Nanofibres ECM de protéines et Utilisation de l'assemblage de la surface à l'initiative Nanostructures Engineered

Résumé

Procédé pour obtenir des nanofibres et des nanostructures complexes de protéines de matrice extracellulaire uniques ou multiples est décrite. Cette méthode utilise les interactions protéine-surface pour créer des matériaux à base de protéines sans date avec la composition accordable et de l'architecture pour une utilisation dans une variété d'applications d'ingénierie tissulaire et de la biotechnologie.

Résumé

La matrice extracellulaire (ECM) dans les tissus est synthétisée et assemblée par les cellules pour former un fibrillaire 3D, réseau de protéines étroitement régulé avec le diamètre des fibres, de la composition et son organisation. En plus de fournir un support structurel, dont les propriétés physiques et chimiques de l'ECM jouent un rôle important dans de multiples processus cellulaires, y compris l'adhérence, la différenciation et l'apoptose. In vivo, l'ECM est assemblé en exposant cryptique d'auto-assemblage (fibrillogenèse) des sites au sein de protéines . Ce processus varie pour des protéines différentes, mais la fibronectine (FN) fibrillogénèse est bien caractérisée et sert de système modèle pour l'ensemble de l'ECM à médiation cellulaire. Plus précisément, les cellules utilisent des récepteurs de l'intégrine sur la membrane des cellules pour se lier dimères FN et les forces contractiles actomyosine généré à déplier et exposer les sites de liaison pour l'assemblage sous forme de fibres insolubles. Ce processus médiée par le récepteur des cellules permet d'assembler et d'organiser l'ECM à partir du cellulaire à sca tissulaireles. Ici, nous présentons une méthode appelée surface initiative assemblage (SIA), qui récapitule assemblage de la matrice à médiation cellulaire utilisant des interactions protéine-surface à déplier protéines de la MEC et les assembler en fibres insolubles. Tout d'abord, les protéines de la MEC sont adsorbées sur un polydiméthylsiloxane hydrophobe (PDMS) de surface où ils dénaturent partiellement (dépliante) et exposent domaines de liaison cryptiques. Les protéines dépliées sont ensuite transférés dans bien définis micro-et nanomotifs grâce à l'impression par microcontact sur un poly sensible à la chaleur (N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) surface. Dissolution thermique déclenché de la PIPAAm conduit à l'assemblage final et la libération de protéines insolubles nanofibres de ECM et nanostructures avec des géométries bien définies. Architectures complexes sont possibles en ingénierie défini motifs sur les PDMS cachets utilisés pour l'impression par microcontact. En plus de FN, le processus SIA peut être utilisé avec la laminine, le fibrinogène et les collagènes de type I et IV de créer plusieurs composants ECM nanostructurestures. Ainsi, SIA peut être utilisé pour fabriquer des matériaux à base de protéines ECM avec un contrôle précis de la composition des protéines, la géométrie de la fibre et de l'architecture de l'échafaudage pour récapituler la structure et la composition de la MEC in vivo.

Introduction

La matrice extracellulaire (ECM) dans les tissus est composée de protéines multifonctionnelles impliquées dans la régulation physique et chimique des processus cellulaires multiples, y compris l'adhérence, la prolifération, la différenciation, l'apoptose et ^3.1. L'ECM est synthétisé, assemblé, et organisée par les cellules et les fibrilles protéiques constitutifs ont des compositions uniques, la taille des fibres, des géométries et des architectures interconnectés qui varient selon le type de tissu et le stade de développement. Des travaux récents ont montré que l'ECM peut fournir des indices instructifs pour guider les cellules pour former des tissus modifiés ^4, ce qui suggère que récapitulant l'ECM en termes de composition et de la structure pourrait permettre le développement de matériaux biomimétiques pour des applications de génie tissulaire et de la biotechnologie.

Un certain nombre de méthodes de fabrication ont été développés pour concevoir des échafaudages polymères qui peuvent imiter les aspects de l'ECM dans les tissus. Par exemple, électrofilature et la phase separation ont démontré à la fois la capacité de former des matrices poreuses de fibres avec des diamètres allant de quelques dizaines de micromètres à plusieurs dizaines de duvet ^5-7 nanomètres. Les deux techniques ont également montré que des matrices très poreuses de nanofibres peuvent supporter l'adhérence cellulaire et l'infiltration dans l'échafaud ^8. Cependant, ces approches sont limitées dans les géométries possibles de fibres, les orientations et les architectures 3D qui peuvent être créés. Électrofilage produit typiquement échafaudages avec des fibres orientées de façon aléatoire soit ou très alignés tandis que la séparation de phase produit échafaudages avec des fibres orientées de façon aléatoire. Il existe aussi des limitations concernant les matériaux, typiquement avec des chercheurs utilisant des polymères synthétiques, tels que le poly (ε-caprolactone) ⁸ et le poly (acide lactique-co-glycolique) ^9, qui sont ensuite revêtu avec des protéines de la MEC pour favoriser l'adhérence cellulaire. Biopolymères naturels sont également utilisés, y compris le collagène de type I ^{10, 11} de la gélatine, du fibrinogène ^12,chitosane ¹³ et ¹⁴ soie, mais ne représentent qu'une petite partie des protéines trouvées dans le tissu natif. La plupart des tissus contiennent un plus grand milieu de protéines et de polysaccharides y compris la MEC de la fibronectine (FN), la laminine (LN), le collagène de type IV et d'acide hyaluronique qui sont difficiles ou impossibles à fabriquer des nanofibres en utilisant des procédés existants.

Pour relever ce défi, nous avons concentré nos efforts de recherche sur imitant la façon dont les cellules synthétisent, former et organiser des fibrilles de protéines ECM dans leur environnement. Alors que le processus de fibrillogénèse spécifique varie pour différentes protéines de la MEC, typiquement un changement conformationnel dans la molécule de protéine d'ECM est déclenchée par une interaction enzymatique ou médiée par les récepteurs, ce qui expose des sites cryptiques d'auto-assemblage. Ici, nous utilisons FN comme un système modèle pour mieux comprendre le processus de fibrillogenèse. Brièvement, des homodimères FN se lient à des récepteurs d'intégrine sur la surface cellulaire par l'intermédiaire de la séquence d'acides aminés RGD dans le 10 type IIJe le répète unité. Une fois lié, les intégrines s'écartent par actomyosin contraction et se déroulent les dimères FN pour exposer les sites d'auto-assemblage cryptiques. L'exposition de ces sites de liaison FN-FN permet aux dimères FN à assembler en un fibrilles insolubles à droite sur la surface de la cellule ^15. Travail dans les systèmes sans cellules a démontré que les sites de liaison FN-FN cryptiques peuvent être révélées par dépliage utilisant dénaturants ¹⁶ ou tension de surface à un-liquide-solide sur l'interface radio ^17-19. Cependant, les fibres FN créés par ces techniques sont limitées à des tailles et géométries de fibres spécifiques et sont généralement liés à une surface.

Nous décrivons ici un appelé ensemble de la surface à l'initiative approche (SIA) ²⁰ qui surmonte ces limitations en utilisant des interactions protéine-surface pour créer de libre-debout nanofibres insolubles, nanofabrics (feuilles 2D) et d'autres nanostructures composées de protéines de la MEC simples ou multiples (figure 1 ). Dans cette process, protéines de la MEC sont adsorbées à partir, une conformation globulaire compact en solution et partiellement dénaturé (déplié) sur un polydiméthylsiloxane hydrophobe (PDMS) des motifs timbre. Les protéines de la MEC sont ensuite transférés dans cet état ​​sur ​​un poly sensible à la chaleur (N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) surface par microcontact impression ^22. Lorsqu'il est hydraté avec 40 ° C de l'eau au PIPAAm reste d'un solide, mais lorsqu'il est refroidi à 32 ° C, il passe par une température de solution critique inférieure (LCST) où elle devient hydrophile, gonflant à l'eau puis se dissout, libérant les nanostructures ECM assemblés hors de la surface. La méthode SIA permet de contrôler les dimensions avec une précision nanométrique. En contrôlant les paramètres clés tels que la composition, la géométrie de la fibre, et de l'architecture, il est possible de récapituler nombreuses propriétés de l'ECM trouvés in vivo et de développer des échafaudages avancés pour des applications de génie tissulaire et de la biotechnologie.

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Protocole

1. Fabrication de moule Master en utilisant la photolithographie

1. Les nanofibres de protéines ECM, nanofabrics et nanostructures à être fabriqués sont d'abord conçus à l'aide Conception Assistée par Ordinateur (CAO). Ce fichier CAO est ensuite transféré à un photomasque. Le type de photomasque dépendra de la résolution des caractéristiques; avec un masque photographique basée sur la transparence adéquate pour fonction de tailles jusqu'à ~ 10 um. Caractéristiques petits <10 um, il faudra un chrome sur masque à verre. Toutes les nanofibres et nanostructures présentées ici ont été fabriqués en utilisant un masque photographique basée sur la transparence, et donc étaient à l'échelle nanométrique d'épaisseur, mais pas les dimensions latérales.
   Remarque: Il est important de distinguer les régions du photomasque seront sombres (empêcher la lumière UV de passer à travers) et qui sera transparent (permettre à la lumière UV de passer à travers) comme cela, avec le type de résine photosensible (positive ou négative) , déterminera la topographie finale du moule maître.
2. Pour commencer la fabrication du moule maître, déshydrater une plaquette 4 "de silicium en le plaçant sur une plaque chauffante réglée sur 150 ° C pendant 15 min.
3. Centrez la plaquette sur le mandrin à vide d'un spin-coater. Verser SU8-2015 résine photosensible négative sur le milieu de la plaquette et poursuivre la coulée en cercles concentriques jusqu'à environ deux tiers de la plaquette est recouverte.
   Remarque: Conservez la bouteille de SU8 près de la plaquette lors de la coulée de minimiser la formation de bulles.
4. Programmer le spincoater comme suit:
   • cycle de propagation: 500 tours par minute avec une accélération de 100 tr / s pendant 10 s.
   • le cycle d'essorage: 4000 tours par minute avec une accélération de 100 tr / sec pendant 30 sec.
   Remarque: cette recette de spincoating formera une couche de résine photosensible qui est de ~ 10 um d'épaisseur. En changeant la vitesse de filage ou de la formulation SU8, l'épaisseur peut être ajustée.
5. Doux cuire la galette en le plaçant sur une plaque chauffante réglée sur 95 ° C pendant 3 min.
6. Exposer la plaquette avec une lumière UV à traversle photomasque pour une dose totale de 140 mJ / cm ^2.
   Remarque: SU8 est une résine photosensible négative donc les régions où la lumière UV est capable de passer à travers le photomasque resteront après le développement et devenir des éléments en relief sur le moule de maître.
7. Post-exposition cuire la galette en le plaçant sur une plaque de cuisson réglé sur 95 ° C pendant 4 min.
8. Développer la plaquette en la plaçant dans un révélateur SU8 pendant 3 min. Après 3 min, rincer la plaquette avec de l'alcool isopropylique. Si un film blanc est produit lors du rinçage, la plaque n'est pas complètement développée et il doit être placé en arrière dans le révélateur pendant 30 sec. Rincer à nouveau avec de l'alcool isopropylique. Répétez ce processus jusqu'à ce que un film blanc ne fait pas lors du rinçage de l'alcool isopropylique.
9. Sécher la plaque dans un courant d'azote et les placer dans une boîte de Pétri de 150 mm à l'abri de la poussière.

2. Faire les PDMS Timbres

1. Préparer le prépolymère PDMS en combinant la base d'élastomère et d'agent de durcissement dans un10:1 w / w. Généralement on utilise 80 g de base et 8 g d'agent de durcissement pour s'assurer qu'il est PDMS suffisants pour couvrir le moule maître dans une couche de 1 cm d'épaisseur.
2. Mélanger et dégazer les PDMS en utilisant un mélangeur centripète défini comme suit:
   • Mélanger: 2000 rpm pendant 2 min
   • Degas: 2000 rpm pendant 2 min.
3. Si un mélangeur est indisponible mélanger les PDMS à la main pendant 10 min en utilisant une pipette sérologique de 10 ml. Dégazer le mélange en le plaçant dans un dessicateur sous vide pendant 30 min pour éliminer les bulles.
4. Verser suffisamment prépolymère PDMS sur le moule maître (pastille de silicium à motifs) pour former une couche de 1 cm d'épaisseur. Guérir les PDMS par cuisson à 65 ° C pendant 4 heures ou à température ambiante pendant 48 heures.
5. Une fois durci, Les régions contenant les motifs peuvent être découpées pour former les timbres PDMS. Pour distinguer le côté caractéristique de l'arrière du timbre de PDMS, une entaille sur l'un des coins sur le dos du timbre.

3. Microcontact PrInting de modèles ECM

1. Nettoyer les lamelles de verre de 25 mm de diamètre par ultrasons dans 95% d'éthanol pendant 1 heure et puis sécher dans un four à 65 ° C.
2. Préparer la solution en dissolvant PIPAAm PIPAAm dans le 1-butanol à une concentration de 10% (en poids / volume, typiquement 1 g dans 10 ml).
3. Centrer une lamelle de verre sur le mandrin à vide et des spincoater pipette 200 ul de la solution PIPAAm sorte que la surface du verre est recouverte.
4. Spincoat la lamelle à 6000 rpm pendant 1 min.
5. Nettoyez les timbres PDMS par sonication dans 50% d'éthanol pendant 30 min, puis sec sous un courant d'azote.
   Remarque: Séchage et les étapes ultérieures doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique pour maintenir la stérilité pour les applications où les nanostructures ECM seront utilisés avec des cellules.
6. Manteau de la surface à motif de chaque timbre PDMS avec 200 pi de la solution de protéines, généralement de 50 pg / ml dans l'eau distillée stérile pour FN. Incuber pendant 1 heure à température ambiante.
   Remarque: Th.est le revêtement de volume est un timbre PDMS 1,5 cm ² et devra être ajustée en fonction de la taille du tampon de PDMS, la protéine d'ECM utilisés et la concentration de la protéine en solution ECM.
7. Laver les timbres PDMS dans l'eau distillée pour enlever l'excès de protéines et de sécher sous un courant d'azote.
   Remarque: l 'eau restant sur le timbre va déclencher la dissolution prématurée du revêtement PIPAAm sur la lamelle et empêcher le transfert correct de la protéine.
8. Pour la fabrication aseptique, placer les lamelles PIPAAm enrobés dans une boîte de Pétri fermée et stériliser en utilisant l'exposition aux UV, 45 min sous la lumière UV dans une enceinte de sécurité biologique est suffisante. Si la stérilité n'est pas nécessaire, cette étape peut être omise.
9. Effectuer l'impression par microcontact en plaçant du côté de la caractéristique de la marque PDMS en contact avec la lamelle PIPAAm-enduit. Si nécessaire, utilisez une pince à taper légèrement sur le dos des timbres pour éliminer les bulles d'air et assurer un contact uniforme.
10. Après 5 kmn, décoller le timbre de PDMS de la lamelle.
11. A ce stade, les protéines de la MEC supplémentaires peuvent être modelé pour créer des structures plus complexes et à multi-composants. Jusqu'à 3 impressions ont été vérifiées à travailler avec ce processus, et plus peut-être possible.

4. Sortie de l'ECM nanofibres et Nanostructures

1. Placez le PIPAAm lamelle enduit modelé dans une boîte de Pétri de 35 mm et d'inspecter la fidélité du motif en utilisant la microscopie à contraste de phase. Selon le modèle, une caméra CCD peut être nécessaire de régler les caractéristiques de la forme. La microscopie à fluorescence peut également être utilisé pour inspecter le motif à condition que les protéines de la MEC sont marqués par fluorescence.
2. Ajouter 3 ml d'eau distillée à 40 ° C à la boîte de Pétri et laisser l'eau refroidir progressivement.
3. La dissolution de la couche PIPAAm et la libération des motifs de protéines d'ECM peuvent être surveillés en utilisant la microscopie à contraste de phase. Si l'application ne permet pas l'utilisation de tec optiquehniques, la libération peut être contrôlée en mesurant la température de la solution. Typiquement, l'eau est refroidie à la température ambiante, bien en dessous de la LCST du PIPAAm (32 ° C), afin d'assurer les nanostructures de protéines d'ECM ont été libérés.
4. Après la libération, les nanofibres, nanofabrics et autres nanostructures flottent dans l'eau. Pour les utiliser pour d'autres applications dont ils ont besoin pour être manipulé. La méthode exacte dépendra de l'objectif expérimental et peut comprendre des étapes telles que l'immobilisation sur une autre surface, le déplacement d'un système de micromanipulateur ou enrobage dans un hydrogel.

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Résultats

SIA est capable de ECM d'ingénierie nanofibres de protéines avec un contrôle précis sur les dimensions des fibres. Pour le démontrer, des tableaux de nanofibres FN avec des dimensions planes de 50 x 20 um ont été modelés sur une lamelle enduit PIPAAm (figure 2A). Lors de la libération, les fibres contractées parce qu'ils étaient sous une pré-stress inhérent quand modelé sur la surface PIPAAm (figure 2B). Analyse des nanofibres FN a révélé qu'ils étaient pr?...

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Discussion

La méthode présentée ici SIA imite assemblage de la matrice à médiation cellulaire et permet l'ingénierie des ECM nanofibres de protéines et de nanostructures avec la taille accordable, l'organisation et la composition. Bien que n'étant pas identique à ECM généré cellulaire, SIA crée ECM composée de fibrilles protéiques nanométriques ²⁰ qui subissent pliage réversible / dépliage pendant contrainte mécanique ²¹ et peuvent se lier les cellules ^20. Ceci permet...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm	Polysciences	21458-10	40,000 Mw
Sylgard 184 Silicone kit (PDMS)	Dow Corning		Mix 10 parts base with 1 part curing agent.
Butanol
Fibronectin	BD biosciences	354008	Human, 1mg
Laminin	BD biosciences	354239	Ultrapure, mouse, 1mg
Negative Photoresist	Microchem	SU8-2015
SU8 Developer	Microchem
Sonicator Branson M3510	Branson Ultrasonic Corporation	CPN-952-318
Thinky ARE-250 Mixer	Thinky Corporation
Spincoater	Specialty Coating Systems	G3P-8
Glass cover 25mm diameter, No 1.5	Fisher Scientific	12-545-86