Un Alkali-brûlures modèle de néovascularisation cornéenne chez la souris

Résumé

Néovascularisation (NV) de la cornée peut compliquer multiples pathologies visuelles. Utilisant un modèle de lésion alcalin brûlage dirigé, un niveau quantifiable de la SA de la cornée peut être produite pour l'étude mécaniste de la SA de la cornée et l'évaluation des thérapies potentielles pour les troubles néovasculaire.

Résumé

Dans des conditions normales, la cornée est avasculaire, et cette transparence est essentielle pour maintenir une bonne acuité visuelle. La néovascularisation (NV) de la cornée, qui peut être causée par un traumatisme, une maladie infectieuse ou kératoplastie, se décompose de la soi-disant «privilège angiogénique 'de la cornée et forme la base de plusieurs pathologies visuelles qui peuvent même conduire à la cécité. Bien qu'il existe plusieurs options de traitement disponibles, les besoins médicaux fondamentaux présentés par des pathologies de la cornée néovasculaire reste insatisfait. Afin de développer des thérapies sûres, efficaces et ciblés, un modèle fiable de la SA de la cornée et une intervention pharmacologique est nécessaire. Ici, nous décrivons un modèle de néovascularisation cornéenne blessures en milieu alcalin de brûlure dans la souris. Ce protocole fournit un procédé pour l'application d'une blessure en milieu alcalin combustion contrôlée de la cornée, de l'administration d'un composé d'intérêt pharmacologique, et la visualisation du résultat. Cette méthode pourrait s'avérer instrumentationtal pour étudier les mécanismes et les possibilités d'intervention dans NV cornée et d'autres troubles néovasculaire.

Introduction

Cécité cornéenne est la quatrième cause la plus fréquente de cécité, responsable d'environ 4% de tous les cas ^1. Néovascularisation de la cornée (NV) joue un rôle important dans bon nombre de ces pathologies, y compris la kératite herpétique (le leader de cause infectieuse de cécité dans l'Ouest) et le trachome (la principale cause de cécité infectieuse dans le monde) ^2. Les traitements actuels comprennent des stéroïdes, des médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS), des thérapies anti-VEGF, et la cyclosporine A, ainsi que les techniques chirurgicales conventionnelles ou laser ^3. Cependant, la nature débilitante de NV basée pathologies de la cornée, la rareté des installations chirurgicales capables de traiter NV cornée, et l'absence d'une option pharmacologique fortement d'effectuer mené une table ronde d'experts récente de conclure que, malgré les traitements existants, la nécessité médicale fondamentale présenté par ces pathologies reste insatisfait ^4.

La cornée humainese compose de 5 couches, 3 couches cellulaires (épithélial, stromales et endothéliales) et 2 interface (membrane de Bowman et de la membrane de Descemet). Il fonctionne comme une barrière mécanique et de la surface de réfraction de l'oeil. Sa transparence est la conséquence d'un équilibre délicat de ses composantes et fait partie intégrante de sa fonction ^5. Normalement avasculaire, la cornée reçoit le sang à partir de micro-vaisseaux qui courent le long de son bord extérieur, qui sont alimentés à partir de la ciliaire et des artères ophtalmiques. NV cornéenne se produit quand un stimulus favorise l'angiogenèse de ces vaisseaux ce qui leur permet de se développer vers le centre de la cornée et donc de limiter vision ^6. L'angiogenèse cornéenne comprend hemangiogenesis et la lymphangiogenèse, qui donnent lieu à la croissance de vaisseaux sanguins et les vaisseaux lymphatiques à partir de l'arcade vasculaire limbique vers le centre de la cornée. Cela conduit à une rupture de la cornée "privilège angiogénique", une augmentation de l'opacité de la cornée et de la fibrose, la perturbation de la cornée layers, et œdème ^7. Les déclencheurs précis de la SA de la cornée sont nombreux, allant d'une réponse aux maladies infectieuses telles que le trachome à un état induit chimiquement provoqué médicaments traditionnels, les produits chimiques industriels, ou des agents de guerre chimiques même.

Les mécanismes moléculaires de ce processus ne sont pas, encore, entièrement caractérisés; Cependant, quelques joueurs clés ont été identifiés. Dans des conditions normales la cornée possède un «privilège angiogénique» unique maintenu par un réseau redondant de facteurs anti-angiogéniques (tels que VEGF-R1 soluble) ^8. Toutefois, en réponse à un stimulus externe (par exemple une blessure), il y aura une régulation à la hausse locale de facteurs pro-angiogéniques (par exemple, VEGF-A). Cette pencher la balance de facteurs pro-et anti-angiogéniques qui sous-tend le privilège angiogénique de la cornée, et conduit à hemangiogenesis, lymphangeogenesis, et l'inflammation, provoquant ainsi une pathologie cornéenne et même la cécité ^9.

Compte tenu de l'besoins médicaux non satisfaits de cette pathologie très invalidante, il est de l'intérêt sur le terrain pour avoir un modèle animal fiable de la SA de la cornée. Ici, nous présentons un tel modèle: contrôlé blessure alcali-brûlure. Différents modèles œil blessures basés sur l'utilisation des anneaux de papier filtre ont été utilisés depuis les années 1970 ^10. En 1989, un groupe d'ophtalmologistes Harvard Medical School caractérisé un modèle standard d'une blessure en milieu alcalin de combustion centrale de la cornée du lapin sur la base de tremper une feuille de papier filtre circulaire avec de l'hydroxyde de sodium (NaOH) et de l'appliquer à la cornée à une gamme spécifique de ¹¹ concentrations. Depuis lors, cette technique a été adaptée pour une utilisation dans le ^12-14 de la souris. Récemment, le laboratoire Wang a étudié les effets thérapeutiques de l'histone déacétylase (HDAC) SAHA dans la pathogenèse de la NV cornéenne à l'aide d'un modèle de lésion de la cornée dans les alcalis brûlure souris ^15. La méthodologie de la cornée modèle de lésion alcali-brûlure souris présentée ici a été construitprincipalement sur ​​le travail préalable de deux autres documents ^14,16.

Protocole

Remarque: Le protocole suivant et les résultats représentatifs utiliser l'inhibiteur de HDAC SAHA comme un composé d'exemple. Toutefois, ce protocole n'est en aucun cas limitée à l'utilisation de SAHA, et est recommandée en tant que méthode générale pour tester les effets des composés solubles sur la néovascularisation de la cornée. Des modifications mineures doivent être pris pour que le degré de dilution ainsi que la fréquence et la durée d'application. En outre, des composés qui sont facilement solubles dans l'eau pourront être administrées en l'absence de DMSO.

Engagement éthique: Tous les expériences sur les animaux ne doivent être effectuées en conformité avec la législation nationale et les règlements institutionnels. Ce protocole a été approuvé pour une utilisation par l'Université de Tulane institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité.

Une. Préparation du matériel (dans l'ordre d'utilisation)

1. Couper un morceau de papier filtre de cellulose (11 um) en deux cercles mm.
2. Préparer une solution à 1 M de NaOH pardissolvant 20 g de NaOH dans 500 ml d'eau distillée H ₂ O. Stocker à température ambiante. ATTENTION: des solutions de NaOH sont corrosifs et peuvent causer des brûlures alcalins.
3. Préparer un cocktail anesthésiant en diluant 10 ml de 100 mg / ml de kétamine et de 2,5 ml de 20 mg / ml de xylazine dans 37,5 ml de 1 x PBS pour obtenir une concentration finale de 20 mg / ml de kétamine et de 4 mg / ml de xylazine.
4. Préparer une solution à 0,5% de chlorhydrate de proparacaïne (pour une analgésie topique) en dissolvant 500 mg de chlorhydrate de proparacaïne dans 100 ml de PBS filtré.
5. Préparer 1x PBS en dissolvant 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na ₂ HPO _{4 et} 0,23 g de NaH ₂ PO ₄ dans 900 ml d'H ₂ O. distillée Ajuster à pH 7,4. Porter la solution à un volume final de 1000 ml avec de l'H ₂ O distillée et de filtrage pour assurer la stérilité.
6. Préparer 1000 x solutions de stockage de SAHA à ~ 100 mM dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) en dissolvant 26,4 mg de SAHA dans 1 ml de DMSO. Diluer à un 1x (~ 10 M)solution dans du PBS filtré à chaque utilisation. Conserver la solution stock à -20 ° C pendant un mois. ATTENTION: Le DMSO est une toxine et mutagène connu.
7. Préparer une solution à 4% de paraformaldéhyde (PFA) pour la fixation. Sous une hotte chimique, dissoudre 4 g de PFA dans 90 ml de PBS. Porter le mélange à 65 ° C et titrer jusqu'à un pH de 7,4. Une fois que le PFA est dissous, porter la solution à un volume final de 100 ml. Stocker à 4 ° C pendant un mois. ATTENTION: Le PFA est un allergénique connue, cancérigènes et toxiques.
8. Préparer du tampon de blocage 1x par dilution de 5 ml de sérum de chèvre et de 500 ul de Triton X-100 dans 94,5 ml de PBS.
9. Préparer le tampon de lavage en diluant 1 x 500 ul de Triton X-100 dans 99,5 ml de PBS.

2. Alkali-Burn traitement des blessures et composé

1. Faire tremper un morceau rond de papier filtre, ~ 2 mm de diamètre, dans une solution de 1 M de NaOH.
2. Anesthésier les souris avec une injection de 100 mg / kg de kétamine et 5 mg / kg de xylazine, which est ~ 100 pi de cocktail anesthésie de l'étape 1.3 par 25 g souris. Anesthésie devrait prendre ~ 1-2 min à mettre po profondeur de l'anesthésie peut être déterminée en pinçant doucement la pointe ou de la queue de l'animal, si l'anesthésie est suffisante il devrait y avoir aucune réponse. Remarque: Il faut veiller à assurer la souris ne succombe pas à l'anesthésie hypothermie induite.
3. En utilisant une pipette, appliquer localement une baisse de 0,5% de chlorhydrate de proparacaïne à la surface de la cornée pour l'analgésie locale.
4. En utilisant des pinces stériles, ramasser un morceau de papier filtre imbibé NaOH. Si vous remarquez un excès de NaOH accroché à ou s'égoutte par le papier filtre, appuyez brièvement sur le papier filtre imbibé sur un morceau sec de papier filtre pour absorber l'excès. Placer le morceau de papier filtre imbibé de NaOH sur la cornée centrale. Laissez-le pendant 30 secondes pour produire un alcali-brûlure aiguë de ~ 2 x 2 mm ^{2 de} surface. Un microscope d'opération est utile pour placer correctement le papier filtre. Remarque: Seul un œil de la souris should se blesser avec l'autre servant de témoin.
5. Retirez le papier filtre. En utilisant une seringue de 10 ml, rincer doucement l'œil avec 10 ml de PBS 1x deux fois pour laver résiduelle NaOH 1.
6. Appliquer immédiatement une goutte de solution de travail 1x SAHA (ou un contrôle de véhicule constitué de PBS dilué DMSO contenant pas SAHA) par voie topique à la cornée. Répétez l'application 3 fois par jour pendant 14 jours. Remarque: au cours de cette période, un onguent antibiotique topique n'est pas recommandé car il peut interférer avec le développement de la blessure et la livraison du composé. Utilisez une solution antibiotique liquide, solution de gentamicine tels que de 3%, à la place.
7. Passez directement à l'évaluation clinique (protocole n ° 3 ci-dessous) ou de sacrifier la souris et énucléer les yeux pour la cornée montage plat (protocole n ° 4 ci-dessous) ou de la paraffine / histologie conventionnelle congelé.

3. Évaluation clinique

1. Procéder à un examen quotidien de la souris à l'aveugle sous un microscope chirurgical et marquer corneal NV basée sur l'opacité de la cornée, NV, et la taille du navire. Utiliser au moins deux observateurs, et enregistrer un résultat final qui est la moyenne des deux.
   1. Note opacité de la cornée sur une échelle de 0-4. 0 = pas du tout claires; 1 = légèrement brumeux, iris et la pupille facilement visible; 2 = légèrement opaques, iris et la pupille encore détectable; 3 = opaques, des élèves à peine détectables; et 4 = complètement opaques sans vue de l'élève.
   2. Note NV sur une échelle de 0-3. 0 = pas de néovaisseaux; 1 = néovaisseaux au limbe cornéen; 2 = néovaisseaux enjambant le limbe cornéen et s'approchent du centre de la cornée; 3 = néovaisseaux couvrant le centre de la cornée.
   3. Note taille du navire sur une échelle de 0-3. 0 = pas de néovaisseaux; 1 = néovaisseaux détectables au microscope chirurgical; 2 = néovaisseaux facilement vu sous microscope chirurgical; 3 = néovaisseaux facilement vus sans microscope.
2. L'utilisation d'un appareil photo numérique, prendre des images représentatives de l'œil à 7 jours et 14 jours.

4.Cornée coloration et supports plats

1. Corrigez les yeux énucléés dans 4% PFA pendant au moins 1 heure à 4 ° C.
2. Transfert à l'œil de 1x PBS et utiliser une pince pour retirer soigneusement l'excès de tissu.
3. Avec l'aide d'un microscope chirurgical, utiliser une aiguille (calibre 18) ou micro-couteau pour perforer la région péricornéenne de l'oeil (note: cela devrait libérer le fluide de l'oeil).
   1. De la perforation réalisée dans la section 4.3.1 en utilisant une paire de ciseaux chirurgicaux pour couper la partie antérieure de l'oeil (cornée) de la partie postérieure.
4. Transférer la cornée de retour dans 4% PFA pour la fixation nuit à 4 ° C.
5. Jeter la PFA 4% (ATTENTION: PFA est dangereux et doit être éliminé conformément à la réglementation institutionnels) et rincer la cornée trois fois avec PBS 1x pour enlever tout résidu PFA.
6. Incuber dans du tampon de blocage 1x pendant au moins 2 heures à la température ambiante pour perméabiliser le tissu et empêcher la liaison non spécifique de l'anticorps primaire.
   1. Appliquer un anticorps primaire dans un tampon de blocage 1x, à une dilution 100-500. (Par exemple de rat anti-souris-PECAM-1 pour détecter les vaisseaux sanguins à 1:100, de lapin anti-souris-LYVE-1 pour détecter des vaisseaux lymphatiques à 1:500, et / ou de rat anti-mouse-F4/80 pour détecter les macrophages à 1:100). Incuber à 4 ° C pendant une nuit.
   2. Laver six fois avec 1x tampon de lavage pendant 1 heure à chaque fois à la température ambiante pour éliminer totalement anticorps primaire non lié.
   3. Appliquer un anticorps secondaire en 1x tampon de blocage à une dilution 500-1000. (Par exemple, une lampe fluorescente de 488 nm marqué de chèvre anti-rat-IgG à 1:800 ou une lampe fluorescente de 594 nm marqué de chèvre anti-lapin IgG à 1:800). Incuber à 4 ° C pendant une nuit.
   4. Laver trois fois avec PBS 1x pendant 1 heure chacun à la température ambiante à supprimer complètement anticorps secondaire non lié.
7. Transférer la cornée en frais 1x PBS et, à l'aide d'un microscope chirurgical, faire attention quatre incisions de la périphérie vers le center. Cela devrait diviser la cornée en quatre quadrants de taille à peu près égale (la forme résultante devrait ressembler un peu comme un papillon) et lui permettre de reposer à plat sur une diapositive.
8. Monter avec un milieu approprié de montage pour l'imagerie de fluorescence. Pour de meilleurs résultats, les échantillons doivent être visualisés immédiatement et photographies numériques prises, mais peuvent être stockés pendant plusieurs semaines à l'abri de la lumière à 4 ° C.

Résultats

Après une blessure en milieu alcalin brûlure, NV cornéenne se produit dans un mode dépendant du temps prévisible. Figure 1 montre la différence rigide à la fois dans la néovascularisation et l'opacité de la cornée entre un animal non traité (figure 1A) et un animal traité avec l'inhibiteur de HDAC SAHA (Figure 1B ) au point de temps de 7 jours.

Les figures 2A et 2B montrent un support pla...

Discussion

Le protocole présenté ici résulte des niveaux reproductibles de hemangiogenesis, lymphangiogenèse, et l'inflammation, ce qui en fait un système idéal pour étudier ces trois processus interdépendants (). Bien que cette méthode produit NV cornée centralisée, plusieurs méthodes ont été développées pour provoquer plus dirigé NV, à savoir la suture de la cornée ¹⁷ et implantés facteur de croissance exprimer pastilles ^18, pourrait également être d'intérêt. Notre protocole ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe	BD	309659
18 G Needle	BD	305918
10 ml Syringe	BD	306575
25 G Needle	BD	305916
Anti-F4/80 (rat anti-mouse)	AbD Serotech	MCA497RT
Anti-LYVE-1 (rabbit anti-mouse)	Abcam	ab14917
Anti-PECAM-1 (rat anti-mouse)	BD	553370
Anti-IgG Alexa 488 (goat anti-rat)	Invitrogen	A11006
Anti-IgG Alexa 594 (goat anti-rabbit)	Invitrogen	A11012
Camera	Tucsen	TCC 5.0 ICE
Coverslips	Fisher	12-548-B
DMSO	Sigma	D4540-1L	Caution: Mutagenic, Toxic
Forceps (Blunt), Iris	WPI	15915
Forceps (Sharp), Dumont #4	WPI	500340
KCl	Fisher	P217-500
Ketamine Solution	MedVet	RXKETAMINE	Controlled substance, proper license required for use.
Light Source for Microscope	AmScope	LED-14M-YA
Microscope (Stereo 7X-45X)	AmScope	SM-1B
Mounting Medium, VECTASHIELD	Vector	H-1000
NaCl	Fisher	S271-10
NaH2PO4	Fisher	S397-500
NaOH	Fisher	S318-1	Caution: Corrosive
Paraformaldehyde		P6148-500G	Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic
Proparacaine Hydrochloride	Sigma	P4554-1G
Scissors (5 mm blade), Vanas	WPI	14003
Goat Serum	MPBio	92939249
Microscope Slides	Fisher	12-550-15
Triton X-100	Sigma	T8787-100ML
Whatman Grade 1 Filter Paper	Whatman	1001-6508
Xylazine Solution	MedVet	RXANASED-20