VIGS-Mediated dépistage génétique avant pour l'identification des gènes impliqués dans la résistance non hôte

Résumé

Induite par le virus gene silencing est un outil utile pour identifier les gènes impliqués dans la résistance non hôte des plantes. Nous démontrons l'utilisation d'agents pathogènes bactériens exprimant GFPuv dans l'identification des gènes des plantes silencieux sensibles aux pathogènes non hôtes. Cette approche est simple, rapide et facilite le dépistage à grande échelle et un protocole similaire peut être appliquée à l'étude de divers autres interactions plantes-microorganismes.

Résumé

la résistance aux maladies non hôte des plantes contre les pathogènes bactériens est contrôlé par des voies de défense complexes. La compréhension de ce mécanisme est important pour le développement de plantes résistantes aux maladies durables contre la large gamme d'agents pathogènes. Induite par le virus gene silencing (VIGS) basée en avant génétique dépistage est une approche utile pour l'identification de gènes de défense des plantes conférer une résistance non hôte. Virus rattle du tabac (TRV) à base de vecteur VIGS est vecteur de VIGS la plus efficace à ce jour et a été utilisé efficacement pour faire taire des gènes cibles endogènes dans Nicotiana benthamiana.

Dans ce manuscrit, nous démontrons une approche de dépistage génétique avant pour réduire au silence des clones individuels à partir d'une banque d'ADNc dans N. benthamiana et évaluer la réponse des gènes des plantes silencieux pour compromis résistance non hôte contre les agents pathogènes non hôtes, Pseudomonas syringae pv. tomato T1, P. syringae pv. GlycINEA et X. campestris pv. vesicatoria. Ces bactéries pathogènes sont conçus pour expriment la protéine GFPuv et leurs colonies fluorescents verts peuvent être vus à l'oeil nu sous la lumière UV dans les non hôte d'agents pathogènes des plantes inoculées si le gène cible silence est impliqué dans la transmission de la résistance aux non hôte. Cela facilite l'identification fiable et rapide des gènes des plantes silencieux sensibles aux pathogènes non hôtes. En outre, les informations de gène candidat prometteur peut être connu par séquençage de l'insert de gène de plante dans TRV vecteur. Ici, nous démontrons la capacité haut débit de la génétique avant VIGS-médiation pour identifier les gènes impliqués dans la résistance non hôte. Environ 100 ADNc peuvent être réduits au silence individuellement dans environ deux à trois semaines et leur pertinence dans la résistance non hôte contre plusieurs pathogènes bactériens non hôte peut être étudiée en une semaine par la suite. Dans ce manuscrit, nous énumérons les étapes détaillées impliqués dans ce dépistage. Avant VIGS à médiation génétique screening approche peut être étendue non seulement à l'identification des gènes impliqués dans la résistance non hôte, mais aussi à l'étude des gènes conférant plusieurs tolérances de stress biotiques et abiotiques dans diverses espèces végétales.

Introduction

résistance non hôte est la résistance de toutes les espèces végétales contre les courses d'un ^1,2 pathogène particulier. Ceci confère à large spectre et une résistance durable aux maladies dans les plantes ^2,3. Cependant, son mécanisme, en particulier contre les bactéries pathogènes, n'est pas bien comprise ^4. Dépistage des mutants ou des plantes silencieux que la résistance non hôte de compromis et de haute profilage de transcription d'débit pour l'identification de gènes exprimés de manière différentielle au cours de la résistance non hôte ^5-9 sont deux grandes approches utilisées auparavant pour disséquer résistance non hôte bactérien. Parce que la résistance de non hôte est contrôlé par un mécanisme complexe (s) ^4, avec la participation de nombreux gènes, une approche de génomique fonctionnelle à haut débit pour l'identification des gènes est essentielle pour mieux comprendre le mécanisme de résistance non hôte (s).

Induite par le virus gene silencing (VIGS) a été utilisée avec succès pour réduire au silence végétal endogènegènes dans de nombreuses espèces végétales. ^10,11 Nicotiana benthamiana est l'une des meilleures plantes adaptées pour VIGS ^10,12 et sa séquence du génome du projet est maintenant disponible ^13. virus rattle du tabac (TRV) à base VIGS a été largement utilisé comme outil génétique inverse pour caractériser les gènes impliqués dans la résistance non hôte ^2,4,14. Cette VIGS vecteurs et les dérivés sont maintenant disponibles à travers Arabidopsis Centre de Ressources Biologiques (CARL, http://www.arabidopsis.org/abrc/catalog/individ_cloned_gene_1.html ). VIGS a également été utilisé comme un outil génétique en avant pour l'identification des gènes impliqués dans l'immunité des plantes ^15-17, la résistance non hôte particulier ^6,18. Évaluation de la réponse hypersensible (HR) médiée par la mort cellulaire induite par les plantes contre un agent pathogène non hôte spécifique et l'évaluation de la mort cellulaire induite par la maladie sont deux grands essais principalement utilisés pour IDENTIFIERg gène susceptible plantes silence. Cependant, la mort cellulaire HR est induite seulement contre de type II non hôtes pathogènes et non contre du type I non hôtes pathogènes ^2. Par conséquent, les tests RH ne peuvent pas être universellement utilisés pour identifier les stratégies de résistance non hôtes utilisés par les plantes, en particulier contre vaste gamme de type I non hôtes pathogènes. En outre, la perte partielle de la résistance non hôte dans une usine taire des gènes ne conduit pas toujours à des symptômes de la maladie ⁶ et donc la notation de la maladie ne peut pas être utilisé pour l'identification des plantes compromettre la résistance non hôte. En revanche, l'évaluation de la croissance des agents pathogènes non hôtes dans les gènes des plantes silencieux est une meilleure méthode pour étudier la perte de résistance non hôte dans le gène plantes silencieux.

Par rapport aux test de croissance conventionnel ^6,19, une méthode plus rapide pour évaluer la croissance bactérienne non hôte sur les gènes des plantes silencieux peut raccourcir le temps nécessaire pour avancer génétique dépistage. Nous avons déjà signalé une méthode pour observer les bactériesL lumière de la croissance des pathogènes sur des feuilles à l'oeil nu sous ultraviolet (UV) en utilisant des bactéries exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) ^19. Dans ce manuscrit, nous démontrons l'utilité de GFPuv exprimer pathogènes bactériens non hôte pour faciliter l'identification des gènes des plantes silencieuses qui sont compromises pour la résistance non hôte. Cette méthode est précise pour l'identification des plantes sensibles et prête pour le criblage à haut débit.

Protocole

1. croissance des plantes et Gene Silencing cible

1. conditions de croissance des plantes:
   1. Semez N. benthamiana graines sur le sol moins mélange rempotage, Metro-Mix 350 et germer les graines dans une chambre de croissance. Toute autre sol ou hors-sol moyenne peuvent également être utilisés à la place de Metro-Mix.
   2. Transplantés trois semaines vieux plants dans des pots individuels et les cultiver dans une serre maintenue à 21 ± 2 ° C ainsi que d'autres conditions de croissance tels que détaillés dans la littérature précédente ^12. Deux à trois jours après la transplantation, les plantes peuvent être utilisées pour TRV inoculation.
2. Grandir TRV2 clones:
   TRV est un virus bipartite et son génome est constitué d'ARN 1 et RNA2. ARN 1 code pour une ARN polymérase dépendante de l'ARN et une protéine de mouvement ^20,21. RNA2 code pour une protéine d'enveloppe (CP) et deux protéines non-structurales partir des ARN sous-génomique ^21. Les deux ARN1 et RNA2 sont nécessaires pour la formation de vir mûriNous particules et leur propagation ^20,21. construction d'une banque d'ADNc dans TRV2 vecteur est décrit dans la littérature précédente ^22,23. En bref, bibliothèque VIGS utilisé dans cette étude a été construit à partir de l'ARN extrait à partir de tissus foliaires exposées à divers éliciteurs biotiques et abiotiques.
   1. Sortez Agrobacterium (souche GV2260) contenant les clones d'ADNc dans TRV2 vecteur (une plaque de 96 puits) du congélateur. Peu à peu, les décongeler et après les cultures atteignent la température ambiante, inoculer la culture Agrobacterium individu sur Luria-Bertani (LB) de plaque de gélose avec la rifampicine (10 mg / ml) et à la kanamycine (50 pg / ml) en utilisant un réplicateur de 96 broches.
   2. Incuber les plaques à 28 ° C pendant deux jours. Nous cultivons habituellement quatre colonies identiques pour chaque clone de sorte que inoculum Agrobacterium adéquat est disponible pour piquer inoculation de deux usines. Effectuez toutes les étapes dans des conditions stériles.
3. VIGS:
   1. CroîtreAgrobacterium (GV2260) portant TRV1 à 28 ° C en milieu liquide LB avec des antibiotiques mentionnés ci-dessus. Récolte des cellules par centrifugation des cultures cultivées pendant une nuit, remettre en suspension dans le tampon d'inoculation (10 mM MES, pH 5,5, 200 uM acétosyringone), et incuber pendant 3 heures à température ambiante sur un agitateur à 50 tours par minute.
   2. Récolter les cellules par centrifugation et remettre en suspension dans du tampon MES 5 mM (pH 5,5) et inoculer _(DO600 = 0,3) dans le côté abaxial de 3-4 N. benthamiana feuilles à l'aide d'une seringue sans aiguille. Procédure d'inoculation détaillée est démontré dans la littérature précédente ^24. Plus tard, sur le site de TRV1 inoculation, inoculer TRV2 colonies respectives en piquant les feuilles avec un cure-dent.
   3. Maintenir les plantes avec une nutrition adéquate, la croissance vigoureuse est important pour VIGS efficaces ^12. Environ deux semaines après l'inoculation, les transcriptions des gènes ciblés vont commencer à diminuer et les plantes sont prêtes pour le CONI pathogènelation à trois semaines après inoculation VRT.

2. Préparation des cultures non hôtes pathogènes et l'inoculation des plantes

1. Détails de pathogènes utilisés dans cette étude:
   Pseudomonas syringae pv. Tabaci, P. syringae pv. tomato T1, P. syringae pv. glycinea et Xanthomonas campestris pv. vesicatoria sont utilisés dans cette étude. Cultivez P. souches syringae dans B King (KB) milieu liquide supplémenté avec la rifampicine (10 mg / ml), à la kanamycine (50 pg / ml) à 28 ° C pendant 12 heures. Cultivez X. campestris pv. vesicatoria en milieu liquide LB pendant 16 heures. Tous les agents pathogènes hébergent un plasmide qui peut exprimer GFPuv comme décrit dans la littérature précédente ^19.
2. Préparation des cultures pathogènes pour l'inoculation de la plante:
   1. Récolter les cellules bactériennes par centrifugation et confirmer la présence de fluorescence verte à l'aide de CapelongueLampe UV velength dans l'obscurité. Laver les cellules deux fois avec de l'eau stérile et remettre en suspension à la concentration voulue avec de l'eau stérile.
   2. Inoculer le pathogène respectif (s) sur le côté abaxial de gène cible feuilles réduites au silence (5 ^e à 8 ^e) que les taches (environ 1,5 cm diamètre). Plusieurs agents pathogènes non hôtes peuvent être testés simultanément pour leur croissance dans les gènes des plantes silencieux cibles. Simultanément inoculer le hôte-pathogène, car cela peut être utilisé comme un contrôle positif pour la visualisation de la croissance bactérienne planta. Aussi inoculer le contrôle de vecteur (TRV :: 00) plantes.

3. Observation des in planta croissance des bactéries pathogènes

1. Exposer les feuilles inoculées à une lumière UV de grande longueur d'onde dans l'obscurité. Les colonies bactériennes peuvent être considérés comme points fluorescents verts dans le côté abaxial de la feuille dans le fond de la fluorescence rouge émise par la surface de la feuille.
2. Observer la croissance des pathogènesde 2 jours après l'inoculation (ppp) à 5 dpi. L'observation de tous les jours pendant cet intervalle de temps est nécessaire.
3. Après le premier écran, la sélection des clones dont les silencing entraîne la croissance d'un ou plusieurs agent pathogène non hôte (s).
4. Répétez VIGS pour les clones sélectionnés et encore tester la réponse des gènes des plantes silencieux à des agents pathogènes non hôte (s). Ce deuxième niveau de contrôle est fait pour éliminer les faux positifs obtenus au cours du premier écran.

4. Confirmation des plantes présélectionnés pour Résistance non hôte compromise

1. Taire les clones d'ADNc sélectionnées sur l'écran, comme décrit ci-dessus. Inoculer toute la plante avec pathogène non hôte (s) en immergeant les plantes avec des cultures pathogènes respectifs avec 0,01% (v / v) Silwet L-77 et en soumettant les plantes submergées à vide pendant 3 - 5 min. Quantifier la croissance bactérienne par dosage de croissance conventionnel ^6,18,19 comme décrit ci-dessous.
2. À 0 h après inoculation (HPI),3 et 5 dpi dpi, recueillir deux échantillons de feuilles de cinq répétitions biologique pour chaque agent pathogène non hôte (s) de feuilles inoculées à l'aide d'un poinçon feuille (0,5 cm ^2). Broyer les échantillons de feuilles, de série diluée et la plaque de la sève sur gélose KB complété avec des antibiotiques appropriés et incuber à 28 ° C pendant 2 jours. Comptez le nombre de colonies bactériennes en utilisant un compteur de colonies et calculer la croissance bactérienne dans les feuilles telles que décrites dans la littérature précédente ^6.
3. Plantes sensibles aux agents pathogènes de non hôte (s) devraient montrer un nombre plus élevé de la croissance des pathogènes par rapport à la lutte antivectorielle.

5. Le séquençage de l'insert et identification de gène cible

1. Effectuer colonie PCR pour le clone sélectionné à l'aide attB1 et attB2 amorces ou en utilisant les amorces flanquant le site de clonage dans le vecteur TRV2. Exécutez le produit PCR sur le gel et vérifier pour l'amplification de la bande unique.
2. insertion de gènes des plantes dans le vecteur TRV2 peut être séquencé à l'aide attBamorces ou amorces flanquant le site de clonage.
3. Effectuer BLAST en utilisant la séquence et identifier les détails de gènes.
4. Obtenir séquence du gène pleine longueur avec les régions non traduites (UTR).
5. Sélectionnez 300-400 pb fragments de trois régions différentes de la séquence et de les cloner dans TRV2 vecteur. Effectuer indépendamment VIGS en utilisant tous les trois constructions de VIGS et confirmer le compromis de résistance non hôte dans les trois usines réduits au silence des gènes.

Résultats

L'objectif majeur de cette étude est de démontrer une méthode pour l'identification facile et précise d'un gène silencieux N. benthamiana qui sont compromises pour la résistance non hôte. Il ya quatre grandes étapes de cette méthodologie. La première étape est de faire taire individuellement grand nombre de gènes en utilisant TRV-VIGS. Nous avions fait taire environ 5.000 gènes ^6,18 sur une période d'environ 1,5 ans en utilisant le protocole décrit à la figure ...

Discussion

l'immunité des plantes limite la croissance des agents pathogènes non hôtes et, par conséquent, peu ou pas de fluorescence verte est émise à partir de plantes de lutte antivectorielle feuilles inoculées avec des agents pathogènes non hôte sous une lumière UV de grande longueur d'onde (figure 3D). Cependant, quand un gène impliqué dans la résistance non hôte est réduit au silence, le gène silencieux plantes favorisent la croissance des agents pathogènes et de fluorescence verte n...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well U-bottom plates	Becton Dickinson Labware (Franklin Lakes, NJ, USA)	35-3077
96-pin replicator stainless steel	Nalge Nunc International (Naperville, IL, USA)	250520
High Intensity UV Inspection Lamps, Model B-100ap	Thomas scientific (Swedesboro, NJ, USA)	6283K50	Manufacturer ID 95-0127-01
Stuart SC6 colony counter	Bibby Scientific Limited, Staffordshire, UK	SC6PLUS
Soil-less potting mixture, Metro-Mix 350	SUNGRO Horticulture Distribution, Inc., (Bellevue, WA, USA)
Primers: attB1 (GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT) attB2 (GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT)	Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville, IA, USA)	Custom synthesized
MES, Monohydrate	VWR international (Radnor, PA, USA)	CAS No. 145224-94-8
Acetosyringone (Dimethoxy-4’-hydroxyacetophenone)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D134406
Vac-In-Stuff (Silwet L-77)	Lehle Seeds (Round Rock, TX, USA)	VIS-30