Analyser craniofaciale morphogenèse chez le poisson zèbre Utilisation de 4D microscopie confocale

Résumé

Time-lapse imagerie confocale est une technique puissante utiles pour caractériser le développement embryonnaire. Ici, nous décrivons la méthodologie et de caractériser la morphogenèse craniofaciale dans le type sauvage, ainsi que PDGFRA, Smad5, et SMO embryons mutants.

Résumé

Imagerie time-lapse est une technique qui permet l'observation directe du processus de morphogenèse, ou la génération de forme. En raison de leur clarté optique et la susceptibilité à la manipulation génétique, la embryon de poisson zèbre est devenu un organisme modèle populaire avec laquelle effectuer l'analyse time-lapse de la morphogenèse des embryons vivants. L'imagerie confocale d'un embryon de poisson zèbre direct requiert qu'un tissu d'intérêt est constamment marqué avec un marqueur fluorescent, comme un transgène ou d'un colorant injecté. Le processus exige que l'embryon est anesthésié et maintenu en place de manière à ce que le développement sain se déroule normalement. Paramètres pour l'imagerie doivent être définis pour tenir compte de la croissance en trois dimensions et à concilier les exigences de la résolution des cellules individuelles tout en obtenant des clichés de développement. Nos résultats démontrent la possibilité d'effectuer à long terme dans l'imagerie in vivo d'embryons de poisson zèbre de marquées par fluorescence et de détecter des comportements de tissus variés dansla crête neurale crânienne qui causent des anomalies cranio-faciales. Les retards de développement causés par l'anesthésie et le montage sont minimes, et les embryons sont sains et saufs par le processus. Embryons Time-lapse imagées peuvent être retournés pour un milieu liquide et ensuite imagés ou fixés à des points plus tard dans le développement. Avec une abondance croissante des lignes de poisson zèbre transgénique et cartographie sort bien caractérisé et techniques de transplantation, imagerie n'importe quel tissu désiré est possible. En tant que tel, time-lapse imagerie in vivo combine puissamment avec des méthodes génétiques de poisson zèbre, y compris les analyses des embryons mutants et micro-injection.

Introduction

Morphogenèse craniofaciale est un processus multi-étapes complexe qui nécessite des interactions coordonnées entre plusieurs types de cellules. La majorité du squelette cranio-facial est dérivé de cellules de la crête neurale, dont beaucoup doivent migrer du tube neural dorsal dans des structures appelées transitoires arcs branchiaux ^1. Comme avec de nombreux tissus, la morphogenèse du squelette cranio-facial est plus complexe que ce qui peut être compris par des images statiques d'embryons à des points spécifiques de temps de développement. Bien que cela prend beaucoup de temps pour réaliser, in vivo microscopie time-lapse donnent un aspect continu à des cellules et des tissus d'un embryon en développement. Chaque image dans une série time-lapse prête contexte aux autres, et permet un mouvement d'enquêteur vers déduire pourquoi un phénomène se produit plutôt que de déduire ce qui se passe à ce moment-là.

L'imagerie in vivo est donc un outil descriptif puissant pour des approches expérimentales dedéconstruire les voies qui guident la morphogenèse. Le Danio rerio est un modèle génétique populaire du développement embryonnaire des vertébrés, et est particulièrement bien adapté pour l'imagerie in vivo de la morphogenèse. Moderne, des méthodes pratiques pour la transgenèse et la modification génomique sont progressent rapidement le nombre d'outils disponibles pour les chercheurs de poisson zèbre. Ces outils améliorent les méthodes déjà robustes pour la manipulation génétique et la microscopie. L'imagerie in vivo de presque n'importe quel tissu dans presque n'importe quel contexte génétique désiré est plus proche de la réalité que l'imagination.

Mouvements morphogénétiques des arcs branchiaux sont guidés par les interactions entre la crête neurale et l'épithélium adjacent, à la fois l'ectoderme et l'endoderme de signalisation. Il existe de nombreuses molécules de signalisation exprimés par l'épithélium qui sont nécessaires pour conduire la morphogenèse des éléments du squelette cranio-faciales. Parmi ces molécules de signalisation, Sonic Hedgehog (Shh) est d'une importance cruciale fou développement cranio-facial ^2-8. Shh est exprimé à la fois par l'ectoderme bouche et du pharynx endoderme ^2,6,9,10. L'expression de Shh dans l'endoderme régule les mouvements morphogénétiques des arceaux ^10, la structuration de la crête neurale dans les arches ^10, et la croissance du squelette cranio-facial ^11.

Signalisation BMP est également d'une importance cruciale pour le développement cranio-facial ¹² et peut modifier la morphogenèse des arcs branchiaux. Signalisation de la Bmp régule dorsale / ventrale structuration de crête dans les arcs branchiaux ^13,14. Perturbation des Smad5 chez le poisson zèbre provoque des malformations graves palatines et un échec des cartilages de Meckel à fusionner de manière appropriée à la ligne médiane ^15. En outre, les mutants présentent également des réductions et de la fusion des éléments du cartilage ventrale, avec le 2 ^ème, 3 ^ème et 4 ^ème éléments parfois pharyngée arc soudés à la ligne médiane ¹⁵. Ces fusions suggèrent fortement que la signalisation BMP dirige la morphogenèse de ces éléments du pharynx.

Signalisation PDGF est nécessaire pour le développement cranio-facial, mais a des rôles inconnus en arc branchial morphogenèse. La souris et le poisson zèbre ont mutants PDGFRA profonde clefting midfacial ^16-18. Au moins chez le poisson zèbre ce clefting midfacial est due à un échec de la migration des cellules de la crête neurale bon ^16. Cellules de la crête neurale continuent d'exprimer PDGFRA après qu'ils ont pénétré dans les arcs branchiaux. En outre, les ligands de PDGF sont exprimés par l'épithélium du visage et dans les arcs branchiaux ^16,19,20, ainsi signalisation Pdgf pourraient également jouer un rôle dans la morphogenèse des arcs pharyngiens après la migration. Toutefois, les analyses de la morphogenèse des arcs pharyngiens dans des mutants de PDGFRA n'ont pas été effectuées.

Ici, nous démontrons dans la microscopie confocale in vivo de pharyngulune étape de poisson zèbre transgénique et décrire la morphogenèse des arcs pharyngiens dans ce délai. Nous démontrons en outre les comportements de tissus qui sont touchés par des mutations qui perturbent le BMP, le PDGF, et les voies de signalisation de Shh.

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Protocole

Une. Elevage et Mutant allèles

1. Élever du poisson zèbre comme décrit ^21.
2. Allèles mutants de poisson zèbre utilisés dans cette étude étaient PDGFRA ^{b1059 16, B1100} Smad5 ^22, et SMO ^{b577 23.} Sources de ces souches de poisson zèbre comprennent ZIRC.

2. Préparation des solutions et met en œuvre

Remarque: Toutes les solutions et les outils peuvent être faites à l'avance et stockés pour une utilisation future.

1. Sensibiliser les médias de l'embryon (EM) comme décrit précédemment ^21.
2. Faire 4 g / L MS-222 (Tricaine). Dissoudre 4 g de phosphate disodique (Na ₂ HPO ₄₎ dans 450 ml d'eau stérile. Ajouter 2 g de MS-222 à la solution. Ajuster le pH à l'intérieur de 7,0 à 7,2. Ajouter de l'eau stérile pour obtenir un volume total de 500 ml.
3. Facultatif: Faire 4 g / L d'huile de clou de girofle. Peser 0,2 g de l'huile de girofle pure dans un tube conique de 50 ml. Ajouter EM pour un volume total de 50 ml. Stocker à 4 ° C.
4. Faire 3% methylcellulose. Apportez 50 ml de EM + 0,1 M HEPES à ébullition. Retirer du feu. Incorporer 1,5 g méthylcellulose jusqu'à ce que la solution est homogène. Stocker à 4 ° C.
5. Faire 0,2% d'agarose. Ajouter 0,1 g d'agarose à 50 ml EM. EM apporter à ébullition dans le four micro-ondes ou sur une plaque chauffante et de vérifier que l'agarose soit dissous. Aliquote dans 500 volumes ul dans des microtubes et conserver à 4 ° C. Remarque: Les volumes peuvent être ajustés au besoin.
6. Assurez-pokers capillaires. Déposer une goutte de super glue intérieur d'un tube capillaire 0,9 mm d'identité. Insérez une longueur de 4-5 cm de 6 ligne de pêche monofilament de livres test à l'intérieur du tube capillaire de telle sorte que d'environ 3-4 mm de la ligne s'étend au-delà de la fin du tube.
7. Faire deux lamelles pontés par spécimen. Super-colle 22 x 22-1 couvercle verre à chaque extrémité d'un couvercle en verre 24 x 60-1 quitter le milieu libre. Faire simple (1 petit verre de couverture par la fin) pour les embryons de moins d'un jour vieux, double (deux petits verres de couverture sur le dessus de l'autre par la fin) pour les embryons de une à quatre days vieux, ou triples (3 petits verres de couverture sur le dessus de l'autre par la fin) pour les embryons de cinq jours ou plus âgés.
8. Remplir une seringue de 10 ml avec de la graisse à vide élevé. Remarque: de la graisse à vide sert de matériau d'étanchéité pour prévenir la déshydratation des échantillons sur de longues périodes de temps, et a une faible toxicité potentielle par rapport à des produits d'étanchéité plus volatils.

3. Montage embryons de poisson zèbre pour la microscopie confocale (voir la figure 1)

1. Préparer milieu anesthésique. Faire fondre une aliquote de 0,2% d'agarose par micro-ondes dans toutes les 20 secondes jusqu'à ce que complètement liquide. Mélanger 8 pi de MS-222 dans 192 ul de 0,2% d'agarose ou de 5 pi de 4 g / L de l'essence de girofle dans 195 ul de 0,2% d'agarose. Maintenir dans un bloc de chauffage à 42 ° C. Remarque: Une longue exposition au MS-222 provoque des retards de développement plus fort que l'huile de clou de girofle fait chez le poisson zèbre embryonnaire ^24.
2. Si nécessaire: dechorionate manuellement embryons transgéniques non éclos à analyser juste avant l'analyse. En utilisant des pinces, lentement tear le chorion ouvert jusqu'à l'embryon est libéré.
3. Anesthésier les embryons de poisson zèbre. Ajouter 1 ml d'une 4 g / L stock de MS-222 24 ml de médias de l'embryon. Sinon, ajouter 390 ul de 4 g / L d'huile de clou de girofle pour 24 ml d'eau du poisson ^24. Remarque: les actes de l'huile de girofle lentement pour effectuer cette étape au moins 15-20 minutes avant la microscopie time-lapse.
4. Placer un cordon de graisse à vide autour de l'espace central d'une lamelle couvre-ponté orientée vers le haut. Pousser lentement la graisse à vide hors de la seringue, ce qui rend, d'un cordon lisse continue qui est adjacent à et à l'intérieur des ponts et le bord de la lamelle.
5. Etaler un cercle de 4% de méthylcellulose dans le milieu de la lamelle couvre-objet en utilisant un applicateur à pont en bois.
6. Transférer l'embryon à imager. Lorsque l'embryon est anesthésié tirer vers le haut dans une pipette en verre. Maintenir la pipette à la verticale afin de permettre à l'embryon de couler au fond du liquide dans la pipette. Déplacer la pipette dans la solution d'agarose et permettre à l'embryon de tomberdans l'agarose. Ne pas expulser le liquide.
7. Placer l'échantillon. Dessiner une partie de la solution d'agarose et l'embryon dans la pipette. Expulser l'embryon dans une goutte de solution d'agarose sur le dessus de la méthylcellulose. Utilisez un tisonnier capillaire pour pousser l'embryon à la baisse sur la méthylcellulose et orienter l'embryon comme on le souhaite pour l'imagerie.
8. Sceller l'échantillon.
   1. Placez une lamelle pont au-dessus d'une montée, vers le bas. Appliquer une pression uniforme sur les deux côtés des lamelles en sandwich jusqu'à ce que les ponts sont en contact direct et les joints d'abandon agarose à deux lamelles. Vérifiez que l'embryon est correctement orienté.
   2. Frottez un applicateur en bois le long de la vitre pour lisser les fissures et les lacunes dans le bourrelet de graisse à vide. Essuyez l'excès de graisse à partir des bords.

4. Time-lapse imagerie confocale de poisson zèbre transgénique embryons

(Ce protocole a été optimisé pour un Zeiss LSM 710 microscope confocal nousment logiciel d'imagerie ZEN, et peuvent être modifiés pour être utilisés avec d'autres systèmes.)

1. Activer équipement. Allumez le microscope confocal et des dispositifs laser externes. Allumer l'ordinateur connecté au microscope confocal. Logiciel d'imagerie confocale Open et sélectionnez "Système Start" pour activer les commandes d'acquisition d'image.
2. Préparer stade chauffé. Abaissez la plate-forme de mise en scène du microscope confocal et déplacer les lentilles de l'objectif hors de position. Remplacer la scène par défaut avec une scène électronique chauffée. Allumez le contrôleur de la platine chauffante et régler la température de 29,5 ° C.
3. Placer l'échantillon dans le champ de vision. Placer l'échantillon montés sur la scène. Déplacez la lentille de l'objectif 20X en position et soulever la plate-forme de mise en scène. Activer l'émetteur de lumière visible et de regarder à travers les oculaires. Centrer la tête de l'embryon dans le champ de vision.
4. Définir les paramètres du test.
   1. Activer les canaux de fluorescence en sélectionnantla longueur d'onde de fluorescence à détecter et choisissez tables des couleurs (LUT) pour chaque canal. Si nécessaire, utiliser les commandes manuelles dans le logiciel pour activer les lasers nécessaires (par exemple 561 nm pour DP). Pour chaque canal de fluorescence, réglez l'intensité du laser à 10,0 et la tension photomultiplicateur (HV ou le gain) entre 600-700. Réglez le calcul de la moyenne de quatre et la profondeur de bits à 16 bits.
   2. Activer les modules de la série Z-stack et time. Réglez le trou pour un Z-résolution 5 pm ou moins, et définir le Z-intervalle à la distance optimale suggéré.
      Remarque: En général, 5 um Z-résolution permet chaque image Z-stack à collecter assez rapidement pour un «instantané» de l'embryon à un point de temps particulier, tout en la résolution des cellules individuelles. L'abaissement de la moyenne réduit également la quantité de temps par image.
   3. Définir l'intervalle de temps désiré entre les images (généralement 10 à 20 mn) et la durée totale de l'expérience.
5. Définir positioninformation.
   1. Mettez l'appareil photo en mode direct. Réglez la mise et augmenter l'intensité laser si nécessaire pour voir fluorescence. Réglez le zoom numérique à 0,6 pour une vue plus large, si désiré.
   2. Placez la scène de telle sorte que toutes les structures d'intérêt sont visibles et il ya de la place dans le champ de vision pour le dos prolongement et en avant. Concentrer l'embryon à travers les limites supérieure et inférieure de la fluorescence. Définissez les première et dernière positions Z-stack tranche d'au moins 100 um ou plus au-delà de ces limites.
6. Optimiser l'intensité de la fluorescence.
   1. Réglez le LUT d'affichage à aller indicateur. Structures fluorescentes doivent maintenant apparaissent en blanc, et le reste du champ de vision doivent être bleues (pas de détection) ou noir.
   2. Augmenter HT / le gain à un niveau juste en dessous saturé (rouge) pixels apparaissent. Si nécessaire, régler le décalage si une majorité de l'arrière-plan n'est pas détecté (bleu). Remarque: diamètre du trou microscopique petit et augmentation de l'intensité du laser à la fois d'améliorer l'image defnition, mais intensité du laser doit être faible pour préserver les tissus vivants. Augmentation HT / gain et diamètre du trou microscopique (<5 um) sont généralement préférable d'augmentation de l'intensité du laser.
   3. Gardez le diamètre de trou d'épingle assez large pour recueillir des images en temps opportun, la moyenne des jeux à 4. Le Z-intervalle doit toujours être réglé à la distance optimale suggérée pour le diamètre de trou d'épingle. Effectuer des analyses de courte durée (moyenne = 1) avec des paramètres différents, et d'utiliser l'intensité du laser minimum qui permet d'atteindre la résolution désirée.
7. Exécutez l'expérience pour la durée souhaitée. Ensuite, retirez embryon du stade chauffée et séparer lentement les lamelles. Immerger la lamelle et l'embryon dans EM dans une boîte de Pétri de 30 mm. En utilisant une pipette en verre laver doucement l'embryon hors de la lamelle et enlever la lamelle de la boîte de Pétri. Placez l'embryon dans un incubateur à 28,5 ° C pour continuer à se développer.
8. Comparer la croissance. A la fin de l'expérience, prendre individu Zsimages de selleries d'embryons de frères agarose monté qui ont été mis en scène de manière similaire à l'échantillon au début de l'expérience, mais ont été soulevées dans EM dans un incubateur à 28,5 ° C.
9. Mesurer arcs pharyngiens, au besoin. Les mesures peuvent être effectuées dans certaines suites logicielles confocale. Mesures trouvés ici ont été réalisées à l'aide Fiji25 par l'importation et Z saillie fichiers. LSM de cadres individuels.

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Résultats

Chez les embryons de type sauvage, à la suite de neurones population de crête, les arcs pharyngiens allongés le long des antérieure / postérieure et dorsale / ventrale axes tout en se déplaçant dans une direction rostrale (Film 1). 30 heures après la fécondation (HPF), la longueur antérieure / postérieure du premier arc pharyngien est comprise entre 1.8 à 1.9 fois sa dorsale / ventrale hauteur. Dorsale / ventrale allongement procède régulièrement, plus rapide que l'extension antérieu...

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Discussion

Time-lapse microscopie confocale est un outil puissant pour l'analyse du développement. Ici, nous démontrons l'utilité de la méthode dans l'étude de la morphogenèse arc branchial chez le poisson zèbre qui sont mutantes pour voies de signalisation importantes en utilisant un transgéniques qui marque les cellules de la crête neurale. En plus du niveau des tissus analyses, des analyses de déchéance de temps sont également applicables à des analyses à l'échelle cellulaire ^28. De nom...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 lb Test monofilament line	Cortland Line Company	SLB16
Agarose I	Amresco	0710
Argon laser	LASOS Lasertechnik GmbH	LGN 3001
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C8106
Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID	FHC	30-31-0
Clove oil	Hilltech Canada, Inc.	HB-102
High vacuum grease	Dow Corning	2021846-0807
Isotemp dry-bath incubator	Fisher Scientific	2050FS
Laser scanning microscope	Carl Zeiss AG	LSM 710
Magnesium sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Microscope cover glass, 22 x 22-1	Fisher Scientific	12-542-B
Microscope cover glass, 24 x 60-1	Fisher Scientific	12-545-M
Potassium chloride	Fisher Scientific	M-11321
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	P3786
Sodium chloride	Fisher Scientific	M-11624
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S7907
TempController 2000-2	PeCon GmbH
Tricaine-S	Western Chemical, Inc.