Découverte de nouveaux agents pathogènes intracellulaires par amibienne Coculture et approches amibienne enrichissement

Résumé

Coculture amibienne est un système de culture cellulaire en utilisant des amibes adhérente à croître sélectivement les pathogènes intracellulaires capables de résister à des cellules phagocytaires telles que les amibes et les macrophages. Il représente donc un outil essentiel pour découvrir de nouveaux agents infectieux. Enrichissement amibienne permet de découvrir de nouvelles espèces amibienne et de leurs bactéries intracellulaires spécifiques.

Résumé

Pathogènes intracellulaires tels que les légionelles, les mycobactéries et organismes Chlamydia-like sont difficiles à isoler car ils poussent souvent mal ou pas du tout sur des milieux sélectifs qui sont habituellement utilisés pour cultiver des bactéries. Pour cette raison, beaucoup de ces agents pathogènes ont été découverts que récemment ou à la suite des flambées importantes. Ces agents pathogènes sont souvent associés à des amibes, qui servent de la cellule hôte et de permettre la survie et la croissance des bactéries. Nous avons l'intention ici de fournir une démonstration de deux techniques qui permettent l'isolement et la caractérisation de pathogènes intracellulaires présents dans les échantillons cliniques ou environnementaux: la co-culture amibienne et l'enrichissement amibienne. Coculture amibienne permet la récupération des bactéries intracellulaires en inoculant l'échantillon étudié sur une pelouse amibienne qui peut être infectée et lysée par des bactéries intracellulaires présentes dans l'échantillon. Amibienne enrichissement permet la récupération d'amibes présent dans un échantillon clinique ou environnementale. Thest peut conduire à la découverte de nouvelles espèces amibienne, mais aussi de nouvelles bactéries intracellulaires croissance spécifiquement dans ces amibes. Ensemble, ces deux techniques permettent de découvrir de nouvelles bactéries intracellulaires capables de se développer dans les amibes. En raison de leur capacité à infecter les amibes et résister à la phagocytose, ces bactéries intracellulaires peuvent aussi échapper à la phagocytose par les macrophages et, par conséquent, être pathogènes pour les eucaryotes supérieurs.

Introduction

Avant l'avènement de diagnostic moléculaire, les micro-organismes présents dans l'environnement niches ou dans des échantillons cliniques sont souvent détectés en les cultivant sur différents milieux sélectifs, principalement sur de la gélose dans des boîtes de Pétri. Le phénotype des colonies bactériennes et leur activité métabolique ensuite laissé classification bactérienne au niveau de l'espèce. Le bouillon peut également être utilisée pour augmenter la sensibilité de détection. Cependant, ces deux techniques ne permettent pas la récupération de bactéries qui se développent lentement ou pas du tout sur ces supports. C'est la raison pour laquelle des approches moléculaires sont si largement utilisés de nos jours. Néanmoins, la détection de l'ADN fournit aucune indication sur la viabilité des bactéries. En outre, contrairement à la culture, les approches moléculaires ne conduisent pas à une souche qui peut être en outre caractérisé.

L'étude des agents pathogènes qui se développent mal sur des supports solides ou que les cellules ont besoin pour grandir est compliqué. La plupart de ces «difficile à cultiver" les bactéries sont intr fastidieuxbactéries acellulaire, souvent découverts et caractérisés suivant les grandes épidémies comme ce fut le cas pour Legionella pneumophila. Cette bactérie a été caractérisé suite à une épidémie qui s'est produite au cours d'un congrès de la Légion américaine. Autant que 182 personnes ont été infectées et 29 sont mortes en raison d'une pneumonie sévère de ^1,2. Il a ensuite été démontré que les amibes sont les hôtes naturels de cette bactérie et que leur présence dans les réseaux hôtel de système de climatisation et de l'eau est à l'origine de l'éclosion de la maladie de la soi-disant légionnaire ^3.

Les amibes sont présents dans le monde entier et ont été isolés à partir du sol, l'air, l'eau et la muqueuse nasale de volontaires humains (revue en ^4). Ces amibes "libre-vie» sont généralement divise de manière autonome dans l'environnement, mais peut parfois envahir hôtes permissives ^5. l'alimentation des amibes sur divers micro-organismes par phagocytose et après digestion lysosomale par hydrolases ^6. Beaucoup de bactéries intracellulaires facultatives ou obligeront sont capables de résister à la digestion et donc d'infecter et de diviser en amibes comme par exemple des bactéries ou des mycobactéries Legionella, Chlamydia liées (revu en ⁷ et ^8). Amibes libres représentent probablement un réservoir important potentiel pour les bactéries intracellulaires qui l'ont pas encore été découverts. Cela a conduit notre groupe à mettre en œuvre à Lausanne deux techniques principales, appelées co-culture amibienne et l'enrichissement amibienne, qui ont permis d'isoler les différents groupes de plusieurs nouveaux micro-organismes intracellulaires obligatoires à partir de divers échantillons environnementaux ^9-15.

Depuis amibes sont des phagocytes professionnels qui paissent sur les bactéries, une bactérie capable de résister à la phagocytose et à se développer à l'intérieur de ces protistes peut également coloniser les phagocytes humains et être pathogène envers les humains. Ceci a été partiellement démontrée pour certaines bactéries Chlamydia liés, tels que Waddlia chondrophila. W. chondrophila peut se développer non seulement dans les amibes, mais également dans plusieurs types de cellules telles que des cellules épithéliales de mammifères, les macrophages, et les lignées cellulaires de poisson ^{de 16 à 18.} La co-culture amibienne semble également pertinent pour détecter des bactéries intracellulaires dans des échantillons cliniques, y compris ^19,20 selles qui sont fortement contaminés par les différentes espèces bactériennes ^21.

Nous décrivons ici les principales étapes de co-culture amibienne et l'enrichissement amibienne, y compris (a) le traitement des échantillons environnementaux ou cliniques; (b) la croissance des amibes sur les médias axéniques et sur ​​une pelouse bactérienne d'Escherichia coli et (c) la sélection et la caractérisation des bactéries intracellulaires.

Protocole

Une. Amibienne Coculture

1.1 Préparation de l'échantillon

1. Échantillons de l'environnement
   1. Les échantillons d'eau
      Filtrer l'échantillon de l'eau (500 ml à 1 litre) à travers une membrane de taille de pore de 0,22 um. Ensuite, secouer la membrane dans amibe salines moyennes des PAS de la page (120 mg de NaCl, 4 mg de sulfate de magnésium ₄ • 7H ₂ O, 4 mg de CaCl ₂ • 2H ₂ O, 142 mg de Na ₂ HPO _4, et 136 mg de KH ₂ PO ₄ dans 1 litre d'eau distillée).
   2. Les échantillons solides
      Remettre en suspension les échantillons solides tels que la terre ou sable échantillons et des échantillons semi-solides telles que des boues activées dans l'eau distillée ou du PBS et les filtrer à travers une membrane de taille de pore de 0,22 um. Ensuite, secouer la membrane PAS.
   3. Échantillons fortement contaminés par des amibes endogène et protozoaires
      Première sédimenter les échantillons par centrifugation à basse vitesse (180 x g) for 10 min ou filtrer à travers une membrane de taille de pores de 5 um. Poursuivre le traitement du surnageant (filtrat respectivement), comme au point 1.1.1.
      Note: D'autres techniques de décontamination peuvent être utilisées pour décontaminer en outre des échantillons environnementaux: Chauffer l'échantillon à 50 ° C pendant 30 min ou traiter avec des solutions acides ou basiques ^14.
2. Échantillon clinique
   Traiter les échantillons cliniques en fonction de leurs propriétés physico-chimiques. Filtrer ou centrifuger les liquides pour éliminer les grosses impuretés. Remettre en suspension les échantillons solides. Pour utiliser les tissus, les broyer, par exemple en utilisant une homogénéiser Dounce ou des billes de verre, et de lyser les cellules pour libérer les bactéries intracellulaires.

1.2 préparation amibes

1. préparation d'un bouillon
   Préparer les supports suivants: rich media contenant de la peptone, l'extrait de levure et de glucose (PYG; 100 g de peptone protéose, 10 g d'extrait de levure, 4,9 g de MgSO ₄ 7H ₂ •O, 5 g de citrate de sodium • 2H ₂ O, 0,1 g de Fe _{(NH4) 2 (SO4) 2} • 6H ₂ O, 1,7 g de KH ₂ PO _4, 1,97 g de Na ₂ HPO ₄ • 7H ₂ O , 45 g de glucose, et 0,295 g de CaCl ₂ à 5 L d'eau distillée) et un milieu non nutritif tel que PAS pour les espèces Acanthamoeba.
2. Culture amibienne
   1. Cultiver amibes (Acanthamoeba préférentiellement castellanii ATCC 30010 ou A. polyphaga Linc-AP1) à 25 ° C dans des flacons de culture de cellules contenant 30 ml de milieu PYG.
   2. Récolter les amibes par agitation vigoureuse de la fiole et centrifuger la suspension cellulaire pendant 10 min à 1500 x g. Laver le culot deux fois avec du milieu de PAS. Compter les cellules dans une diapositive Kova et régler le volume pour obtenir une suspension de 5 x 10 ⁵ cellules par ml.
   3. Transférer la suspension amibienne en microplaques. Utilisez 1 ml par puits pour 12 - et 24-wplaques Ell, 500 ul pour des plaques de 48 puits et 300 pl pour plaques à 96 puits. Incuber la microplaque pendant au moins 2 heures à 25 ° C. Ceci permet la sédimentation et la fixation de la amibes au fond de chaque puits.

1.3 Coculture

1. inoculation de l'échantillon
   1. Inoculer la plaque de 2.3.3 à des dilutions successives de l'échantillon à partir de 1,1 ou 1,2, habituellement avec 10 fois la série de dilution, à partir de 100 ul de l'échantillon non dilué.
   2. Centrifuger la microplaque à 1800 xg pendant 10 min à sédiments sur la pelouse amibienne les microorganismes potentiellement présents dans l'échantillon. Cela augmente le contact et la phagocytose des micro-organismes par les amibes.
   3. Incuber les plaques pendant 45 minutes à 25 ° C et laver trois fois avec SAP en remplaçant les médias avec le PAS frais. Ajouter 1 ml par puits de PAS avec ou sans addition d'antibiotiques (streptomycine, de la pénicilline, de gentamicine et / ou à la vancomycine), en fonction de la bactériurieespèces al qui sont recherchées.
   4. Incuber la microplaque à 32 ° C dans une atmosphère humidifiée pour éviter enkystement du amibes. Observez chaque puits tous les jours avec un objectif 20X pour détecter la présence de bactéries envahissantes et lyse des amibes.
   5. Dans le cas d'une lyse, effectuer une sous-culture sur des amibes frais par inoculation de 100 ul de co-cultures d'une monocouche d'environ 10 ⁵ amibes / cm ^2. Pour isoler spécifiquement une espèce bactérienne donnée, inoculer aussi des médias spécifique agar conçu pour ces bactéries (c.-à-BCYE gélose pour Legionella spp.).
   6. En l'absence de lyse, prendre 100 pi de co-cultures quatre à sept jours après la première inoculation et inoculer une culture fraîche amibienne de 900 pi dans une plaque de 24 puits. Si la lyse rapide des amibes est observée sans prolifération de bactéries, un virus peut être présent. Dans ce cas, filtrer le surnageant à 0,22 um et utiliser la suspension filtrée pour infecter des amibes frais.

1.4 l'isolement et la caractérisation bactérienne

1. Coloration bactérienne
   Effectuer co-cultures directement sur des lamelles de verre en microplaques de 24 puits. Retirez le support et effectuer de coloration ou immunofluorescence.
   1. Modifié coloration Romanowsky
      1. Laissez la lamelle sec. Immerger la lamelle cinq fois dans la solution de fixation (2 mg / L Fast Green dans le méthanol).
      2. Immerger la lamelle couvre-cinq fois dans la solution de coloration I (1,22 g / L Eosine G dans du tampon phosphate pH 6,6)
      3. Enfin, immerger la lamelle 5 fois dans la solution de coloration II (1,1 g / L de thiazine dans du tampon phosphate pH 6,6).
      4. Rincer l'échantillon avec de l'eau distillée. Laissez sécher et observer par microscopie.
   2. Ziehl-Neelsen
      1. Laissez la lamelle sec. Couvrir l'échantillon avec Ziehl fuchsine. Chauffer le colorant avec une flamme jusqu'à ce que les vapeurs apparaissent.
      2. Refroidir à la température ambiante pendant au moins 5 minuteset rincer avec de l'eau distillée. Couverture de l'échantillon avec une solution d'acide chlorhydrique à 3% dans l'isopropanol pendant 2 minutes et rincer à l'eau distillée.
      3. Couvrir pendant 30 secondes avec du bleu de méthylène et rincer avec de l'eau distillée. Laissez sécher et observer par microscopie ^22.
   3. Coloration de Gimenez
      1. Préparer une solution de base de fuchsine boursier en mélangeant 100 ml de 10% de fuchsine basique (10 g de fuchsine basique dans 100 ml 95% d'éthanol), 250 ml de 4% de phénol aqueux et 650 ml d'eau distillée. Incuber à 37 ° C pendant 48 heures avant utilisation.
      2. Laissez sécher la lamelle et le fixer en le faisant passer à travers la flamme. Couvrir l'échantillon avec la fuchsine basique fraîchement filtrée (4 ml de solution de base de fuchsine stock dans 10 ml de 0,1 M de tampon phosphate de sodium, pH 7,45) pendant 2 min.
      3. Rincer l'échantillon avec de l'eau et incuber dans le vert de malachite (0,8% dans l'eau distillée) pendant 10 secondes. Rincer à nouveau avec de l'eau et répéter coloration vert malachite. Rincer à nouveau avec de l'eau. Laissez la lamelle sec, montant, et observer par microscopie ^23.
   4. Immunofluorescence
      1. Fixer la lamelle couvre-objet par l'incubation dans du methanol pendant 5 minutes, ou avec du paraformaldéhyde 4% pendant 10 min.
      2. Laver trois fois avec du PBS et incuber pendant 2 heures dans une solution de blocage (5% de BSA, 0,1% de saponine dans du PBS) à température ambiante.
      3. Incuber la lamelle couvre pendant 1 heure dans une solution de blocage contenant des anticorps dirigés contre le micro-organisme d'intérêt.
      4. Laver à nouveau trois fois dans du PBS et incuber pendant 1 heure avec un anticorps secondaire dirigé contre l'anticorps primaire et lié à un fluorophore. Laver trois fois avec du PBS, monter la lamelle couvre-objet et d'observer au microscope à fluorescence.
2. la détection de l'ADN par PCR
   Extraire l'ADN de 100 à 200 ul de coculture amibienne. Détecter des micro-organismes avec des amorces universelles ciblant le gène de l'ARNr 16S ou des amorces spécifiques pour les espèces d'intérêt tels que les mycobactéries ²⁴, ²⁵ légionelles ou les membres de la ²⁶ Chlamydiales.

2. Enrichissement amibienne

2.1. Préparation de l'échantillon

Remettre en suspension les échantillons solides et semi-solides dans le PAS par vortex. Centrifuger la suspension à basse vitesse (180 x g) pendant 10 min. Ceci permet l'enrichissement des amibes libres dans le culot. Le surnageant peut être utilisé pour la co-culture amibienne et le culot ²¹ pour l'enrichissement amibienne.

2.2. Préparation du milieu

1. Ajouter 1,5 g d'agar-agar à 100 ml de PAS et le milieu à l'autoclave 15 min à 121 ° C. Verser le milieu chaud dans des boîtes de Pétri et laisser solidifier à température ambiante.
2. Cultiver Escherichia coli (ATCC 25922) dans un bouillon LB ou thioglycolate pendant une nuit à 37 ° C. Laver les bactéries fois avec du PBS et les remettre en suspension dans un milieu de PAS. Diluer 10x à Pas et répandre 2-3 ml de cette dilution sur une plaque de gélose PAS et laisser sécher.

2.3. inoculation de l'échantillon

Ajouter une goutte de l'échantillon (ou d'un morceau de filtre) sur un côté de la plaque et laisser s'écouler plus de la boîte de Pétri pour former une ligne au centre du plat.

2.4. Croissance amibienne et sous-culture amibienne

1. Observez la boîte de Pétri quotidien. Si un front de migration amibienne est détectée, découper un petit morceau de gélose à l'avant de la migration et inoculer un plat frais ANI Petri recouverte d'une pelouse de E. coli.
2. Répéter plusieurs fois la réinoculation en fonction de la pureté de l'échantillon, afin de disposer d'une culture pure d'une souche donnée amibienne.

2.5. Amibes et les bactéries caractérisation

1. Grattez les cellules et les remettre en suspension dans SAP.
2. Extraire l'ADN et déterminer l'identité des amibes et / ou endosymbiontes bactériennes par PCR et séquençage (ARNr 16S amplification pour les bactéries, resp. 18S pour les amibes et séquençage, par exemple).
3. Utilisez ces cellules grattées à Pas pour inoculer amibes frais et effectuer une co-culture amibienne pour détecter les bactéries éventuellement présentes dans l'échantillon.

Résultats

Utilisation de co-culture amibienne et l'enrichissement amibienne, toute une gamme de bactéries de l'environnement et / ou pathogènes ont été découverts (tableau 1).

Coculture amibienne a été utilisé par notre groupe et d'autres pour analyser des échantillons environnementaux, les usines de traitement de l'eau et des systèmes de distribution d'eau. Un large éventail de microorganismes a pu être isolé par cette technique. Les bactéries les pl...

Discussion

Coculture amibienne et l'enrichissement amibienne sont des méthodes efficaces qui ont permis l'isolement de nombreuses nouvelles espèces bactériennes et amibienne. Les résultats obtenus avec ces méthodes confirment la présence ubiquitaire des amibes et les bactéries à la fois d'amibes résistant à l'environnement, et plus intéressant dans les réseaux d'eau d'origine humaine qui sont considérés pour être commandé par des traitements chimiques tels que la chloration, ozonation. Cocul...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glucose monohydrate	Merck, Darmstadt, Germany	108342
0.22 μm pore size membrane	Merck Millipore, Darmstadt, Germany	SCVPU11RE
proteose peptone	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ	211693
yeast extract	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ	212750
Cell culture flasks	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ	353135
Kova slide	Hycor, Indianapolis, IN	87144
cell culture microplates	Corning Inc, Corning, NY	3524
Diff-Quik staining kit	Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany	130832
Ziehl fuchsin	Fluka, St-Louis, MI	21820
basic fuchsin	Sigma, St-Louis, MI	857843
Phenol	Sigma, St-Louis, MI	P1037	Corrosive and mutagenic
malachite green oxalate	Fluka, St-Louis, MI	63160
Paraformaldehyde 16% solution	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA	15710
Saponin	Sigma, St-Louis, MI	84510