Évaluation de calcium Sparks dans intactes les fibres musculaires squelettiques

Résumé

Décrit ici est une méthode pour mesurer directement les étincelles de calcium, les unités élémentaires de Ca ^{2 +} libèrent de réticulum sarcoplasmique dans les fibres musculaires squelettiques intacts. Cette méthode utilise le stress osmotique-médiée déclenchement de la libération de Ca ^{2 +} du récepteur de la ryanodine dans les fibres musculaires isolées. La dynamique et la capacité d'homéostasie intracellulaire de Ca ^{2 +} signalisation peuvent être utilisés pour évaluer la fonction musculaire dans la santé et la maladie.

Résumé

Le maintien de la signalisation ^{de Ca2 +} homéostatique est un processus physiologique fondamental dans les cellules vivantes. Ca ^{2 +} étincelles sont les unités élémentaires de Ca ^{2 +} de signalisation dans les fibres musculaires striées qui apparaissent comme très localisée Ca ^{2 +} événements de relâchement à médiation par récepteur de la ryanodine (RyR) Ca ^{2 +} libérer les canaux sur le réticulum sarcoplasmique (SR) de la membrane. Une évaluation correcte du muscle Ca ^{2 +} étincelles pourraient fournir des informations sur les intracellulaires Ca ^{2 +} propriétés de manipulation des muscles striés sains et malades. Bien que Ca ^{2 +} étincelles événements sont fréquemment observées dans les cardiomyocytes de repos, ils sont rarement observés dans reposant fibres musculaires squelettiques; ainsi il existe un besoin de procédés pour générer et analyser des étincelles dans les fibres musculaires squelettiques.

Détaillé ici est un protocole expérimental pour la mesure de Ca ^{2 +} des étincelles dans fléchisseurs isolé digitorm brevis (FDB) des fibres musculaires en utilisant fluorescent Ca ^{2 +} indicateurs et la microscopie à balayage laser confocal. Dans cette approche, les fibres FDB isolés sont exposés à un stress hypo-osmotique transitoire suivie d'un retour à une solution physiologique isotonique. Dans ces conditions, un solide de Ca ^{2 +} suscite la réponse est détecté à proximité de la membrane du sarcolemme dans les fibres jeunes sains FDB musculaires. Altered Ca ^{2 +} suscite réponse est détectée dans les fibres musculaires squelettiques dystrophiques ou âgés. Cette approche a récemment démontré que la signalisation de membrane délimitée impliquant la diaphonie entre inositol (1,4,5)-triphosphate récepteur (IP ₃ R) et RyR contribue à Ca ^{2 +} de l'activation de la bougie dans le muscle squelettique. En résumé, nos études utilisant stress osmotique Ca ^{2 +} induite étincelles ont montré que cette réponse intracellulaire reflète un muscle mécanisme de signalisation dans la physiologie et le vieillissement / états pathologiques, y compris des modèles de souris de la dystrophie musculaire (souris mdx) ou la sclérose latérale amyotrophique (modèle de la SLA).

Introduction

Libre intracellulaire de Ca ^{2 +} ([Ca ^{2 +]} _i) est un messager secondaire polyvalent et important qui réglemente plusieurs fonctions cellulaires dans les cellules excitables comme les neurones, cardiaque, squelettique et les muscles lisses (pour revue, voir Stutzmann et Mattson ^1). Réglementé mobilisation de ^{Ca2 +} et la diaphonie entre le réticulum sarcoplasmique (SR) et T-tubule (TT) membranes sont des régulateurs fondamentaux de la physiologie musculaire. En outre, ont été représentés les changements dans la signalisation de Ca ^{2 +} à un mécanisme sous-jacent de dysfonctionnement contractile dans diverses maladies musculaires.

Ca ^{2 +} sont localisés étincelles événements de Ca ^{2 +} de libération élémentaires provenant de l'ouverture du récepteur de la ryanodine (RyR) de canal sur le réticulum sarcoplasmique (SR) de la membrane ^2. Dans le muscle cardiaque, des étincelles se produisent spontanément par l'ouverture du canal RyR2 par un Ca ^{2 +} induite par le Ca ^{2 +} pertiase (CICR) mécanisme ^3-5. Dans le muscle squelettique, RyR1 est strictement contrôlé par le capteur de tension au niveau de la membrane ^6,7 TT. Ainsi Ca ^{2 +} étincelles sont supprimées et rarement détectés dans des conditions de repos dans les fibres musculaires squelettiques intacts. Jusqu'à récemment, la membrane du sarcolemme devait être perturbé par divers procédés chimiques ou mécaniques "écorcher" pour désaccoupler la suppression du capteur de tension et sur ​​RyR1 autorisée pour Ca ^{2 +} déclencher des événements qui doivent être détectés dans le muscle squelettique ^8,9. Une méthode décrite précédemment requis perméabilisation de la membrane des fibres musculaires par la saponine détergent ^10.

En 2003, nous avons découvert que le stress soit hypoosmotique transitoire ou de stress hyperosmotique pourraient induire Ca ^{2 +} périphérique étincelles à proximité de la membrane du sarcolemme dans les fibres musculaires intactes ^11. Cette méthode a depuis été modifié pour étudier le mécanisme moléculaire et de modulation du Ca ^{2 +} libération et dynamique ^12-16. Nous exposons ici les détails de notre approche expérimentale pour l'induction, la détection et l'analyse de Ca ^{2 +} des étincelles dans le muscle squelettique intact. Nous vous présentons également notre programme d'analyse étincelle sur mesure qui peut être utilisée pour quantifier les propriétés élémentaires des différents Ca ^{2 +} des étincelles dans le muscle squelettique, par exemple la fréquence d'allumage et d'amplitude (Δ f/f0, qui reflète la probabilité d'ouverture des canaux RyR et la charge ⁺ Ca ² à l'intérieur du SR); temps au pic (temps de montée) et la durée (FDHM, durée totale au amplitude demi-maximale) d'étincelles, ainsi que la distribution spatiale de Ca ^{2 +} étincelles. En outre, nous présentons des preuves que modifiée Liens Ca ^{2 +} étincelles aux différents états physiopathologiques dans le muscle squelettique, comme la dystrophie musculaire et la sclérose latérale amyotrophique.

L'avantage de cette technique consiste à mesurer la capacité de Ca ^{2 +} dans relativement undamcellules âgées, au lieu de dépouiller les fibres musculaires, permettant l'enregistrement de Ca ^{2 +} des étincelles dans des conditions plus proches de physiologique. En outre, notre programme conçu sur mesure fournit des calculs plus précis des propriétés de l'étincelle par rapport aux fibres musculaires.

Protocole

Une. Mise en place osmotique stress système de perfusion

La figure 1 est un protocole schématique de calcium évaluation des étincelles dans les fibres musculaires squelettiques intacts.

1. Mettre en place un micromanipulateur à trois axes (XYZ), apte à positionner l'extrémité de sortie du système de perfusion contenant au moins deux canaux. Cela pourrait être fait avec jetable canon seringue Luer-joint avec trois - façon Luer - Lok robinet d'arrêt pour mettre en marche et / ou hors de l'écoulement de solutions de perfusion. Ces canaux de perfusion doivent être capables de fournir> 1 ml / min de solution à travers une pointe de perfusion unique avec une> 0,2 mm de diamètre.
2. Charger deux canaux du système de perfusion, avec une solution isotonique de Tyrode et l'autre avec la solution hypotonique Tyrode.

2. Préparation Intact simple court fléchisseur des orteils (FDB) les fibres musculaires de souris

1. Retirez le pied d'un eu souristhanized suivant les directives du NIH et du IACUC l'aide d'une paire de ciseaux de dissection lourds en coupant la jambe au-dessus de la cheville.
2. Pin le pied sur une chambre de dissection minimale rempli de Ca ^{2 +} avec la solution de Tyrode la surface plantaire vers le haut.
3. Disséquer FDB en coupant le tendon et en tirant doucement sur le tendon pour séparer le muscle du tissu environnant.
4. Terminez dissection en coupant le tendon distal où elle branches en chiffres individuels dans les couches profondes du muscle.
5. Transférer le muscle FDB en ramassant avec une pince à travers ses tendons d'éviter des dégâts supplémentaires sur les fibres musculaires et le placer dans un tube avec une aliquote décongelée de la solution de digestion collagénase préchauffé à 37 ° C.
6. Incuber le tube contenant FDB à la verticale sur un agitateur orbital à 37 ° C pendant 60 à 90 min avec une vitesse de 160 tours par minute. Ce protocole de dissociation des faisceaux musculaires doit être examiné expérimentalement pour différentes souches d'animaux, En particulier pour les maladies / fibres mutantes vulnérables aux dommages de la membrane.
7. Transférer la FDB digérée dans le tube avec 700 pi de isotonique Tyrode Solution et triturer doucement pour libérer les fibres en tirant le muscle plusieurs fois à travers une série de 200 conseils ml-micropipette de diminuer progressivement le diamètre par la coupe avec une lame de rasoir propre pour enlever les pointes de 200 ml micropipette. Pour éviter d'endommager les fibres des muscles particulièrement faibles de la maladie, assurez-vous que la pointe est juste assez grande pour permettre le faisceau de fibres de passer à travers sans coller. Ne pas forcer le faisceau à travers une ouverture trop petite.
8. Étaler les fibres FDB en tapotant doucement et la remise en suspension des fibres FDB dans le tube, puis en tirant sur 70 ml (1/10 de fibres totales) avec un ml micropipette coupe 200 dans le centre d'une boîte de 35 mm Delta TPG contenant 1 ml de isotonique Tyrode solution pour réduire la diffusion à travers le plat.
9. Déterminer le nombre de fibres individuelles intactes dans le dish utilisant un microscope à dissection. Ajouter aliquotes supplémentaires de fibres FDB pour obtenir 3-4 fibres intactes sur le plat.
10. Stocker des fibres supplémentaires musculaires isolées à 4 ° C et utiliser dans les 6 heures.

3. Fluo-quatre heures Dye Chargement en cours et Ca ^{2 +} Imaging (Sparks mesure)

1. Transfert de 500 ml de solution isotonique Tyrode de plat avec des fibres FDB plaqués dans un tube avec du Fluo-quatre heures le stock de 10 (1 mM), mélanger et ajouter de nouveau à l'antenne à une finale Fluo-4 AM concentration de 10 mM. Alternativement, l'acide pluronic peut être utilisée pour augmenter l'efficacité colorant de chargement.
2. Chargez pendant 60 min à température ambiante dans l'obscurité.
3. Laver les fibres par attentivement le dessin sur 500 ml de Fluo-4 isotonique Tyrode Solution contenant AM-du plat avec un 200 ml-plastique pointe de la micropipette uncut et le remplacer par un volume égal de frais isotonique Tyrode Solution.
4. Répétez ce processus 3 fois de plus.
5. Pour visualiser la fonction mitochondriale, transférer 500 ml de Isotonic Tyrode Solution de plat avec des fibres FDB dans un tube de 5 ml TMRE en stock (1 mM), mélanger et rajouter à l'antenne pour une concentration finale de 50 nM.
6. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
7. Laver les fibres par attentivement le dessin sur 500 ml de TMRE contenant isotonique Tyrode la solution dans le plat avec un 200 ml pointe de la micropipette de plastique non coupé et le remplacer par un volume égal de frais isotonique Tyrode Solution.
8. Répétez ce processus 3 fois de plus.
9. Placer la capsule au microscope confocal et sélectionnez une fibre intacte avec des stries claires et une membrane sarcolemmique lisse pour l'expérimentation.
10. Placez la pointe du système de perfusion 400-500 um loin de la fibre musculaire cible et hors centre à l'aide des contrôles de micromanipulateur.
11. Commencez écoulement du Tyrode solution isotonique afin d'assurer la fibre FDB reste en place.
12. Enregistrer le signal de fluorescence de Fluo-4 AM avec un objectif à immersion d'huile 40X et exciter Fluo-4 AM avec unlaser argon (longueur d'onde d'excitation de 488 nm) et d'enregistrer des signaux d'émission de longueur d'onde (510-580 nm). L'intensité du signal de fluorescence est proportionnelle au niveau relatif de la concentration intracellulaire ^de Ca ^{2 +} ([Ca ^{2 +]} _i).
13. Provoquer le Ca ^{2 +} transitoires en modifiant la pression osmotique de la solution extracellulaire afin de produire un stress osmotique sur la fibre. Perfuser initialement les fibres avec une solution isotonique de Tyrode (290 mOsm) (collection de référence pendant 60 secondes), puis avec une solution hypotonique de Tyrode (170 mOsm) pendant 100 secondes pour induire un gonflement. Perfuser les fibres FDB retour avec une solution isotonique Tyrode. En général, un seul choc osmotique est appliquée à une seule fibre intacte dans un delta plat TPG et les événements d'allumage dernier 10 min pour l'acquisition de données.
14. Fiche localisation spatiale de Ca ^{2 +} étincelles (figure 2) en utilisant une série chronologique de xy images en deux dimensions avec une vitesse de balayage de 166 lps (ligne par seconde, et ealigne de ch composée de 512 pixels résultant en 3,08 sec / cadre) pour chaque condition de isotonique (1 min), le stress hypotonique (100 sec) et le stress post-hypotonique (5 min). signaux de magasins pour une analyse hors ligne afin d'évaluer la distribution et la fréquence de Ca ^{2 +} étincelles après la fin de l'expérience.
15. Trouver une nouvelle fibre sur un nouveau plat et suivre le même protocole de choc osmotique pour induire Ca ^{2 +} transitoires. Utilisez une ligne de balayage confocal de mode (xt) (512 pixels de long, le taux de 2 scan ms / ligne échantillon pour enregistrer Ca ^{2 +} transitoires pendant une minute (soit 30 000 lignes) avec la ligne de balayage confocal placé directement sous la membrane du sarcolemme (Figure 3 ). Changer le balayage de ligne à différents plans focaux pour enregistrer trois séries séquentielle (à des intervalles de 1 min) de balayage linéaire pour l'analyse de l'ampleur et de la cinétique de chaque Ca ^{2 +} étincelles.

4. Analyse des données

1. Recueillir un grand nombre debalayage de ligne de xt retrace pour évaluer la morphologie et la cinétique des différents Ca ^{2 +} étincelles paramètres, c'est à dire l'amplitude (F / F _0, où F ₀ est le Ca ^{2 +} fluorescence de repos), temps de montée, le temps de l'apogée, la durée (FDHM , durée totale à moitié grandeur), et la largeur spatiale (FWHM, largeur à mi-grandeur) des étincelles enregistrées. Ces paramètres représentent les propriétés de déclenchement de base de programme Adieu bazou canaux Ca ^{2 +} comme le Ca ^{2 +} flux (amplitude), et la cinétique de déclenchement de RYRs (durée).
2. Analyser les données d'images numériques avec un algorithme semi-automatique conçu sur mesure qui a été créé avec le langage de traitement d'image IDL (Interactive Data Language), comme décrit précédemment ^11,16. Parce que la cinétique uniques de Ca ^{2 +} libèrent dans le cas de Ca ^{2 +} étincelles induits dans les fibres FDB par le stress osmotique, il est préférable de combiner les fonctionnalités manuelles et automatisées de Ca ^{2 +} déclencher des événementsidentification et le traitement de ces programmes d'analyse d'image sur mesure de construire ^11. Cet algorithme est très utile quand il est nécessaire d'identifier manuellement ROI (région d'intérêt) dans certains modèles de maladies musculaires. Une fois un retour sur investissement est défini, l'algorithme pourrait dériver automatiquement les paramètres d'allumage mentionnés ci-dessus qui pourraient ensuite être exportées vers un fichier Excel. Sinon, le logiciel disponible de traitement d'image publique, par exemple SparkMaster dans ImageJ, peut être utilisé pour définir les propriétés cinétiques de Ca ^{2 +} des étincelles et leur répartition spatiale dans le muscle squelettique ^17.

Résultats

Des études antérieures ont montré que le stress hypoosmotique transitoire induite Ca périphérique ^{2 +} étincelles à proximité de la membrane du sarcolemme dans les fibres musculaires intactes ^11. Figure 1 montre les images de intactes fibres musculaires individuelles avec membrane sarcolemme lisse et stries claires caractéristiques. Figure 2 montre typique Ca ^{2 +} étincelles (comme des images xy) ont été induites par transitoire (100 s...

Discussion

Cette méthode d'évaluation de Ca ^{2 +} des étincelles dans le muscle squelettique intact est un outil utile pour la physiologie du muscle et de la recherche de la maladie. Nous avons montré que la réaction de Ca ^{2 +} de la bougie a été modifiée dans des conditions différentes, y compris la dystrophie musculaire de ^11, le vieillissement de ^{_18, 19,} ainsi que dans la sclérose latérale amyotrophique ^20. Notre étude récente a également révélé...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting microscope			Dissect out fibers and check muscle integrity
Dissection tools -scissors and fine tip forceps	Fine Science Tools
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	DOW CORNING	184 SIL ELAST KIT	Make ahead of time for fiber dissection. Mix 5 ml liquid Sylgard components and pour into a 60 mm glass Petri dish and waiting 48 hr to let the Sylgard compound become a clear, colorless solid substrate.
60 mm glass Petri dish	Pyrex	3160	Fiber dissection
Isotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Minimal Ca2+ Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Hypotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Collagenase type I	Sigma-Aldrich	C-5138	Fiber digestion
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201	Fluorescent Ca2+ imaging dyes
TMRE	Invitrogen	T669	mitochondrial membrane potential fluorescent dyes
Delta TPG dishes	Bioptechs	0420041500C	35 mm glass bottom dish for imaging
Spark Fit software			data analysis software
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope	Bio-Rad
3 Axis Micromanipulator	Narishige International	MHW-3
Temperature controllable orbital shaker	New Brunswick scientific		Fiber dissociation