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Résumé

L’escargot marin Aplysia californica a été largement utilisé comme modèle de neurobiologie pour les études sur la base cellulaire et moléculaire du comportement. Ici, une méthodologie est décrite pour explorer le système nerveux d’Aplysia pour les analyses électrophysiologiques et moléculaires de neurones uniques de circuits neuronaux identifiés.

Résumé

Un défi majeur en neurobiologie est de comprendre les fondements moléculaires des circuits neuronaux qui régissent un comportement spécifique. Une fois que les mécanismes moléculaires spécifiques sont identifiés, de nouvelles stratégies thérapeutiques peuvent être développées pour traiter les anomalies dans des comportements spécifiques causés par des maladies dégénératives ou le vieillissement du système nerveux. L’escargot marin Aplysia californica est bien adapté aux investigations de la base cellulaire et moléculaire du comportement parce que les circuits neuronaux sous-jacents à un comportement spécifique pourraient être facilement déterminés et les composants individuels des circuits pourraient être facilement manipulés. Ces avantages de l’Aplysia ont conduit à plusieurs découvertes fondamentales de la neurobiologie de l’apprentissage et de la mémoire. Ici, nous décrivons une préparation du système nerveux d’Aplysia pour les analyses électrophysiologiques et moléculaires des neurones individuels. En bref, le ganglion disséqué du système nerveux est exposé à la protéase pour enlever la gaine ganglionnaire de telle sorte que les neurones soient exposés mais conservent l’activité neuronale comme chez l’animal intact. Cette préparation est utilisée pour effectuer des mesures électrophysiologiques de neurones simples ou multiples. Il est important de noter qu’après l’enregistrement à l’aide d’une méthodologie simple, les neurones pourraient être isolés directement des ganglions pour l’analyse de l’expression génique. Ces protocoles ont été utilisés pour effectuer des enregistrements électrophysiologiques simultanés à partir de neurones L7 et R15, étudier leur réponse à l’acétylcholine et quantifier l’expression du gène CREB1 dans des neurones L7, L11, R15 et R2 uniques isolés d’Aplysia.

Introduction

Le cerveau humain est extraordinairement complexe avec près de 100 milliards de neurones et des billions de connexions synaptiques. Il existe un nombre presque égal de cellules non neuroneuronales qui interagissent avec les neurones et régulent leur fonction dans le cerveau. Les neurones sont organisés en circuits qui régulent des comportements spécifiques. Malgré les progrès réalisés dans notre compréhension des fonctions cérébrales et des circuits neuronaux, on sait peu de choses sur l’identité des composants des circuits qui contrôlent un comportement spécifique. La connaissance des identités de divers composants d’un circuit facilitera grandement notre compréhension de la base cellulaire et moléculaire du comportement et aidera à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les troubles neuropsychiatriques.

L’escargot marin Aplysia californica a été un cheval de bataille pour déterminer les circuits neuronaux sous-jacents à des comportements spécifiques1-14. Le système nerveux d’Aplysia contient environ 20 000 neurones qui sont organisés en 9 ganglions différents. Les neurones de l’Aplysia sont grands et peuvent être facilement identifiés en fonction de leur taille, propriétés électriques, et la position dans les ganglions. Aplysia a un riche répertoire de comportements qui peuvent être étudiés. L’un des comportements bien étudiés est le réflexe de retrait des branchies (GWR). Les composants centraux de ce réflexe sont situés dans les ganglions abdominaux. Les composantes des circuits de la régression pondérée géographiquement ont été cartographiées et les contributions de divers composants ont été déterminées. Il est important de faire en charge les circuits de régression pondérée géographiquement par5,6,15-19. Des décennies d’étude sur ce réflexe ont également identifié plusieurs voies de signalisation qui ont un rôle clé dans l’apprentissage et la mémoire20-24.

Plusieurs préparations différentes d’Aplysia ont été employées pour étudier la base cellulaire et moléculaire du stockage de mémoire. Il s’agit notamment de l’animal intact2,3,de la préparation semi-intacte1,7,13,14,16 et de la reconstitution des principaux composants des circuits neuronaux25-29. Une préparation réduite pour explorer des ganglions d’aplysie pour les analyses électrophysiologiques et moléculaires des circuits neuronaux identifiés est décrite ici. Les quatre neurones identifiés suivants ont été étudiés. R15, un neurone éclatant, L7 et L11, deux neurones moteurs différents et R2, un neurone cholinergique ont été étudiés. R2 est le plus grand neurone décrit dans le système nerveux des invertébrés. En bref, cette méthodologie implique le traitement de la protéase des ganglions, des mesures électrophysiologiques avant et après les traitements pharmacologiques, et l’isolement des neurones simples pour l’analyse quantitative de l’expression des gènes. Cette méthodologie nous permet de combiner des analyses moléculaires avec l’enregistrement simultané de plusieurs neurones. Cette méthodologie a été avec succès employée pour étudier des réponses des neurones R15 et L7 à l’acétylcholine (Ach) par les enregistrements intracellulaires appariés. Après des mesures électrophysiologiques R15 et L7 et d’autres neurones identifiés tels que L11 et R2 ont été isolés pour l’analyse quantitative de l’amplification en chaîne par réaction (qPCR) de l’expression de CREB1, un facteur de transcription important pour le stockage de mémoire.

Protocole

1. Préparation des ganglions abdominaux, mesures électrophysiologiques et isolement de neurones identifiés uniques à partir du ganglion abdominal d’Aplysia californica

  1. Maintenir Aplysia dans l’aquarium de laboratoire avec de l’eau de mer artificielle circulante (ASW) à 16 °C dans des conditions claires:sombres à 12:12.
  2. Isolement de ganglion abdominal.
    1. Anesthésier les animaux en injectant une solution de MgCl2 de 380 mM pendant 5 à 10 minutes (équivalent à 30 à 35% du poids corporel de l’animal).
    2. Identifier le ganglion abdominal en fonction de sa position dans le système nerveux central24,28.
    3. Enlever les ganglions par opération chirurgicale et les stocker immédiatement dans de l’eau de mer artificielle composée de 450 mM de NaCl, 10 mM de KCl, 10 mM deCaCl2,55 mMMgCl2,2,5 mM de NaHCO3 et 10 mM d’HEPES (pH 7,4).
  3. Traitement de la protéase.
    1. Incuber un ganglion abdominal pendant 30 min à 34 °C±0,5 dans une boîte de Petri avec de la protéase à 0,1 % (dispase) diluée dans de l’ASW décrit ci-dessus.
      REMARQUE: La quantité de protéase utilisée doit être normalisée en avec l’âge et le poids des animaux. En général, les animaux plus âgés et plus gros auraient besoin de plus de protéase.
  4. Enlèvement de gaine de ganglions.
    1. Après le traitement enzymatique, épinglez les ganglions à la base en silicone Sylgard d’une chambre cellulaire (Ø = 1 cm; vol. = 0,3 ml) et perfuser avec de l’ASW (débit: 150 μl/min) à température ambiante (18 °C±2).
      REMARQUE: Afin d’augmenter la visibilité des neurones identifiés, placez le ganglion sur le dessus d’un cylindre en verre polycarbonate(Figure 1)(diamètre Ø = chambre cellulaire modifiée de 2 mm) qui peut être facilement éclairé par le bas à l’aide d’un stéréomicroscope binoculaire à grossissement 20X et 40X.
    2. Retirez soigneusement la gaine du ganglion à l’aide de pinces et de microscisseurs.
  5. Enregistrement électrophysiologique simultané de deux neurones.
    1. Identifier le neurone d’intérêt.
    2. Empaler le neurone avec une seule microélectrode pointue intracellulaire avec une résistance 10-15 MΩ remplie d’une solution de KCl 3 M.
    3. Enregistrer l’activité neuronale (passe de bande de 10 kHz) à l’aide d’un système d’enregistrement intracellulaire.
    4. Traiter les données d’enregistrement à l’aide d’un logiciel d’électrophysiologie tel qu’Axograph.
      REMARQUE: On peut facilement effectuer l’enregistrement de plusieurs neurones. Les neurones L7, L11 ou R15 et R2 sont facilement identifiables en fonction de leur position. Deux amplificateurs et deux micromanipulateurs sont nécessaires pour enregistrer simultanément à partir de deux neurones L7 et R15(Figure 2).
  6. Demande de médicament.
    1. Appliquer le médicament de choix dans la chambre cellulaire par pipetage doux ou injecter directement dans les neurones.
    2. Effectuer des mesures électrophysiologiques.
      REMARQUE: Selon l’objectif expérimental, on pourrait mesurer différents paramètres électrophysiologiques des neurones tels que les changements de potentiel membranaire (MP) ou de potentiel d’action (AP) avant, pendant et après l’application du médicament.
  7. Isolement des neurones uniques.
    1. À la fin des expériences électrophysiologiques, arrêtez la perfusion d’ASW et lavez le ganglion avec de l’éthanol à 100%.  L’exposition à l’éthanol pétrifiera les neurones et, à l’aide d’une pince fine, facilitera l’enlever des neurones individuels sans endommager d’autres neurones du ganglion.
    2. Retirez les neurones simples sous un stéréomicroscope et transférez-les dans un petit tube Eppendorf contenant un réactif d’extraction d’ARN glacé de 500 μl. Des neurones isolés peuvent être stockés dans un réactif d’extraction d’ARN à -80 °C pour une analyse future.

2. Isolement de l’ARN à partir de neurones uniques et analyse de l’expression génique par PCR quantitative en temps réel (qPCR)

  1. Précautions à prendre pour minimiser la dégradation de l’ARN :
    Les ribonucléèses (RNases) dégradent l’ARN et sont des enzymes très stables et actives. Suivez les étapes suivantes lors de la gestion des ARN.
    1. Nettoyez la zone de travail et les instruments avec des agents de désactivation RNase.
    2. Portez des gants en tout temps tout en manipulant l’ARN et changez souvent de gants.
    3. Utilisez uniquement des plastiques sans RNase pour manipuler les ARN.
  2. Isoler l’ARN total des neurones simples:
    1. Le protocole standard trizol pour l’isolement de l’ARN peut être utilisé pour isoler les ARN à partir de neurones uniques. Ajouter brièvement 20% v/v de chloroforme à Trizol, bien mélanger par un bref vortex.
    2. Placer les tubes sur rotateur pendant 10 min à 4 °C. Faire tourner le mélange Trizol-Chloroforme à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
    3. Recueillir la phase aqueuse et le transférer dans un tube frais.
    4. Ajouter une solution d’acétate de sodium (pH 5,5) à une concentration finale de 0,3 M, 100 ng/ml du coprecipitant GlycoBlue et 2,5 volumes d’éthanol à 100 % pour précipiter l’ARN.
    5. Bien mélanger les échantillons et incuber à -80 °C pendant la nuit.
    6. Faites tourner les échantillons à 12 000 x g pendant 20 min à 4 °C et une petite pastille bleue sera visible au fond du tube.
    7. Retirer le surnageant et laver le culot avec 850 μl d’éthanol glacé à 75 % à 12 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
    8. Retirez soigneusement le surnageant et séchez à l’air la pastille d’ARN pendant 7-10 min, maximum.
      REMARQUE: Assurez-vous que l’ARN n’est pas laissé longtemps à sécher comme plus- leséchage de la pastille d’ARN rend la solubilisation très difficile.
    9. Une fois séché, ressusciter la pastille d’ARN dans 10 μl d’eau exempte de RNAse et déterminer la concentration d’ARN.
      REMARQUE: Déterminer la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre. Lorsque vous n’utilisez pas immédiatement, stockez l’ARN à -80 °C.
  3. Synthèse de l’ARN à partir de neurones uniques :
    1. Amplifier l’ARN (un ou deux tours selon l’objectif expérimental) en utilisant un système d’amplification linéaire de l’ARN disponible dans le commerce.
      REMARQUE: L’ARN total des neurones simples variait de ~ 10-60 ng. Le rendement attendu du premier cycle d’amplification est d’environ 100-300 ng et le deuxième cycle d’amplification est d’environ 0,8-1,5 μg d’ARN.
  4. Transcription inverse de l’ARN :
    1. Pour générer de l’ADNc à partir d’ARN, utilisez 1,0 μg d’ARN dans 20 μl d’une réaction de transcription inverse. Plusieurs kits sont disponibles dans le commerce à cet effet.

      REMARQUE: L’ADNc a été synthétisé selon le protocole du fabricant en utilisant les paramètres suivants sur le cycleur thermique.
      5 min à 25 °C
      30 min à 42 °C
      5 min à 85 °C
      Maintenir à 4 °C
    2. Après l’étape de transcription inverse, stockez l’ADNc à -20 °C pour un stockage à long terme.
  5. Conception et normalisation de l’apprêt :
    Plusieurs excellents logiciels sont disponibles, gratuitement, pour concevoir des amorces pour des amplifications en temps réel.
    1. Sélectionnez 18 à 24 oligonucléotides mer qui produisent des amplicons de 70 à 110 pb et synthétisez les amorces à l’aide de sources commerciales.
      REMARQUE : Deux à trois paires d’amorces doivent être conçues pour chaque gène d’intérêt. Chaque ensemble d’amorces doit être normalisé par qPCR. Les paires d’amorces avant et arrière qui ont été utilisées pour le gène CREB1 (Figure 4) sont ci-dessous :

      Jeu d’amorces 1
      Avant: 5'-TGATTCTGACGCAAAGAAAAGA-3'
      Revers : 5'-ACCGTGAGCAGTCAGTTGTAGA-3'
      Jeu d’amorces 2
      Avant: 5'-AGGGAATGTCGATGAAAGAAGA-3'

      Inverse: 5'-GACACACAGGAAGTATGCCAAA-3'
    2. Pour sélectionner la meilleure amorce à utiliser pour les analyses en aval, surveillez la valeur Ct et la forme de la courbe d’amplification en qPCR.
      REMARQUE: Les amorces qui donnent des valeurs Ct (seuil de cycle) comprises entre 10 et 35 dans l’amplification ronde 40 et des courbes lisses pendant la phase exponentielle de la PCR suivie d’un plateau lisse sont optimales pour les analyses d’expression génique.
  6. PCR quantitative en temps réel (qPCR) :
    Remarque : Utilisez des tubes ou des plaques appropriés compatibles avec la machine qPCR.
    1. Diluer l’ADNc à 5x avec de l’eau sans nucléase.
    2. À 2 μl d’ADNc dilué, ajouter 8 μl d’un mélange maître qPCR contenant 2 μl deH2O,5 μl de 2x mélange maître SYBR Green et 1,0 μl de 10 μM (chacun) d’amorce avant et arrière.
    3. Fermez les tubes et scellez la plaque après avoir pipeté l’ADNc et le mélange maître. Mélanger le contenu en tapotant doucement et en tournant vers le bas à 1 500 tr / min pendant 30 secondes.
    4. Passez à la configuration de la machine qPCR.

Résultats

Le poids des animaux utilisés dans cette étude variait de 100 à 200 g. Suivant les protocoles décrits, nous avons effectué des mesures électrophysiologiques et l’analyse moléculaire des neurones des ganglions abdominaux isolés chez les animaux s’étendant de 2-5 g à 200-300 g.

La normalisation du traitement de protéase est importante pour des mesures électrophysiologiques réussies des neurones dans les ganglions. Initialement, des concentrations et des durées multiples de prot...

Discussion

Le neurone R15 est impliqué dans la régulation des systèmes cardiovasculaire, digestif, respiratoire et reproducteur30. Une activité d’éclatement régulièrement rythmique de l’AP est une caractéristique de R15. Comme le montre la section des résultats, l’enregistrement apparié de R15 et L7 montre que la préparation des ganglions a préservé l’activité des neurones R15. Les neurones R15 et L7 ont répondu convenablement à Ach. Cette préparation de ganglions a pu être maintenue jusqu’à ...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Nous remercions sincèrement la Fondation Whitehall pour son soutien financier et les fonds de démarrage du Scripps Research Institute pour la réalisation de ce travail.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
AplysiaNational Aplysia Resource Facility, University of Miami
NaClSIGMAS 3014-1KG
KClSIGMAP 9333-500G
CaCl2•2H2OSIGMAC5080- 500G
MgCl2•6H2OFisher ScientificBP 214-501
NaHCO4SIGMAS 6297-250G
HEPESSIGMAH 3375-500G
ProteaseGIBCO17105-042
TrizolAmbion15596-026
ChloroformMP Biomedicals2194002
100% EthanolACROS64-17-5
GlycoBlueAmbionAM9515
3 M NaOAc, pH 5.5AmbionAM9740
Nuclease free waterAmbionAM9737
MessageAmp II aRNA Amplification KitAmbionAM1751
qScript cDNA SuperMixQuanta Biosciences95048-100
Power SYBR Green PCR Master MixApplied Biosystems4367659
ForcepsFine Science Tools11252-20
ScissorsFine Science Tools15000-08
Stainless Steel Minutien Pins Fine Science Tools26002-10 or
26002-20
Veriti Thermal CyclerApplied BiosystemsVeriti Thermal Cycler
5430R CentrifugeEppendorf5430R Centrifuge
7900HT Fast Real-Time PCRApplied Biosystems7900HT Fast Real-Time PCR
AmplifierBRAMP-01RNPI Electronics
Digidata ConverterInstrutech ITC-18HEKA ELEKTRONIK
Micro ManipulatorPatch StarScientifica

Références

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