Ingénierie tissulaire: Construction d'un échafaudage 3D multicellulaire pour la livraison de stratifiés feuilles cellulaires

Résumé

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Résumé

Beaucoup de tissus, comme les adultes cœurs humains, sont incapables de se régénérer correctement après dommages. ^2,3 Stratégies en ingénierie tissulaire proposent des innovations pour aider le corps dans la récupération et la réparation. Par exemple, les approches TE peuvent être en mesure d'atténuer le remodelage cardiaque après un infarctus du myocarde (IM) et peut-être augmenter la fonction cardiaque totale à un niveau MI pré proche de la normale. ⁴ Comme avec n'importe quel tissu fonctionnel, réussite de la régénération du tissu cardiaque implique la bonne exécution de plusieurs types de cellules avec des signaux environnementaux qui favorisent l'intégration et la survie de la greffe de cellules / tissus implantés. Tissus d'ingénierie devraient aborder plusieurs paramètres dont: signaux solubles, les interactions cellule-cellule et matériaux de matrice évalués comme les véhicules de livraison, de leurs effets sur la survie de la cellule, la résistance des matériaux, et la facilitation de l'organisation de cellule à tissu. Des études utilisant l'injection directe de cellules du greffon seulement ignorer ces éléments essentiels. ^2,5,6Une conception de tissu combinant ces ingrédients n'a pas encore été développé. Ici, nous présentons un exemple de superposition à l'aide des dessins intégrés de feuilles de cellules à motifs avec deux types de matières biologiques contenant des dérivés du type cellulaire organes cibles et des cellules endothéliales pour l'amélioration de la formation de nouveaux vaisseaux dans le "tissu". Bien que ces études se concentrent sur la production de tissu cardiaque comme, cette conception de tissu peut être appliquée à de nombreux autres organes que le coeur de la conception et matérielles des changements minimes, et est censé être un produit hors-the-shelf pour les thérapies régénératrices. Le protocole contient cinq étapes détaillées. Une température Poly sensible (N de -isopropylacrylamide) (PNIPAAm) est utilisé pour des boîtes de culture de tissus de la robe. Ensuite, les cellules sont mises en culture tissulaire spécifique sur la surface des plaques revêtues de motif fin / des surfaces pour former des feuilles de cellules avec de fortes adhérences latérales. En troisième lieu, une matrice de base est créé pour le tissu en combinant la matrice poreuse avec Permissi néovasculaireve hydrogels et les cellules endothéliales. Finalement, les feuilles de cellules sont soulevées à partir des boîtes revêtues PNIPAAm et transférées à l'élément de base, ce qui rend l'assemblage complet.

Introduction

Injection of cells and/or single materials alone has shown variable success in other organ systems and limited success in cardiac regeneration.^5,7-12 Currently, stem cell-derived cells are delivered to damaged tissue using a variety of delivery methods including: direct cell injection into tissue and perfusion into the blood supply.^13-17 Others have implanted cells alone, materials alone and/or in combination with material carriers to help regenerate damaged organs.^18-21 This design combines multiple strategies that provide material strength, patterning in multiple materials and multiple cell types.

Specifically, the base acellularized fibrous matrix provides the foundational physical strength to the construct, making it suitable for suturing in into the patient, if necessary. The void spaces in the base matrix are filled with endothelial cells in a neovascular permissive hydrogel²² for rapidly establishing vascularization of the implanted construct. This composite is then integrated with pre-patterned cell sheets that allow enhanced cell-to-cell communication, more closely mimic the native tissue.^1,23-25 The overall production process for the layered cellular patch is outlined by the flowchart in Figure 1.

Protocole

1 Création de plaques PNIPAAm revêtues

1. Dissoudre 2,6 g de PNIPAAm dans 2 ml d'une solution / 40% d'hexane à 60% dans le toluène.
2. Chauffer le mélange à 60 ° C pendant 10 min sous agitation, jusqu'à ce que l'on dissout PNIPAAm.
3. Couper le papier filtre dans un cercle de 60 mm de diamètre et placez le papier dans l'entonnoir de Büchner.
4. Filtrer la solution à travers un entonnoir de Büchner dans le bécher pré-pesée verre (ne pas utiliser des matières plastiques, comme l'hexane fera fondre les plastiques).
5. Placer le bécher et contenu dans un vide de cloche (24 psi) O / N (16 h). Note: Jusqu'à ce que le résidu est traité avec isopropylique il s'oxyde alors assurez-vous qu'il n'entre pas en contact avec l'oxygène.
6. Peser le bécher pour déterminer la masse de la PNIPAAm.
7. Ajouter de l'alcool isopropylique à la PNIPAAm, la création d'un 50/50 p / p de la solution.
8. Placer 2 ml de la solution sur la surface de la plaque de culture de tissu, et le pelage pendant 5 min sous une lampe UV.
9. Laver la plaque avec 2 ml de PBS chaud deux foisavant de l'utiliser pour la culture cellulaire.

2 Création de feuilles cellulaires

Remarque: feuilles cellulaires de cellules primaires pour l'organe cible peuvent être créés en utilisant un certain nombre de méthodes différentes, ou par le revêtement de surfaces de culture de tissu de polymère thermo-sensible comme décrit ici. Plaques thermo-sensible pré-enrobées sont également offerts par un certain nombre de fournisseurs.

Remarque: Ce protocole est de culture en utilisant une boîte de 35 mm. Brièvement, les cellules sont d'abord mises en incubation à 37 ° C pendant un minimum de 24 h à confluence pour établir des connexions latérales entre les cellules adjacentes. Pour détacher les feuilles de cellules, les plaques sont soumises à des températures inférieures à 32 ° C. Le tapis cellulaire est ensuite transféré dans la matrice fibreuse de base forte contenant un hydrogel permissive néovasculaire avec des cellules endotheliales vasculaires.

1. Isoler la population de cellules. Remarque: cette méthode dépend des procédures de dérivation individuels et le type de cellules. Rat mu lisse aortiquedes cellules sub-aigu (RASMC) sont utilisés dans cet exemple. Ce sont des primaires de cellules musculaires lisses isolées de l'aorte abdominale d'un rat.
2. Laver les cellules avec 2 ml de PBS chaud.
3. Ajouter 3 ml de trypsine (ou autre / solution dissocier de clivage) sur les cellules pendant 5 min.
4. Inhibition de la trypsine par addition de 3 ml de milieu de culture, ou une solution tampon phosphate (PBS) contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS).
5. Les cellules dans un tube conique et compter une aliquote.
6. Faites tourner les cellules à 1000 rpm (228 xg) pendant 5 min.
7. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans leur milieu de croissance (milieu de culture SmGM2 plus kit balle est utilisé pour RASMC).
8. Placer le support contenant les cellules sur une plaque thermo-sensible 35 mm - PNIPAAm plaque revêtue à une concentration qui permettra d'atteindre 100% de confluence. Remarque: Pour CMLAR ce nombre a été déterminé que 100 000 cellules / cm ^2. Toutefois, en raison de la perte de cellules lors de la transmission, que 120% de VA lue est utilisée.
9. Placer dans un incubateur à 37 ° CO / N. Remarque: il est important de maintenir les cellules à 37 ° C pour maintenir l'adhérence cellulaire de la plaque.

3 Préparation de Matrix Foundational

Remarque: Plusieurs matrices fibreuses 3D peuvent être utilisés pour la couche solide matrice fibreuse entre les feuilles de cellules délicates. Voici quelques exemples: gelfoam, bioverre, matériaux naturels acellularized ²⁶ ou nanospun matériaux ^27,28 Le porc urinaire matrice de la vessie (UBM) utilisée dans ces études a été généreusement fourni par notre collaborateur, le Dr Badylak ^29.

1. Avant d'utiliser, de déterminer les caractéristiques de la matrice, y compris le manque de contenu cellulaire si matrice décellularisé est utilisée, ^27,28 viabilité cellulaire spécifique, et un espace vide. ²²
2. Couper la matrice de pré-stérilisé dans une taille et une forme souhaitées. Note: Ici, un poinçon est utilisé pour découper un cercle de 4 mm de diamètre.

ve_title "> 4. Cellules endothéliales ensemencement dans un néovasculaire permissive hydrogel

Remarque: Les cellules endotheliales peuvent être obtenus à partir d'une variété de sources, y compris la différenciation de cellules souches ou progénitrices. Ici, on utilise des cellules HUVEC.

1. Utilisation tout hydrogel permissive (de fibrine, des gels de collagène) aussi longtemps que le temps de reticulation est suffisamment courte pour que les cellules restent viables. Remarque: ici, un gel acide hyaluronique (HA) réticulé à base d'un pont disulfure est utilisé.
2. Préparer l'hydrogel HA en conformité avec le protocole de la société.
3. Recueillir les cellules endothéliales et les disperser dans une solution à une seule cellule à l'aide de la trypsine 1x. Remarque: Accutase ou tampon de dissociation cellulaire peuvent également être utilisés pour la dispersion de la cellule unique.
4. Désactiver l'enzyme de la trypsine en utilisant une quantité égale d'inhibiteur de trypsine de soja (si il est important que les cellules ne sont pas en contact avec le sérum) ou 10% de FBS dans du PBS, la collecte de la solution / cellules dans un tube conique de 15 ml.
5. Contant les cellules, et de calculer le volume nécessaire pour les dimensions de raccordement (auparavant quantifiés). Remarque: Pour un patch de 4 mm, ici de 2 millions de cellules endothéliales sont utilisés.
6. Extrait 2 millions de cellules, et la placer dans un nouveau tube de 15 ml conique.
7. Spin au (228 xg) pendant 5 min.
8. Aspirer le surnageant, ce qui laisse les cellules en culot dans un tube conique.
9. Mélangez les matières liquides de HA et de la gélatine dans un rapport 1: 1 ration. Ensuite, ajouter 80% du volume total dans le tube conique contenant le culot.
10. Remettre en suspension les cellules endothéliales dans le mélange 1: 1 HA / Gélatine
11. Mettre les cellules en suspension dans le mélange HA / gélatine dans la matrice fibreuse de base à partir de l'étape 2.
12. Ajouter cinquième (20 pour cent) du volume total souhaité de l'agent de réticulation
13. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C.

5 Isolation de feuilles cellulaires

1. Retirez les plaques de 35 mm PNIPAAm traités contenant les cellules de l'incubateur et le placer dans une hotte de culture cellulaire àRT.
2. Aspirer rapidement les médias à partir des cellules, et ajouter 2 ml de 6% de gélatine normale qui a été chauffée à 37 ° C.
3. Bien que la gélatine est encore chaud, placer le treillis métallique dans la gélatine, la plongeant sous la surface de la gélatine normale (Film 1).
4. Placer la totalité de la plaque sur de la glace pendant 5 à 7 minutes, ce qui permet la gélatine à durcir.
5. Après 7 minutes, utiliser une spatule pour bien séparer les bords de gélatine sur le côté de la plaque, puis utilisez une pince pour soulever le treillis métallique de la plaque Remarque: Le 6% de gélatine, et la feuille de cellules devrait soulever avec le réseau.
6. Déplacer la feuille de cellules dans le plat et placer sur le dessus de la combinaison de matrice hydrogel base fibreuse, définissant avec soin le réseau au-dessus de la construction. Remarque: Le côté apical de la feuille de cellule sera toujours en position haute.
7. Ajouter 2 ml de milieu chaud (37 ° C).
8. Incuber O / N permettre à la feuille de cellules d'adhérer à la surface de l'hydrogel.
9. Retirer til treillis métallique après que la solution se réchauffe (environ 1 heure), ou le jour suivant.

Résultats

Le diagramme de flux (figure 1) illustre le procédé global de fabrication de la plaque à couches multiples. les feuilles de cellules sont détachées de la plaque traitée PNIPAAm en laissant tomber la température en dessous de 32 ° C. Ensuite, la feuille de cellules est placée au-dessus de l'hydrogel réticulé contenant des cellules endothéliales ensemencées sur la matrice fibreuse sous-jacente (figure 1). Les plaques thermo-sensible prétraitées peuvent également être ...

Discussion

Les étapes critiques du protocole comprennent: le revêtement des surfaces de la plaque avec le polymère thermosensible et la manipulation des feuilles de cellules après refroidissement des plaques. Parce que les cellules présentent différentes propriétés physiques différentes, comme l'adhésivité, le temps de levée doit être optimisée pour chaque type de cellule différent. La seconde, et la plus significative difficile composante de ce protocole, se concentre sur la manipulation de la feuille de cellul...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Calcein-AM	Invitrogen	C3099	Cell tracker / live dye
Lysotracker Red	Invitrogen	L7528	Cell tracker
Neutral Red	Sigma	N7005	Visible Cell dye
pNIPAAM	Sigma Aldrich	412780250	Poly(N-isopropylacrylamide)
Toluene	Sigma Aldrich	244511-1L
Hexane	Sigma Aldrich	296090-1L
RAOSMC	Lonza	R-ASM-580	Rat Aortic Smooth Muscle Cells
SmGM2	Lonza	CC-4149	Smooth Muscle Media
HUVEC	Invitrogen	C-003-5C	Human Venous Endothelial Cells
HyStem	Glycosan/Biotime
Isopropyl alcohol	VWR International	BDH1133-4LP
Trypsin	Corning Cellgro	25-053-C1
PBS	Gibco	14287-072
FBS	Gibco	16140-071
Specific Equipment
Filter paper	Ahlstrom	6310-0900
Buchner Funnel	Sigma Aldrich	Z247308
UpCell Plates	Nunc	2014-11
UV light	Jelight Company	UVO Cleaner Model No.42