Préparation des hydroxy-PAAm hydrogels pour découplage des effets de la mécanotransduction Cues

Résumé

Nous présentons une nouvelle hydrogel de polyacrylamide, appelé hydroxy-PAAm, qui permet une liaison directe de protéines de la MEC avec un coût ou une expertise minimale. La combinaison de l'hydroxy-PAAm hydrogels avec l'impression microcontact facilite le contrôle indépendant de nombreux indices du microenvironnement cellulaire naturel pour l'étude mechanostransduction cellulaire.

Résumé

Il est maintenant bien établi que de nombreuses fonctions cellulaires sont régis par des interactions de cellules avec des indices physico-chimiques et mécaniques de leur matrice extracellulaire (MEC) environnement. Les cellules eucaryotes détectent constamment leur micro-environnement local à travers les mécanorécepteurs de surface pour transduire les changements physiques de l'ECM en signaux biochimiques, et à intégrer ces signaux pour obtenir des modifications spécifiques de l'expression génique. Fait intéressant, les paramètres physico-chimiques et mécaniques de l'ECM peut se coupler avec l'autre pour réguler le destin des cellules. Par conséquent, une clé pour comprendre la mécanotransduction est de dissocier la contribution relative de l'ECM indices sur les fonctions cellulaires.

Nous présentons ici un protocole expérimental détaillé pour générer rapidement et facilement des hydrogels biologiquement pertinentes pour le réglage indépendant de mécano indices in vitro. Nous hydrogels de polyacrylamide chimiquement modifiées (paam) à surmonter leurs intrinsèquement non-ADHESive propriétés par l'incorporation de monomères d'acrylamide fonctionnalisé par des groupes hydroxy au cours de la polymérisation. Nous avons obtenu un roman PAAm hydrogel, appelé hydroxy-PAAm, qui permet l'immobilisation de toute nature souhaitée de protéines de la MEC. La combinaison de l'hydroxy-PAAm hydrogels avec l'impression par microcontact permet de contrôler de façon indépendante la morphologie des cellules individuelles, la rigidité de la matrice, la nature et la densité de protéines de la MEC. Nous fournissons une méthode simple et rapide qui peut être mis en place dans tous les laboratoires de biologie pour étudier dans les processus de mécanotransduction cellulaire in vitro. Nous validons cette nouvelle plate-forme à deux dimensions en menant des expériences sur les cellules endothéliales qui démontrent un couplage mécanique entre la rigidité de l'ECM et le noyau.

Introduction

De nombreux aspects du microenvironnement cellulaire local (par exemple, la rigidité, la taille des pores, la nature des protéines, ou la densité cellulaire-ligand) fournir un ensemble de coordonnées de signaux de régulation qui contrôlent les processus cellulaires tels que la motilité, la prolifération cellulaire, la différenciation et l'expression des gènes. Modifications des propriétés physico-chimiques du milieu extracellulaire peuvent être perçus par les cellules et provoquent différentes conséquences physiologiques, y compris la déformation de la polarisation cellulaire, la migration et la différenciation. On ne sait pas, cependant, comment les cellules se traduisent modifications ECM en signaux biochimiques cellulaires. Il est donc d'une importance majeure à l'ingénieur contrôlée dans des micro-environnements in vitro qui peuvent reproduire les interactions entre les cellules et leur microenvironnement pour étudier les voies d'mécano. Pour résoudre ce problème, nous avons récemment mis en place une nouvelle méthode ^1, appelé hydrogels-paam hydroxy, de générer facilement des deux sounsional matrices souples qui permettent de contrôler de manière indépendante des signaux mécano importantes: la rigidité de la matrice, la géométrie de la cellule et de confinement, de la nature de la protéine et de la densité cellulaire-ligand.

ECM dirige les processus cellulaires à travers des gradients de morphogènes (chimiotaxie), des protéines adhésives (haptotaxis), et la rigidité (durotaxis). Au cours des dernières décennies, avancée dans les plates-formes in vitro ont été mis au point pour isoler ces signaux extracellulaires afin de démêler la façon dont les cellules sont capables de traduire les caractéristiques biochimiques et biophysiques dans les processus physiologiques ^2-5. Faisceau d'électrons ^{6, 7} photolithographie, l'immobilisation photochimique ⁸ ou techniques assistés par plasma ⁹ ont été élaborés pour orienter la croissance de cellules vivantes sur des substrats microélectrodes. Bien que ces techniques ont donné des résultats importants, la plupart d'entre eux ne permettent pas de discrimination entre l'influence individuelle des différents indices sur le comportement des celluleset ils nécessitent des installations techniques que peu de laboratoires peuvent se permettre. Parmi ces techniques, microcontact impression (uCP), a émergé comme une méthode robuste et accessible pour créer des micro-îles de cellules-adhésif ^10. Plus récemment, des efforts considérables ^11-14 ont été faits pour développer uCP d'hydrogels avec rigidités accordables afin de reproduire la vaste gamme de rigidités observées dans les tissus vivants. Parmi ces œuvres, le polyacrylamide (PAAm) est devenu populaire ¹⁵ et est déjà l'une des matrices les base de polymères les plus couramment utilisés pour la biomécanique de cellules tests.

Paam surfaces fonctionnalisées sont communément avec l'agent de réticulation hétérobifonctionnel N-sulfosuccinimidyle-6-protéines [4'-azido-2'-nitrophenylamido] (sulfo-SANPAH) et ECM sont reliés à la surface par activation d'UV de la nitrophényl sulfo-SANPAH groupes azide ^16. Une autre technique consiste à couplage de l'hydrazine à des protéines qui ont été fortement oxydéesavec du periodate ^17. Hynd et ses collaborateurs ont introduit une technique de structuration des surfaces d'hydrogel biomimétiques avec la protéine et des peptides exige que la photopolymérisation en présence d'un monomère ^d'acroyl-18 streptavidine. Plus récemment, Tseng et al. Ont rapporté une nouvelle méthode de micromodelage ¹⁹ sur la base de l'exposition aux UV profond de PAAm à travers un masque de quartz optique qui oblige à incuber gels PA activés avec [3-diméthylaminopropyl] carbodiimide chlorhydrate de 1-éthyl-3 (EDC) et le N-hydroxysuccinimide (NHS) des solutions d'eau avant d'ajouter la protéine. Malgré la capacité de ces techniques pour créer homogènes et reproductibles protéines micropatterns, la plupart d'entre eux souffrent des limites importantes: processus de longue de synthèse (par exemple, la dialyse, la lyophilisation, etc), des composés chimiques coûteux (par exemple, l'acide hyaluronique, sulfo-SANPAH) de profondeur UV ou irradiation. De plus, ces techniques ne permettent pas de modulation indépendante de la rigidité du substrat, motif finla géométrie, la protéine ECM nature et de la densité cellulaire-ligand.

Compte tenu de ces limitations en compte, nous avons développé une approche à base d'acrylamide roman et simple qui permet l'immobilisation d'une variété de protéines et de biomolécules sur des hydrogels mous et permet le réglage indépendant de mécano repères pour décrypter leur rôle sur les fonctions cellulaires. Au lieu de traiter hydrogels paam avec des composés chimiques agressifs, nous introduisons un monomère d'acrylamide commercial avec des groupes hydroxyles lors de la polymérisation PAAm. Cette simple opération permet de surmonter la propriété anti-adhésive intrinsèque d'hydrogels paam sans autres exigences techniques.

La présence de groupes hydroxyles conduit à une forte affinité d'hydrogels hydroxy-Paam pour des protéines et des biomolécules qui forment des interactions de liaison hydrogène. En combinaison avec uCP, hydrogels-paam hydroxy permettent une production rapide de deux dimensions plate-forme de culture avec un contrôle indépendantsur la matrice de rigidité, le type de protéines de la MEC, la densité cellulaire-ligand et l'adhérence limitée, qui sont prévu pour être une plate-forme puissante pour étudier la mécanotransduction.

Le but de ce protocole est de fournir les informations nécessaires pour faire facilement des hydrogels-paam hydroxy sans aucune expertise en sciences des matériaux. Le but ultime est de fournir un moyen pour les chercheurs de poser des questions physiologiquement pertinents aux niveaux cellulaires et tissulaires qui peuvent conduire à une meilleure compréhension des voies de mécanotransduction impliqués dans les mécanismes physiopathologiques.

Protocole

1 Activation de la surface de verre Lamelles

1. Lieu lamelles de verre circulaires (diamètre 25 mm) dans une boîte de Pétri et frottis de 0,1 M NaOH solution sur elle pendant 5 min (hotte pour émanations chimiques recommandé).
2. Retirer la solution de NaOH et une immersion totale lamelles avec le trou DDH ₂ O stérile pendant 20 minutes tout en balançant doucement sur ​​une plaque à bascule dans une hotte de culture stérile.
3. Égoutter stérile ddH ₂ O et répéter l'étape 1.2.
4. Retirez les lamelles avec des pincettes stériles et les placer dans une nouvelle boîte de Pétri avec le visage activée vers le haut.
5. Lamelles sec sous un flux constant de haute pureté de l'azote gazeux.
6. Dans une hotte de culture stérile, appliquer une mince couche de l'acrylate de 3 (triméthoxysilyl) propyle (92%) sur le côté actif de la lamelle couvre-objet pendant 1 heure.
7. Laver abondamment lamelles de verre avec 3 lavages de ddH stérile ₂ O et les plonger dans le trou DDH ₂ O stérile dans une nouvelle boîte de Pétri.
8. Appuyez sur la boîte de Pétriavec du parafilm et placer sur une plaque à bascule sous agitation douce pendant 10 min.
9. Retirez les lamelles de ddH ₂ O avec des pincettes stériles avec pointes fines et placez-les dans une nouvelle boîte de Pétri avec le visage activée vers le haut.
10. Stocker à température ambiante dans un endroit sec avec du papier d'aluminium pour éviter la poussière de coller aux lamelles.

2 Préparation de l'hydroxy-paam hydrogels

1. Préparer un poids de 65 mg de N-hydroxyéthyl acrylamide (HEA) dans un tube Eppendorf de 1,5 ml. Il est important de préparer une solution fraîche de HEA.
2. Ajouter 1 ml de tampon HEPES 50 mM à HEA et mélanger à l'aide d'un vortex jusqu'à la dissolution complète de HEA.
3. Ajouter 400 ul de 40% en poids / poids dans une solution de HEPES acrylamide et le volume requis de 2% p / p dans de l'HEPES solution de bis-acrylamide (voir tableau 1) pour atteindre la rigidité désirée de l'hydrogel. Ajuster avec 50 mM de HEPES à un volume final de 5 ml.
4. Mélanger la solution avec un vortex et dégazerdans une chambre à vide pendant 20 minutes afin de réduire la concentration d'oxygène au sein de la solution, ce qui empêche la polymérisation hydroxy-PAAm.
5. Sous une hotte stérile, filtrer la solution dégazée avec un filtre de 0,2 um de taille de pores, afin de la stériliser.
6. Activer lamelles de verre circulaires (diamètre 22 mm) dans un produit UV / ozone pendant 7 min.
7. Préparer 100 pi de persulfate d'ammonium (APS) solution à 10%, soit 10 mg APS dans 100 ul ddH ₂ O. Il est important de préparer une solution fraîche de l'APS.
8. Ajouter 2,5 pi de la tétraméthylènediamine (TEMED) et 25 ul de solution à l'APS-hydroxy PAAm solution stérilisée (étape 2.5) pour initier la polymérisation. Mélanger la solution par 3 pipettages successives sans introduction de bulles, dans des conditions stériles.
9. Sous une hotte stérile, déposer une goutte de 25 ul de la solution hydroxy-PAAm sur une lamelle de 25 mm (disponible à partir de l'étape 1.9) et placer immédiatement un 22 mm glcul lamelle (préparé à l'étape 2.5) sur le dessus de la gouttelette de serrer la solution hydroxy-PAAm. Centrer la lamelle de verre de 22 mm avec des pincettes stériles et lisser les bulles.
10. Permettre aux hydrogels-hydroxy Paam à polymériser à température ambiante pendant 15 min. Inverser manuellement la solution restante hydroxy-PAAm dans le tube Eppendorf de suivre la fin du processus de polymérisation.
11. Immerger complètement stérile avec des lamelles couvre-trou DDH ₂ O et on sépare soigneusement les 22 lamelles couvre-objet en verre mm en introduisant le bord d'une lame de rasoir entre les lamelles 22 mm de verre et la couche d'hydrogel hydroxy-PAAm.
12. Lavez-hydrogels paam hydroxy avec du PBS stérile (3 échanges de PBS) et de laisser les gels totalement immergés dans du PBS stérile pour maintenir l'hydratation.
13. Rangez-hydrogels paam hydroxy dans du PBS stérile à 4 ° C pendant 3 jours.

3. polydiméthylsiloxane (PDMS) Microstamp Fabrication

NOTE: La fabrication d'un maître de silicium est nécessaire avant de staTA PDMS fabrication microstamp. Cette microfabrication d'un maître de silicium peut être fait par des techniques de lithographie, ce qui nécessite un équipement et une formation spécialisée. Collaborations avec un centre de nanofabrication sont encouragés à fabriquer le maître de silicium. Vous pouvez également contacter une entreprise qui fabrique des maîtres de silicium microstructuré sur mesure à la demande. Il est important de noter que la fabrication du maître de silicium doit seulement être effectuée une fois. En effet, les maîtres de silicium microstructurées peuvent être utilisés indéfiniment pour produire des timbres élastomères.

1. Mélange PDMS et l'agent de durcissement dans un rapport de 10: 1 dans un bêcher en matière plastique et homogénéiser à l'aide d'une pipette pendant 10 minutes.
2. Dégazer le mélange PDMS sous vide pour éliminer les bulles d'air qui ont été formés lors de l'étape 3.1.
3. Placez le maître de silicium microstructuré dans une boîte de Pétri et jeter une couche épaisse de 10 mm de mélange PDMS dégazé sur elle sans formation de bulles.
4. Laisser sécher les PDMS pendant 2 heures à 60 ° C dans unfour.
5. Dans un environnement exempt de poussière, peel-off de la couche de PDMS et accises 1 cm ² microstamps avec un scalpel.
6. En utilisant des pinces, le lieu PDMS microstamps motif dans une boîte de Pétri.

4. micromodelage hydroxy-paam hydrogels

1. La place PDMS microstamps dans un mélange éthanol / eau (50/50) et de solution de traitement par ultrasons pendant 15 min.
2. Sécher les timbres avec un courant d'écoulement d'azote et les mettre en place dans le modèle d'un nettoyeur UV / ozone (λ <200 nm) pendant 7 min.
3. Sous une hotte stérile, déposer une goutte de 150 pl d'une solution de protéine souhaitée (par exemple, 100 pg / ml de laminine dans du PBS ou 25 pg / ml de fibronectine dans du PBS) sur la surface microstructurée de 1 cm ² PDMS cachet.
4. Facultatif: modifier la concentration de la solution de protéine à moduler la densité cellulaire-ligand.
5. Répartir la solution de protéine à travers la surface de tampon en le déplaçant avec une pointe d'une pipette stérile de l'un vers l'angle dele timbre.
6. Laisser la solution de protéine à adsorber sur le timbre de PDMS 60 min sous une hotte stérile. Éteindre les lampes pour éviter d'endommager des protéines.
7. Sous une hotte stérile, transférer des lamelles recouvertes hydroxy-paam (disponibles à partir de l'étape 2.13) dans une boîte de Pétri.
8. Enlever l'excès de PBS de la surface de substrats hydroxy-paam avec un flux d'azote faible dans des conditions stériles. Arrêter la procédure dès que aucune preuve de l'eau stagnante sur la surface du gel est observé. Le gel ne doit pas être complètement séchée à ce stade.
9. Sécher soigneusement la surface structurée du PDMS timbre avec un flux constant de haute pureté de l'azote gazeux.
10. Saisir le poinçon revêtu de protéine avec une pince de tissu de chambre et placer la surface structurée en contact avec la surface de l'hydrogel séché. Appliquer brefs points de pression avec le bout de pinces sur le dessus du timbre de PDMS pour assurer un bon contact entre microcaractéristiques de timbre et la surface de l'hydrogel.
11. Laissez le timbre de PDMS sur ee surface d'hydrogel pendant 1 heure à température ambiante.
12. Retirez délicatement PDMS timbres de hydrogels hydroxy-paam avec une pince de tissus d'habillage et de suivre l'étape 4.1 pour nettoyer le timbre.
13. Laver abondamment les hydrogels-paam hydroxy estampillés par 3 échanges de PBS (pH = 7,4) dans des conditions stériles pendant 10 minutes par l'échange.
14. Micropatterns supplémentaires optionnels: d'autres protéines de la MEC peut être ajouté à la surface hydroxy-PAAm en suivant les étapes 4.5 à 4.11.
15. Des zones non-imprimées passiver avec une solution stérile de BSA à 5 mg / ml dans du PBS pendant une nuit à 4 ° C sous une agitation douce sur un plateau à bascule.
16. Laver abondamment par 3 échanges de PBS (pH = 7,4) dans des conditions stériles pendant 10 minutes par l'échange. A ce stade, les hydrogels Paam-hydroxy embouties peuvent être stockés à 4 ° C jusqu'à une semaine.

5. cellulaire dépôt sur microélectrodes hydroxy-paam hydrogels

1. Incuber lamelles dans les médias de la cellule pendant 30-45 min avant le placage caunes.
2. Laver les cellules adhérentes en culture dans un flacon de 75 cm ² de culture avec de la PBS stérile à 37 ° C et la détacher avec 3 ml de trypsine-EDTA ou Accutase pendant 10 min.
3. Transférer la quantité désirée de milieu complet de croissance approprié préchauffé à votre lignée de cellules dans le flacon contenant les cellules détachées et centrifuger la suspension de cellules pendant 3 minutes à 650 x g.
4. Retirer le surnageant avec une micropipette et remettre en suspension les cellules dans du milieu de culture complet à 15-20,000 cellules / ml.
5. Ajouter 4 ml de la solution de cellules à une lamelle microélectrodes (obtenu à l'étape 5.1) et placer la lamelle couvre-objet couvert de cellules dans un incubateur de culture à 37 ° C et 5% d'humidité pendant 1-2 heures.
6. Aspirer délicatement les cellules seules et remplacer le milieu de culture. Remettre les cellules fixées à l'incubateur et de les laisser entièrement répartis (3-6 heures, en fonction du type de cellule).

Résultats

La figure 1A présente la co-polymérisation de l'acrylamide (AAM) et de bisacrylamide (bis-AAM) avec du N-hydroxyethylacrylamide (HEA) des monomères contenant un groupe hydroxyle primaire formé par polymérisation radicalaire aléatoire d'un réseau hydrophile de polyacrylamide avec des groupes hydroxyle incorporés (hydroxy-PAAm) . Dans ce protocole, un poids de 65 mg de HEA doit être dilué dans un volume de 1 ml d'HEPES. Sachant que la densité de HEA est à peu près égal à un, nou...

Discussion

Plusieurs observations in vitro dans des cellules en biologie moderne ont été réalisées sur des lamelles de verre rigide, souvent recouvertes d'une fine couche de protéines de la MEC ou des peptides synthétiques contenant la séquence RGD. Cependant, ces substrats de culture de base ne récapitulent toute la complexité physico-chimique de l'ECM et n'offrent donc pas un modèle précis pour étudier les processus de mécano-cellulaires. Pour résoudre ce problème, nous proposons une alternati...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
UV/Ozone Photoreactor	Ultra-Violet Products	Model PR-100
Rocking plate	IKAcWerke	Model KS 130 Basic
Vortexer	Scientific Industries	Model Vortex Genie2
Vacuum degassing chamber	Applied Vacuum Engineering	DP- 8-KIT
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793-1EA
Stainless steel forceps with fine tip	Sigma-Aldrich	Z225304-1EA
Dressing tissue forceps	Sigma-Aldrich	F4392-1EA
Petri dishes in polystyrene	Sigma-Aldrich	P5731-500EA
Aluminium foil, thickness 0.5 mm	Sigma-Aldrich	266574-3.4G
Isopore membrane filter (0.2 µm pore size)	Millipore	GTTP Filter code
Round glass coverslip (22 mm diameter)	Neuvitro	GG-22
Round glass coverslip (25 mm diameter)	Neuvitro	GG-25
Variable volume micropipette	Sigma-Aldrich	Z114820
Protein microcentrifuge tubes	Sigma-Aldrich	Z666505-100EA
Scalpel handles	Sigma-Aldrich	S2896-1EA
Scalpel blades	Sigma-Aldrich	S2771-100EA
Cell culture flasks (75 cm2)	Sigma-Aldrich	CLS430641
Ultrasonic bath tray, solid (stainless steel)	Sigma-Aldrich	Z613983-1EA
Polydimethylsiloxane	Dow Corning	Sylgard 184 silicone elastomer kit
Acrylamide (powder)	Sigma-Aldrich	A3553
N,N’-Methylenebis(acrylamide)	Sigma-Aldrich	146072
N-Hydroxyethylacrylamide	Sigma-Aldrich	697931
N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
Amonium PerSulfate (APS)	Sigma-Aldrich	A3678
3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylate	Sigma-Aldrich	1805
Human Plasma Fibronectin	Millipore	FC010
Laminin from EHS	Sigma-Aldrich	L2020
Sodium hydroxyde	Sigma-Aldrich	221465-25G
Double-distilled water (ddH2O)
Endothelial cell growth medium	Cells Applications	211K-500
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)	Invitrogen	C-003-5C
Accutase	PAA laboratories	L11-007
HEPES buffer solution 1 M in H2O	Sigma-Aldrich	83264-500ML-F
Antibiotics-antimycotics	PAA laboratories	P11-002
Phosphate Buffer Saline solution	PAA laboratories	H15-002
Alexa Fluor 488 Phaloidin	Molecular Probes	A12379
Anti-vinculin antibody produced in mouse	Sigma-Aldrich	V9131
Goat anti-mouse antibody-tetramethylrhodamine	Molecular Probes	T-2762
Anti-Fibronectin (rabbit)	Sigma-Aldrich	F3648
Streptavidin	Sigma-Aldrich	41469
Anti-Laminin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	L9393
Anti-rabbit IgG-FITC	Sigma-Aldrich	F7512
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T3924-100ML
Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	459844-2.5L