par les collaborateurs (Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School) ^11,12.
   2. Culture CHO-P cellules T175 cm ² flacons de 25 ml de F-12 médias.
   3. Pour les passages, laver les cellules avec 10 ml de PBS pendant 4-5 secondes, puis trypsiniser dans 10 ml de 1 x trypsine-EDTA pendant 3 min à 37 ° C, suivie d'une neutralisation dans des milieux complets.
   4. Centrifuger la suspension cellulaire (400 xg, 5 min), aspirer soigneusement le surnageant, remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de médias complètes et compter les cellules avecun hémocytomètre.

2. Fonctionnement du système microfluidique intégré plaque multi-puits

1. Assurez-vous que tout le matériel est correctement connecté et tourner sur les différents modules: ordinateur, contrôleur, microscope inversé, et la caméra CCD.
2. Ouvrez le logiciel d'imagerie; s'assurer que le module de plaque multi-puits et le module d'imagerie sont correctement présentées à l'écran.
3. Raccorder les tubes du piège de la vapeur (connecté au contrôleur) et également les connecter à l'interface de pression.
4. Placer la plaque multi-puits de la plaque de chauffage / adaptateur. Ajouter les réactifs dans les puits (décrits ci-dessous) et fixer l'interface sur le dessus de la plaque. Placer la plaque pour l'imagerie sur scène automatisé.
5. L'interface se fixe sur le dessus de la plaque et applique une pression pneumatique à partir de l'unité de commande à la partie supérieure des puits, entraînant le fluide à travers les canaux microfluidiques à la vitesse d'écoulement définie, facilement contrôlé en utilisant la plaque multi-puitsécran du module en mode manuel.
6. Les réactifs dans le flux de canal à travers une zone d'observation, situé entre les puits. Dimensions du canal microfluidique sont 350 m de large x 70 um de hauteur. La longueur de la chaîne linéaire est de 1 mm et le fond des canaux comprend une lamelle couvre-objet en verre de 180 um, ce qui est compatible avec le fond clair, de la phase, de la fluorescence et microscopie confocale.
7. Acquérir des vidéos en utilisant une caméra CCD (acquisition de flux, 11 images / s) et d'analyser via un logiciel compatible.

3. Revêtement de canaux microfluidiques avec un substrat protéique ou une monocouche de cellules

1. Revêtement canal microfluidique avec la fibronectine ou P-/E-selectin
   1. Préparer 1 ml de 20 pg / ml solution de fibronectine dans du PBS. Modifier le volume en fonction du nombre de canaux à revêtir (25 à 50 ul en utilisant de la fibronectine par canal).
   2. Ajouter 25 à 50 ul d'une solution de fibronectine à chaque puits d'entrée. Appliquer la force de cisaillement de 2 dyn / cm ²pendant 5 min pour perfuser le canal. S'il vous plaît noter le cordon de liquide apparaissant dans le puits de sortie. Incuber pendant 30-45 min à température ambiante
   3. Aspirer la solution de puits (ne pas aspirer directement à partir du cercle du milieu qui alimente le canal) ^1,13. Ajouter 200-500 ul de PBS dans une prise bien et laver avec du PBS canal en appliquant flux de cisaillement de 2 dyn / cm ² pendant 5 min. Le canal est maintenant convenablement revêtue avec de la fibronectine et prêt à être utilisé.
   4. Pour enrober de P-ou E-SEL, préparer une solution à 5 ug / ml de la protéine humaine recombinante souhaitée dans du PBS, et enduire les canaux tels que décrits ci-dessus, avec une heure d'incubation à 37 ° C pour permettre le revêtement de surface.
2. Création de CHO-P ou LMVEC monocouche à l'intérieur du canal microfluidique
   1. Trypsiniser en douceur les cellules de boîtes de culture pendant 3 minutes, éteindre en utilisant un volume de 2 fois de médias complètes et centrifuger (5 min à 400 g). Resuspendre les cellules avec 10 ml de milieu complet et centrifuger (5 min à 400 g) contn.
   2. Compter les cellules pour déterminer la concentration des cellules dans la suspension. Afin d'assurer la formation d'une monocouche confluente LMVEC à l'intérieur du canal, amener la concentration cellulaire de 15 à 20 millions de cellules / ml. Pour une confluence CHO-P monocouche de cellules, utilisez 50-60000000 cellules / ml. Utilisation de 25 à 50 pl de suspension de cellules pour chaque canal - déterminer le nombre initial de cellules utilisées pour l'expérience en conséquence.
   3. Ajouter 25 à 50 ul de suspension de cellules dans la concentration appropriée à l'avaloir. Placer la plaque sur la platine du microscope et introduire des cellules dans le canal (2 dyn / cm ²⁾ jusqu'à ce que les cellules sont observées sur l'écran remplissage des canaux entiers, puis arrêter le flux.
   4. Remplissez la fois entrée et la sortie avec 200 ul de LMVEC plein ou CHO médias. Laissez les cellules se déposent et adhèrent pendant 3 heures dans l'incubateur (37 ° C, 5% de CO _2).
   5. Après l'incubation de 3 heures, lavez le canal en pleine médias (2 dyn / cm ^2, 10-15 min) pour éliminer les seulescellules. Les cellules doivent maintenant semblent complètement confluentes et le canal est maintenant prêt à l'emploi. En fonction de la densité initiale de l'ensemencement des cellules, 2-3 hr supplémentaires de temps de décantation peut être nécessaire pour assurer une couverture complète de la surface avec les cellules.

4. LMVEC activation pro-inflammatoire et des anticorps bloquant P-/E-selectin

1. Préparer une solution de TNF-α (10 ng / ml) dans du milieu de base LMVEC.
2. Pour induire l'activation inflammatoire des LMVEC dans les canaux, ajouter 100 ul de la solution de TNF-α à l'avaloir et introduire la solution dans le canal en appliquant l'écoulement de cisaillement de 2 dynes / cm ² pendant 5 min. Pour les canaux de contrôle (non activé EC), ajouter 100 ul de LMVEC milieux de base à l'entrée et ainsi introduire dans le canal (2 dyn / cm ² pendant 5 min). La chaîne est maintenant prêt pour un essai de roulement.
3. Pour bloquer P-sel et E-sel sur LMVECs et les cellules CHO-P, introduire neutraliser P-sel (clone AK4, 5 ug / ml dans bamédias sal) ou E-sel (clone P2H3, 5 ug / ml dans les milieux de base) des anticorps dans le canal et incuber pendant 1 heure à 37 ° C. Ensuite, laver les canaux avec les médias de base (2 dyn / cm ² pendant 5 min). Les canaux sont maintenant prêt pour un essai de roulement.

5. HL-60 roulement Essai sur monocouches-Coated Substrat / Téléphones canaux microfluidiques

1. Examiner attentivement les canaux sous le microscope pour confirmer que les chaînes sont correctement revêtus (dans le cas d'un revêtement avec des cellules, une monocouche de cellules totalement confluent doit être observé).
2. Pour préparer HL-60 suspension de cellules pour les expériences de roulement, centrifugeuse HL-60 suspension de cellules (5 min à 400 g) et laver une fois avec les médias de base. Compter les cellules et remettre en suspension dans IMDM (milieu de base, contenant du Ca ^{2 +} et Mg ^{2 +)} pour créer une suspension de cellules HL-60 avec 5 millions de cellules / ml. Utilisation de 25 à 50 pl de suspension de cellules pour chaque canal pour réaliser le dosage de roulement.
3. Ajouter 25-50 pi de la suspe cellulairension bien sortie, place plaque à l'intérieur de la plaque support à température contrôlée (37 ° C) et le placer sur la platine du microscope. Ensuite, introduire des cellules dans le canal en appliquant une force de cisaillement de 2 dyn / cm ² (cellules doivent être observées dans 10-15 secondes s'écoulant de la sortie à l'entrée).
4. Pour examiner la réponse de roulement en fonction de la contrainte de cisaillement, de réduire cisaillement à 0,25 dyn / cm ² et acquérir 20-30 vidéos sec (en utilisant la fonction «d'acquisition de flux") dans chaque cisaillement désirée (augmenter cisaillement progressivement de 0,25 à 5 dyn / cm ^2. Il est également possible d'utiliser des cisailles supérieures).
5. Acquérir des vidéos en utilisant une caméra CCD (acquisition de flux, 11 images / s) et d'analyser roulant des chemins de roulement et les vitesses via un logiciel compatible.

6. La cytométrie en flux pour détecter l'expression de molécules de surface

1. À la suite de traitement à la trypsine, préparer une suspension de cellules (à l'aide de 1 à 2 x 10 ⁵ cellules / échantillon) de type cellulaire souhaité (HL-60, des cellules CHO-P ou LMVECs) dans du PBS (- / -), supplémenté avec 2% de FBS. Laver les cellules deux fois et porter le volume de l'échantillon de 50 pi (en utilisant le même tampon).
2. Incuber chaque échantillon avec le fluorophore conjugué Ab souhaitée (voir tableau ci-joint pour plus d'informations) à 4 ° C pendant 20 min (couvrir de papier d'aluminium).
3. Laver les cellules deux fois (même tampon) et porter le volume final de la suspension de cellules colorées à 200 ul. Analyser des échantillons en utilisant un cytomètre en flux pour détecter l'expression de molécules de surface.

Résultats

Cellules HL-60 roulent sur des surfaces de la P-sélectine et E-, mais pas sur la fibronectine

Cellules HL-60 sont considérés comme l'étalon-or "rouleaux" parce qu'ils expriment une variété de ligands à tête chercheuse, y compris les ligands de roulement P-glycoprotéine ligand sel-1 (PSGL-1) et Sialyl-Lewis X (sLex) ^5,14 (figure 1A ). Les protéines de surface PSGL-1 agit comme un échafaudage pour le tétra-saccharide sLex, médiatrices int...

Discussion

L'un des principaux défis dans la traduction réussie de la thérapie à base de cellules exogène est l'incapacité de livrer efficacement les cellules à des sites de lésion et l'inflammation à haute efficacité greffe ^3. Cellule de roulement représente une étape cruciale dans le processus de prise d'origine cellulaire, facilitant la décélération de cellules sur les parois des vaisseaux sanguins, conduisant finalement à leur adhésion ferme et la transmigration à travers l'endo...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Lung Microvascular Endothelial Cells	Lonza	CC-2527
P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P)	Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12
HL-60 Cells	ATCC	CCL-240
Cell Culture Reagents
Endothelial Basal Medium	Lonza	CC-3156
EBM-2 Media	Lonza	CC-3156
Endothelial Basal Medium Supplements	Lonza	CC-4147
EGM-2 MV SingleQuots	Lonza	CC-4147
IMDM - Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1x	Gibco	12440
F-12 (1x) Nutrient Mixture (Ham)	Gibco	11765-054
Penicillin Streptomycin (P/S)	Gibco	15140
L-Glutamine (L/G) 200 mM	Gibco	25030
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta Biologicals	Sa550
Petri Dishes	BD Falcon	BD-353003
100 mm Cell Culture Dish, Tissue-Culture Treated Polystyrene
Centrifuge Tubes (15 ml polypropylene conical tubes)	MedSupply Partners	TC1500
T75 Flasks	BD Falcon	353136
Gelatin Solution (2%)	Sigma	G1393
dPBS (without calcium chloride and magnesium chloride)	Sigma	D8537
Trypsin-EDTA Solution (10x)	Sigma	T4174
Antibodies
Anti-hE-Selectin/CD62E	R&D Systems	BBA21
FITC Conjugated Mouse IgG1	R&D Systems	BBA21
Anti-hP-Selectin	R&D Systems	BBA34
FITC Conjugated Mouse IgG1	R&D Systems	BBA34
FITC Mouse IgG­1 κ Isotype Control	BD Bioscience	555748
Anti-SLeX /CD15s Ab, Clone: 5F18	Santa Cruz	SC70545
FITC Conjugated	Santa Cruz	SC70545
Normal Mouse IgM-FITC Isotype Control	Santa Cruz	SC2859
PE Mouse Anti-Human CD162, Clone: KPL-1	BD Pharmingen	556055
PE Mouse IgG1 k Isotype Control	BD Pharmingen	550617
Anti-P-Selectin Ab (AK4)	Santa Cruz	SC19996
Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3	Millipore	MAB2150
Mouse IgG1 Isotype Control	Santa Cruz	SC3877
Other Reagents
Recombinant Human TNF-alpha	PeproTech	300-01A
Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit - For Flow Cytometry	Invitrogen	C34554
Human P-selectin-FC recombinant protein	R&D Systems	137-PS-050
Human E-selectin-FC recombinant protein	R&D Systems	724-ES-100
Fibronectin Human, Plasma	Invitrogen	33016-015
Equipment
Bioflux 1000	Fluxion Biosciences	Bioflux Montage was the software used to run the experiments and analyze the data
BioFlux 48-well plates	Fluxion Biosciences
BD Accuri C6 Flow Cytometer	BD Bioscience	CFlow Plus was the software used to run the experiments and analyze the data
Nikon Eclipse Ti-S	Nikon
CoolSnap HQ2 CCD camera	Photometrics