Imagerie RICL sécrétion d&#39;enquêter sur l&#39;infection cellulaire par le pathogène bactérien<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Résumé

Listeria monocytogenes est une bactérie pathogène à Gram positif fréquemment utilisé comme un modèle important pour l'étude du parasitisme intracellulaire. Imagerie fin L. monocytogenes stades d'infection dans le contexte de petits écrans ARN interférant permet l'étude globale des voies cellulaires nécessaires à l'infection bactérienne de cellules hôtes cibles.

Résumé

Pathogènes intracellulaires bactériennes peuvent être conçus comme des outils moléculaires pour disséquer les cascades de signalisation cellulaire en raison de leur capacité à manipuler exquise et subvertir les fonctions cellulaires qui sont nécessaires pour l'infection des tissus cibles de l'hôte. Parmi ces bactéries pathogènes, Listeria monocytogenes est un micro-organisme à Gram positif qui a été utilisé comme un paradigme pour parasitisme intracellulaire dans la caractérisation des réponses immunitaires cellulaires, et qui a joué un rôle instrumental dans la découverte des voies moléculaires contrôlant cytosquelette et la membrane dynamique de la traite. Dans cet article, on décrit un test microscopique robuste pour la détection des stades de l'infection cellulaire L. fin monocytogenes basées sur le marquage fluorescent de RICL, une protéine bactérienne sécrétée qui s'accumule dans le cytoplasme des cellules infectées, ce dosage peut être couplé à de petits écrans d'ARN automatisées à haut débit interférant de manière à carboniseracterize voies de signalisation cellulaires impliqués dans la hausse ou à la régulation à la baisse de l'infection.

Introduction

La bactérie à Gram positif Listeria monocytogenes est un agent pathogène d'origine alimentaire qui envahit les cellules de l'hôte, perturbe sa vacuole d'internalisation et se réplique dans le cytoplasme des cellules hôtes ^1. L. monocytogenes facilité de manipulation dans le contexte de laboratoire (d'une croissance rapide, une faible toxicité pour les individus en bonne santé) associée à la persistance de caractéristiques de virulence bactériennes observées dans des modèles cellulaires et animaux (l'activité hémolytique, leucocytose) a permis son utilisation initiale dans les années 1960 comme un modèle majeur pour l'étude du parasitisme intracellulaire et pour la mise en place des fondements théoriques de l'immunité cellulaire contre l'infection ^2. À la fin des années 1980 et au début des années 1990, la dissection du cycle intracellulaire bactérienne ³ ainsi que la caractérisation moléculaire de la virulence bactérienne la plus importante facteurs ^4-7 favorisé l'utilisation de L. monocytogenes comme un outil moléculaire clé pour la manipulation et le goujony des fonctions de la cellule hôte. La présence de non virulente (L. innocua) et (L. monocytogenes) espèces virulentes dans le genre Listeria ont ouvert la voie à des études génomiques comparatives ⁸ qui, avec la création récente de la L. complète monocytogenes transcriptome ^9, ont accru notre compréhension de l'évolution de L. monocytogenes comme un agent pathogène humain et en tant que système modèle pour l'infection études de ^10.

L. monocytogenes induit son internalisation dans les cellules hôtes lors de l'interaction des protéines de surface bactériennes INLA et INLB avec leurs récepteurs de la cellule hôte E-cadhérine et Met, respectivement ^11-12. Études sur la base de candidats initiaux ont conduit à l'identification de l'α / β caténines-actine lien comme une composante importante de la voie InlA-invasion ¹³ et de la phosphoinositide 3-kinase (PI 3-K) comme un effecteur critique de la InlB- dépendant invasion cascade ^{14 à 15.} Analyses protéomiques et base fonctionnelle suite ont permis d'identifier de nouveaux éléments du cytosquelette et ¹⁶ seconds messagers lipidiques ¹⁷ requis pour l'invasion de la cellule hôte. Études de la transcription ¹⁸ et protéomique de masse basé spectrométrie de ¹⁹ quantitatives ont récemment jeté un nouvel éclairage sur l'activation de la signalisation accueil cascades et la répression de la réponse immunitaire au cours de L. monocytogenes infection. Biologie systémique basée sur l'inactivation des grands ensembles de gènes (kinomes, génomes complets) par petits ARN interférents (siRNA) silencieux ont récemment ouvert de nouvelles voies pour l'analyse de l'hôte mondiale cascades de signalisation dans le cadre des fonctions cellulaires spécifiques, y compris la phagocytose et pathogène internalisation ^20. Écrans de siRNA du génome entier ont déjà été menées pour examiner cascades cellulaires nécessaires pour l'infection de L. monocytogenes dans phagocytaire Drosophila cellules S2 ^21-22, mais ce type d'analyse n'a pas été réalisée dans des cellules non-phagocytaires, qui représentent des cibles importantes pour l'infection in vivo.

Nous avons optimisé un protocole pour la détection microscopique des stades tardifs de l'infection par L. monocytogenes qui est adapté pour les études à haut débit siARN d'entrée bactérienne dans les cellules épithéliales. Notre essai tire parti d'un L. hautement invasive monocytogenes souche qui présente une mutation ponctuelle dans PrfA, le régulateur transcriptionnel majeur de L. monocytogenes facteurs de virulence ^6: cette mutation (nommé PrfA *) rend PrfA constitutivement active ²³ et conduit à une augmentation de l'expression des protéines d'invasion de l'INLA et INLB, favorisant ainsi l'entrée des bactéries dans les cellules non-phagocytaires sinon mal infectés. Notre lecture de l'infection est basé sur la détection de l'accumulation cytosolique de la sécrétée de la protéine bactérienne RICL: cette molécule estun effecteur pleiotrope qui s'exprime préférentiellement par voie intra-cytoplasmique L. ⁹ monocytogenes et qui participe non seulement à la cellule-cellule au-bactérien réparties ²⁴ mais qui modulent également les réponses immunitaires de l'hôte ^25. Le marquage fluorescent des RICL la sécrétion par les bactéries intracellulaires non seulement permet de distinguer clairement infectée à partir de cellules non infectées, mais représente également une lecture du point final qui peut être utilisé par la suite pour disséquer infection dans ses différentes étapes: d'entrée, évasion vacuolaire, bactérienne cytosolique la prolifération et la propagation de cellule à cellule. Ce protocole basé sur la microscopie peut être couplé à écrans siARN donc d'étudier les voies cellulaires impliquées dans l'infection des cellules hôtes par L. monocytogenes.

Protocole

Une. Préparation des cultures cellulaires et bactériennes, transfection Outils et anticorps primaires

1. Préparer une plaque de gélose frais d'isoler individuelle L. monocytogenes colonies à partir d'un stock de glycérol bactérienne (50% glycerol/50% saturé culture de la nuit liquide bactérienne) conservé à -80 ° C.
   1. L'utilisation d'un rack en aluminium (conservé à -80 ° C) pour transporter un bactérienne glycérol d'surgelés, les bactéries à balayage sur un coeur cervelle (BHI) de plaque de gélose.
   2. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 48 h (ou jusqu'à ce que des colonies bactériennes individuelles peuvent être isolés).
   3. Conservez cette plaque travailler ensuite à 4 ° C pendant une durée maximale de 1 mois (elle sera utilisée pour ensemencer des cultures liquides).
   4. Dans notre protocole, nous utilisons le L. monocytogenes sérotype 1/2a EGDe.PrfA * souche, mais comme cela est illustré sur la figure 1, le L. monocytogenes sérotype 4b P14.PrfA * souche donne des résultats similaires.
2. IlCellules de CCL2 La ATCC sont cultivées dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS) en l'absence d'antibiotiques.
3. Pools indépendants de brouillés (contrôle) et des anti-Met siRNAs sont chargés dans 384 puits de plaques de culture cellulaire par microscopie noirs.
   1. Diluer 160 pmol de siRNA dans 500 pi d'eau sans RNase et ajouter 5 ul de cette solution par puits (concentration finale: 1,6 pmol).
   2. Conservez cette plaque à -20 ° C pour une période maximale de 1 an.
4. Des anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre la protéine bactérienne RICL ont été obtenus par immunisation à l'aide d'une protéine recombinante RICL-GST comme décrit précédemment ^25.

2. Inverser siRNA Transfection cellulaire

1. 72 heures avant l'infection amener à la température ambiante, une plaque 384 puits de culture cellulaire de microscopie noir contenant 1,6 pmol siRNA dans 5 pi d'eau sans RNase dans chaque puits.
2. Centrifuger la plaque pendant 3 min à 300rcf à la température ambiante pour faire baisser siRNA qui aurait pu être déposé dans les parois des puits.
3. Préparer à manger DMEM de température complété avec 0,4% Lipofectamine RNAiMAX.
4. Ajouter 25 ul du milieu de transfection DMEM / RNAiMAX à chaque puits (ne pas laisser incuber le milieu de transfection plus de 20 minutes avant de l'ajouter à la siRNA).
5. Déplacer la plaque avant et en arrière de mélanger le siRNA avec la solution de transfection, puis garder la plaque pendant 1 heure à température ambiante pour permettre complexes siARN-Lipofectamine pour former.
6. Laver les cellules HeLa à partir d'un flacon-confluente ou une culture de cellules sous-confluentes une fois avec 10 ml 37 ° C préchauffé PBS.
7. Détacher les cellules HeLa par addition de 1 ml à 37 ° C préchauffé trypsine dans la fiole de culture de cellules et incuber pendant 3 à 5 min à 37 ° C.
8. Re-suspendre les cellules dans 10 ml 37 ° C préchauffé DMEM supplémenté avec 16% de FBS.
9. Compter les cellules et à préparer une suspension cellulaire de 12 000 cellules par ml dans du DMEM supplémenté avec16% de FBS.
10. Ajouter 50 ul de la suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque de 384 puits.
11. Déplacer la plaque rapidement d'avant en arrière pour répartir les cellules et les cellules laisser s'installer pendant 10 min à température ambiante.
12. Sceller la plaque avec du Parafilm et garder pendant 72 heures dans un contenant du CO ₂ atmosphère humidifiée de 5% à 37 ° C.

3. Infection cellulaire et coloration

1. Le jour avant l'infection, prendre une seule colonie de L. monocytogenes dans la plaque de gélose BHI et remettre en suspension dans 5 ml de milieu de BHI de liquide dans un tube de 15 ml en polystyrène.
2. Incuber pendant une nuit à 37 ° C dans un dispositif de Shacking pour permettre la croissance bactérienne.
3. Le jour de l'infection, se laver 1 ml de la L. nuit monocytogenes culture par centrifugation 2 min à 10600 rcf sur une centrifugeuse de table.
4. Jeter le surnageant (qui contient le sécrétée cytotoxine listériolysine O) et remettre en suspension le culot dans 1 ml de PBS (REPEAt l'étape de lavage 3 fois plus).
5. Lire la densité optique à 600 nm bactérienne et estimer le nombre de bactéries (OD = 1 est équivalent à 1E9 bactéries / ml).
6. Préparer le L. adéquate monocytogenes dilution dans du DMEM supplémenté avec 1% de FBS: en utilisant des souches hautement invasives comme EGDe.PrfA *, nous suggérons l'utilisation de bactéries 5E4 dans 30 pi de milieu par puits (la multiplicité d'infection est estimé à 25 pour 2000 cellules).
7. Retirer le milieu de culture de cellules dans chaque puits (80 ul) et de la remplacer par l'ajout de 30 ul de la L. monocytogenes milieu contenant.
8. Centrifuger la plaque à 200 rcf pendant 5 min à température ambiante pour synchroniser le processus d'infection.
9. Incuber la plaque pendant 1 heure dans un CO _{2-atmosphère} humidifiée contenant 5% à 37 ° C sur un bloc d'aluminium préchauffé.
10. Retirez le L. monocytogenes contenant du milieu de chaque puits et ajouter 30 ul de DMEM préchauffé additionné de 10% de FBS et40 pg / ml de gentamicine de tuer extracellulaire L. monocytogenes.
11. Incuber pendant 4 heures dans un CO _{2-atmosphère} contenant 5% à 37 ° C sur un bloc de métal préchauffée.
12. Préparer une solution de PBS supplémenté avec 8% de formaldehyde (cette solution doit être préparé de telle sorte que les monomères de formaldéhyde, de préférence aux polymères de paraformaldéhyde, sont utilisés).
13. Sans écarter le milieu de culture de cellules, ajouter 30 ul de PBS supplémenté avec 8% de formaldéhyde (concentration finale: 4%) et incuber pendant 15 min à température ambiante.
14. Retirer le fixateur et de lavage des cellules trois fois avec 80 ul de PBS par puits (maintenir les cellules dans un volume final de 80 ul de PBS par puits).
15. Préparer une dilution 1:250 du lapin anti-RICL sérum dans du PBS additionné de 0,2% de saponine.
16. Ajouter 10 ul de la solution d'anticorps primaire à chaque puits après avoir enlevé le PBS et incuber pendant 30 min à température ambiante.
17. Jeter le primairesolution d'anticorps et laver quatre fois avec 40 pl de PBS par puits.
18. Diluer l'anticorps secondaire Alexa Fluor 546 à couplage anti-lapin (1:250), la solution de DAPI (1:1500) et phalloïdine-DY647 (1:150) dans du PBS supplémenté avec 0,2% de saponine.
19. Ajouter 10 ul de cette solution de coloration secondaire pour chaque puits et incuber pendant 30 min à température ambiante.
20. Jeter la solution de coloration secondaire et laver quatre fois avec 40 pl de PBS par puits (laisser un volume final de 40 ul dans chaque puits et sceller la plaque).
21. La plaque peut être reproduite immédiatement ou peut être conservé à 4 ° C à l'abri de la lumière (couvrir de papier d'aluminium) pour une analyse ultérieure.

4. Acquisition et analyse d'images

1. Acquérir des images en trois canaux différents (350 nm, 546 nm et 647 nm) en utilisant un objectif 10X monté sur un microscope automatisé (acquérir préférentiellement 9 images par puits).
2. Le signal RICL peut être mesurée en utilisant l'imagelogiciel d'analyse comme CellProfiler qui permet la segmentation automatique des noyaux et des corps cellulaires utilisant le DAPI et la coloration de phalloidin, respectivement.

Résultats

Marquage fluorescent cytoplasmique RICL fournit une lecture robuste pour l'infection des cellules par L. monocytogenes, comme illustré sur la figure 1: la cellule centrale dans la micrographie est fortement infectées par la souche P14.PrfA * ²³ comme cela peut être observé dans l'image à contraste de phase (pointes de flèches, figure 1A) et il est confirmé par le signal DAPI où bactéries individuelles peuvent être clairement distingués (fig...

Discussion

Plusieurs paramètres sont essentiels pour le succès de notre protocole RICL de détection, y compris l'utilisation de lignées de cellules saines présentant un assez grand cytoplasme pour permettre une détection sans ambiguïté du signal RICL. Dans l'analyse que nous présentons dans cet article, nous proposons l'utilisation de cellules HeLa CCL2, qui sont particulièrement bien adapté à notre analyse en raison de l'extension de leur espace cytosolique; autres clones HeLa comme les cellules HeLa K...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Brain Heart Infusion	BD	237500	For liquid BHI preparation
Bacto Agar	BD	214010	Supplement to liquid BHI for BHI agar plates
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum	Biowest	51830-500
DMEM	Invitrogen	61965-026
Lipofectamine RNAiMax	Invitrogen	13778-100
Gentamicin	Sigma	G1397-10ML
Formaldehyde (16%)	EMS	15710	Prepare fresh before each experiment
Anti-Rabbit Alexa Fluor 546	Invitrogen	A-11035
DAPI	Invitrogen	D-1306
Phalloidin Dy647	Dyomics	647-33
siRNA Scramble	Dharmacon	D-001810-10
siRNA Met	Dharmacon	L-003156-00-0005
Black 384-well microscopy cell culture plate	Corning	3985
AxioObserver Z1 microscope	Zeiss	431007 9901
sCMOS camera	Andor	Neo
Metamorph analysis software	Molecular Devices	4000
CellProfiler analysis software	Broad Institute	Public software available at http://www.cellprofiler.org/