Etude de la migration cellulaire dans les canaux microfabriqués

Résumé

Une méthode quantitative pour étudier la migration spontanée des cellules dans un micro-environnement confiné à une dimension est décrite. Ce procédé tire parti de canaux micro-usinés et peut être utilisée pour étudier la migration d'un grand nombre de cellules dans des conditions différentes dans des expériences simples.

Résumé

La méthode décrite ici permet l'étude de la migration des cellules sous confinement dans une dimension. Il est basé sur l'utilisation de canaux micro-usinés, qui imposent un phénotype de cellules polarisées par des contraintes physiques. Une fois à l'intérieur des canaux, les cellules n'ont que deux possibilités: aller de l'avant ou vers l'arrière. Cette migration simplifié dans lequel la directivité est limitée facilite le suivi automatique des cellules et l'extraction des paramètres quantitatifs pour décrire le mouvement des cellules. Ces paramètres comprennent la vitesse de la cellule, les changements de direction, et les pauses pendant le mouvement. Microcanaux sont également compatibles avec l'utilisation de marqueurs fluorescents et sont donc appropriés pour étudier la localisation des organites intracellulaires et des structures au cours de la migration cellulaire à haute résolution. Enfin, la surface des canaux peut être fonctionnalisé avec des substrats différents, ce qui permet le contrôle des propriétés adhésives des canaux ou l'étude des haptotaxis. En résumé, le système havant que décrit est destiné à analyser la migration des grands nombres de cellules dans des conditions dans lesquelles à la fois la géométrie et la nature biochimique de l'environnement sont contrôlées, ce qui facilite la normalisation et la reproductibilité des expériences indépendantes.

Introduction

La migration est une fonction cellulaire complexe qui est important pour de nombreux processus physiologiques chez les organismes multicellulaires, y compris le développement, les réponses immunitaires, et la régénération des tissus. En outre, certaines situations pathologiques telles que l'invasion tumorale et les métastases reposent sur ​​la motilité cellulaire ^1. Pour ces raisons, la migration cellulaire est devenu un domaine d'étude dans le cadre de la recherche à la fois fondamentale et translationnelle. In vivo, la plupart des tissus sont caractérisés par une matrice extracellulaire riche et haute densité cellulaire. La migration cellulaire par conséquent, dans des conditions physiologiques, se produit dans un environnement confiné complexe. Classiquement, probablement pour des raisons historiques et des limites techniques, la migration cellulaire a été étudiée dans les systèmes 2D plats qui ne se reproduisent pas beaucoup des propriétés de l'environnement présentes dans les tissus, tels que l'isolement. De plus, des facteurs comme l'adhésion cellulaire, qui sont essentiels pour la motilité en 2D, ont été récemment montré à ne pas être necessacipalement requis pour la migration in vivo ou à l'intérieur des gels, ce qui suggère que les mécanismes qui régissent la locomotion cellulaire en 2D et dans d'autres environnements sont distincts ^2. Plusieurs systèmes ont été développés pour imiter les propriétés complexes des tissus, le plus célèbre des gels de collagène les être, qui visent à récapituler les propriétés de la composition de la matrice extracellulaire ^3. Ici, nous proposons des micro-canaux en tant que méthode complémentaire simple qui permet la migration des cellules d'étude dans une dimension dans un environnement confiné.

Dans ce système, les cellules migrent le long des microcanaux dans lesquels ils entrent spontanément. Cellules migratrices acquièrent alors la forme des canaux, l'adoption d'une géométrie tubulaire qui renforce probablement leur polarité. Le mouvement linéaire des cellules dans les canaux de la cellule permet un suivi automatique et l'extraction des paramètres quantitatifs à partir d'expériences. Du point de vue technique, ce système est facile et souple. Le Revêtementsg des parois de canal peut être manipulée, la taille et la forme des canaux peuvent être adaptées, et un grand nombre de cellules peut être analysée dans des expériences simples. Ce système peut également être mis à l'échelle en place pour effectuer l'analyse moyen de l'écran de gamme de molécules impliquées dans la motilité cellulaire. Le protocole décrit ici a été normalisé en utilisant des cellules dendritiques (DC) comme un modèle cellulaire. Ces cellules sont la clé du système immunitaire car ils participent à l'initiation et le maintien de réponses immunitaires spécifiques ^4. In vitro, les PED ont été montré pour migrer spontanément dans des environnements confinés et sont donc un bon modèle pour étudier la motilité cellulaire dans des microcanaux ^5,6 . Surtout, ce système peut être étendu pour analyser la migration de tout autre type de cellules mobiles comme les lymphocytes T, les neutrophiles, les cellules tumorales ou ^9.7.

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Protocole

Note importante: Ce protocole suppose que le moule contenant la forme pour les microcanaux désirés ont déjà été accomplis. Pour plus d'informations sur la préparation du moule a été déjà publié ^10. Ce protocole suppose aussi que la culture des pays en développement de la moelle osseuse est connu.

Une. Fabrication de puces

1. Mélanger l'huile PDMS et l'agent de durcissement dans un rapport pondéral 10:01 dans un gobelet en plastique. Mélanger soigneusement les deux composés.
2. Jetez le mélange sur les microcanaux d'appui du moule. La hauteur totale doit être comprise entre 0,5-1 cm.
3. Retirer les bulles d'air dans une cloche de pot sous vide pendant 1 heure.
4. PDMS durcir dans le moule, en plaçant celle-ci dans un four pendant 2 heures à 65 ° C.
5. Une fois que le PDMS est à température ambiante, couper un gros morceau autour de la structure avec une lame chirurgicale et le retirer du moule (figure 1A).
6. Percez des trous où les cellules seront injectées (généralement de 2 mm) et redimensionner le PDMSavec une lame chirurgicale pour s'adapter à la taille des récipients en verre à fond dans lequel la migration sera évaluée (figure 1B). Avant de commencer, enlever la poussière résiduelle de l'antenne à l'aide du papier optique. Cela favorise la liaison de PDMS de verre décrit à l'étape 1.10.
7. Nettoyez la puce PDMS redimensionnée contenant les canaux par collage et le pelage du ruban adhésif sur les côtés de la structure.
8. Soniquer les morceaux PDMS 30 sec à 70% d'éthanol pour éliminer les poussières et les petites particules de PDMS. Séchez-les rapidement par la suite par soufflage d'air propre.
9. Activer le PDMS (structures vers le haut) et des boîtes de culture à l'air (ou d'oxygène) traitement au plasma pendant 30 secondes à 300 mTorr.
10. Placez les deux surfaces activées au contact de coller définitivement les PDMS sur le substrat. Si nécessaire, l'utilisation de pinces métalliques à presser légèrement sur ​​le dessus du PDMS pour forcer le contact entre le polymère et le verre de la cuvette (figure 1C).
11. Incuber la puce à l'étuve à 65 ° C for 1 h à renforcer la liaison.

2. Revêtement de microcanaux

1. Activer l'ensemble de la structure par plasma dans l'air à 300 mTorr pendant 1 min. Cela favorisera l'entrée de liquide dans les canaux à l'étape suivante.
2. Remplir rapidement les trous de la puce avec la fibronectine d'entrée à 10 pg / ml dans l'eau. D'autres substrats tels que le PEG peuvent être utilisés pour modifier l'adhérence des cellules aux parois du canal. Veillez à ce que le liquide se répand dans l'ensemble de la structure. Ceci peut être facilement vérifié par l'œil sous la lumière régulière ou en utilisant un microscope ordinaire de champ lumineux.
   NOTE: Dans les très petites structures, dont la diffusion est plus difficile, entrée de liquide dans les canaux peut être forcée en plaçant la structure dans une cloche de pot à vide pendant au moins 15 min. Pour vérifier l'efficacité de l'enrobage des substrats fluorescents peuvent être utilisés (figure 2).
3. Incuber 1 heure à température ambiante pour permettre l'adsorption de la fibronectine ou tout autre revêtement de substévaluer les parois des canaux.
4. Lavez les structures 3x avec PBS pour éliminer le substrat nonbound.
5. Après le lavage, procéder au protocole 3 ou stocker la puce à 4 ° C pour une utilisation ultérieure (24 heures maximum).

3. Cellule Chargement en cours

1. Retirer le PBS de la plaque et de remplir le microsystème avec du milieu cellulaire. Laissez incuber pendant 1 heure à saturer les canaux avec le milieu.
   NOTE: Pour les expériences portant sur des médicaments comme les inhibiteurs de molécules, il est conseillé de pré-incuber les canaux avec un milieu contenant le médicament à la bonne concentration. De plus, certains médicaments ont tendance à se solubiliser dans la structure PDMS qui réduit la concentration efficace. Certaines solutions ont été proposées pour contrer ce problème ^11-12.
2. Retirer les PED flottants et récupérer les cellules semi-adhérentes par balayage avec un milieu de culture. Compter les cellules en utilisant un hématimètre.
   REMARQUE: Pour l'imagerie noyau, un Hoechst 33342 coloration peut être obtenue au préalable par decubating 2 x 10 ⁶ cellules pendant 30 min avec le colorant à 200 ng / ml dans du milieu complet. Laver deux fois par centrifugation pour éliminer l'excès de colorant avant de poursuivre le protocole.
3. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min (temps et la vitesse peuvent être différents selon le type de cellule) et jeter le milieu. On dilue le culot pour atteindre une concentration de 20 x 10 ⁶ cellules / ml.
4. Éliminer l'excès de milieu de la plaque et vider les trous d'entrée dans la structure PDMS à l'aide d'une micropipette. Remplir les entrées avec 5 pl de solution de cellules pour atteindre une quantité de 1 x 10 ⁵ cellules dans chaque trou d'entrée.
   REMARQUE: La forte densité de cellule est nécessaire pour favoriser le contact des cellules avec les canaux. La faible densité de cellules peut donner lieu à un faible nombre de cellules à l'intérieur des canaux et l'échec de l'expérience.
5. Incuber la puce pendant 30 min à 37 ° C dans l'incubateur. Ajouter 2 ml de milieu complet à la boîte de test.
   NOTE: L'ensemble de la structure de PDMS doit be couvert afin d'éviter le séchage des cellules au cours de l'expérience. Si 2 ml n'est pas suffisant, ajouter plus de moyen pour couvrir complètement la structure PDMS.

4. Imagerie

1. Nettoyer la surface externe du fond des plats avec le tissu de nettoyage de lentille avant de placer les plaques sous le microscope.
2. Pour analyser la migration en grand nombre de cellules, utiliser un grossissement de 10X et éclairage grand champ en CO ₂ et la température équipée vidéo-microscope (Figure 3). Pour faciliter le suivi de la cellule, coloration de Hoechst et aux rayons UV peut être utilisé (voir l'étape 3.2). La migration peut être également analysée en utilisant la microscopie confocale afin d'obtenir une meilleure résolution des structures cellulaires au cours de la migration.
3. Pour la microscopie time-lapse à 10X, pour choisir une fréquence de temps selon la vitesse de cellule attendu (typiquement de 2 min pour les cellules dendritiques migrent à une vitesse de 5 um / min).
   Remarque: Le protocole décrit ici ne not comprennent l'analyse des paramètres de migration cellulaire. Quelques points sont répertoriés dans la discussion d'informer les lecteurs sur la façon de procéder pour extraire des informations à partir de films de time-lapse.

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Résultats

Dans chaque expérience, la surface du PDMS est revêtue d'une molécule adaptée à l'intérêt de l'étude. Figure 2 montre les canaux revêtus d'une molécule fluorescente, PLL-g-PEG, avant et après le lavage (étape 2.4). Une telle expérience permet de contrôler l'homogénéité du revêtement dans les canaux.

Après chargement de la cellule, la microscopie vidéo peut être effectuée pour suivre la migration cellulaire. Figure 3A...

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Discussion

Ici, nous décrivons un dispositif composé de microcanaux comme une méthode pour étudier les propriétés migratoires des grand nombre de cellules dans des expériences simples. Ce système expérimental imite les contraintes environnementales confinés trouvés dans les tissus par des cellules migratoires endogènes. Cependant, en forçant la migration dans une seule dimension, il facilite le suivi automatique de la cellule et l'extraction de paramètres mesurables (Figure 5). Nous montrons éga...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS)	GE Silicones	RTV615	Package of 90% silicone base and 10% curing agent
Core sample cutter	Ted Pella Int.	Harris Uni-Core	Diameter 2.5 mm
Glass-bottom dish	WPI	Fluorodish FD 35-100
Ultrasonic cleaner	Branson Ultrasonics	Branson 200
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC 32 G	For small samples (35 dishes). A bigger version is also available
Fibronectin from bovine plasma	Sigma Aldrich	F0895
PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG)	Susos	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
Y27632	TOCRIS	1254