Synthèse d'une protéine artificielle induite par une intéine Hydrogel

Résumé

Nous présentons la synthèse d'un hydrogel split-induite par une intéine de protéines. Les éléments constitutifs de cet hydrogel sont deux copolymères de protéines contenant chacun une sous-unité d'une protéine trimérique qui sert d'agent de réticulation et une moitié d'une intéine dissociée. Le mélange des deux copolymères de protéine déclenche une réaction de trans-épissage d'intéine, ce qui donne une unité de polypeptide qui s'auto-assemble en un hydrogel. Cet hydrogel est très stable au pH et à la température, compatible avec des solvants organiques, et incorpore facilement les protéines globulaires fonctionnels.

Résumé

Nous présentons la synthèse d'un hydrogel de protéine hautement stable à médiation par une réaction de trans-épissage d'intéine divisée catalysée par la protéine. Les éléments constitutifs de cet hydrogel sont deux copolymères à blocs de protéines contenant chacun une sous-unité d'une protéine trimérique qui sert d'agent de réticulation et une moitié d'une intéine dissociée. Un enroulement aléatoire hautement hydrophile est insérée dans l'un des copolymères séquences pour la rétention d'eau. Le mélange des deux copolymères séquences de la protéine déclenche une réaction de trans-épissage d'intéine, ce qui donne une unité de polypeptide avec des agents de réticulation à chaque extrémité qui rapidement s'auto-assemble en un hydrogel. Cet hydrogel est très stable dans les conditions acides et basiques, à des températures allant jusqu'à 50 ° C, et dans des solvants organiques. L'hydrogel rapidement des réformes après la rupture due au cisaillement. Constitution d'une "station d'accueil peptide" dans le bloc de construction d'hydrogel permet l'incorporation pratique de «protéine d'accueil" marqués protéines cibles.L'hydrogel est compatible avec un milieu de croissance de culture de tissus, favorise la diffusion des molécules de 20 kDa, et permet l'immobilisation de protéines globulaires bioactifs. L'application de l'hydrogel de protéine induite par une intéine en tant que biocatalyseur-solvant organique compatible avec l'encapsulation a été démontrée par l'enzyme de peroxydase de raifort et corroborer son activité.

Introduction

Hydrogels entièrement en protéines transportent le potentiel de faire progresser considérablement domaines aussi divers que l'ingénierie tissulaire, l'administration de médicaments et biofabrication ^1. Ils offrent des avantages plus hydrogels traditionnels de polymères synthétiques dont la biocompatibilité et la possibilité de soutenir de manière non invasive l'incorporation de protéines globulaires bioactifs.

Dans ce travail, nous décrivons le développement d'un nouveau hydrogel protéique formé par l'intermédiaire d'une fraction de protéine induite par une intéine réaction de trans-épissage et de son application comme un échafaudage de protéines d'immobilisation (figure 1). Les blocs de construction pour cet hydrogel sont deux copolymères à blocs de protéines, chacune comprenant le fragment N-ou C-terminale d'une intéine dissociée (IN et IC) et une sous-unité d'une protéine multimérique de réticulation. L'intéine DnaE de Nostoc punctiforme (Npu) a été utilisé comme le ^2,3 intéine dissociée et une petite protéine trimérique (12 kDa) ACTU de Pyrococcus horikoshii </ Em> a été utilisé comme le ^4,5 de protéine de réticulation. Différents agents de réticulation sont reliés par le biais réaction de trans-épissage d'intéine catalysée, ce qui conduit à la formation d'un réseau de protéines hautement réticulé (hydrogel). Npu intéine a été choisi en raison de sa cinétique de réaction rapide (t _1/2 = 63 sec) et le rendement de trans-épissage élevé (près de 80%) ^2,3. La protéine de l'ACTU a été choisi comme l'agent de réticulation en raison de sa grande stabilité. ACTU trimères ont une température de dénaturation de près de 150 ° C et de conserver la structure quaternaire trimérique dans des solutions contenant pas moins de 5 M de chlorhydrate de guanidine ^4,6. Depuis l'échange d'unité entre les différents agents de réticulation est un contributeur majeur de la surface hydrogel physique érosion ^7, la très forte interaction entre la sous-unité dans l'ACTU devrait décourager de tels échanges de sous-unités, conduisant à un hydrogel plus stable. L'un de ces blocs de construction contient également un peptide S-fragment hautement hydrophile que le mi-bloc pour faciliter l'eaurétention ^8.

Le mélange des deux éléments de base d'hydrogel initie une réaction de trans-épissage entre l'IN et IC fragments d'intéine, la génération d'une chaîne polypeptidique plus longtemps avec des agents de reticulation aux deux extrémités. Les agents de reticulation à partir de plusieurs de ces unités moléculaires interagissent les uns avec les autres, formant un réseau d'hydrogel hautement réticulé (Figure 1A). Un «peptide station d'accueil" spécifique (DSP) est incorporé dans l'un des blocs de construction d'hydrogel pour faciliter l'immobilisation stable d'une "protéine d'amarrage» (DP) à marquage protéine cible dans l'hydrogel. L'utilisation d'une intéine dissociée de servir de médiateur de l'ensemble de l'hydrogel non seulement fournit une flexibilité supplémentaire pour la synthèse de protéines de l'hydrogel, mais permet également à haute densité, le chargement uniforme de la protéine cible dans l'ensemble de l'hydrogel, comme les protéines cibles sont chargées avant la formation de l'hydrogel.

La protéine hydrogel intéine médiation est très stable dans une solution aqueuse avec peu ou pas d'érosion détectable après 3 mois à température ambiante. La stabilité est maintenue dans une large gamme de pH (6-10) et de températures (4-50 ° C), et l'hydrogel est également compatible avec des solvants organiques. Cet hydrogel est utilisé pour l'immobilisation de deux protéines globulaires: la protéine fluorescente verte (GFP) et de la peroxydase de raifort (HRP). Hydrogel emprisonner cette dernière protéine est utilisée pour réaliser la biocatalyse dans un solvant organique.

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Protocole

Une. Construction des plasmides

REMARQUE: Tous les gènes ont été amplifiés dans des réactions de PCR standard utilisant Phusion haute fidélité ADN polymérase selon les spécifications du fabricant. Les amorces utilisées pour le clonage ont été décrits précédemment ^9. Toutes les constructions sont énumérés dans le tableau 1.

1. Pour générer ACTU-NpuN (N, tableau 1):
   1. Amplifier par PCR des gènes de l'ACTU et NpuN de plasmides PET30-ACTU-Astuce1 ¹⁰ et KanR-IntRBS-NpuNC-CFN ^11, respectivement, en utilisant les amorces appropriées.
   2. Digérer ces fragments avec les enzymes de restriction appropriées et insérer séquentiellement ces fragments dans le vecteur pET26b entre le promoteur T7 et un 6xHistidine tag C-terminal pour générer N (figure 2A).
2. Pour générer NpuC-S-ACTU (C, tableau 1):
   1. Amplifier par PCR NpuC, l'ACTU et S fragmentationt [AG ₃ (PEG)] ₁₀ à partir du plasmide KanR-IntRBS-NpuNC-CFN ^11, PET30-ACTU-Astuce1 ¹⁰ et pQE9 AC ₁₀ ATRP ^12, respectivement, en utilisant les amorces appropriées.
   2. Digérer ces fragments avec les enzymes de restriction appropriées et insérer séquentiellement ces fragments dans le vecteur pET26b entre le promoteur T7 et un 6xHistidine C-terminale de générer C (figure 2B).
3. Pour générer NpuC-S-SH3 _lig-ACTU (C-SH3 _lig, tableau 1):
   1. Amplifier par PCR utilisant des amorces contenant ACTU une _lig SH3 (PPPALPPKRRR) et une liaison flexible (GGGGS) ₂ pour générer fragment SH3 _lig-ACTU.
   2. Remplacer le gène de l'ACTU de C avec un fragment de SH3 _lig-ACTU.
4. Pour générer SH3-GFP (tableau 1):
   1. Amplifier le gène SH3 de plasmide pJD757 ¹³ en utilisant laamorces appropriées.
   2. Fusionner ce fragment avec le gène de la GFP et l'insérer dans le vecteur pET26b entre le promoteur T7 (figure 2C) et une 6xHistidine tag C-terminal.

2. Expression de la protéine

1. Transformer 50 ul d'chimiquement compétente Escherichia coli BL21 (DE3) par le plasmide d'expression approprié.
2. Après transformation, diluer en série de ces cellules, et de la plaque sur les Luria-Bertani (LB) / plaques de gélose contenant 50 ug / ml de kanamycine.
3. Incuber les plaques contenant des cellules transformées à 37 ° C pendant environ 15 heures.
4. Après incubation, choisir une plaque qui contient 50-100 colonies et la suspension de toutes les colonies dans 5 ml de bouillon LB.
5. Transfert suspension à 1 L de bouillon LB contenant de la kanamycine (50 pg / ml) et la culture de cellules à 37 ° C avec agitation à 250 tours par minute. Surveillance de l'absorbance à 600 nm (DO _600). Cultiver la culture jusqu'à _DO600 ~ 0,8.
   1. C et C-SH3 _lig, induire l'expression de protéine par addition d'isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à la culture (1 mM de concentration finale) et incuber la culture à 37 ° C pendant 4 heures avec une agitation à 250 tours par minute.
   2. Pour les N-GFP et SH3, refroidir la culture à ~ 18 ° C en plongeant le flacon de culture dans un bain d'eau glacée pendant ~ 5 min. Induire l'expression de protéine par addition d'IPTG à la culture (concentration finale 1 mM) et incuber la culture à 18 ° C pendant 14 à 18 heures avec une agitation à 250 tours par minute.
6. Après expression de la protéine, centrifuger la culture à 6000 g pendant 20 min à 4 ° C pour recueillir le culot. culot cellulaire de magasin à -80 ° C jusqu'à utilisation.

3. Protein Purification

1. La purification du N (conditions dénaturantes)
   1. les culots de cellules de remettre en suspension dans du tampon A (tableau 2) à 10 ml / g de culot humide.
   2. Immersenvoyer la suspension de granulés dans un bain d'eau glacée et de rompre les cellules par traitement aux ultrasons (10 ampères, avec une impulsion de s et 6 s pause pendant 1 min).
   3. Centrifuger le lysat à 16 000 x g pendant 20 min à 4 ° C.
   4. Jeter le surnageant. Reprendre le culot dans du tampon DA (contenant 8 M d'urée) et centrifuger la suspension à 16 000 xg pendant 20 min à 4 ° C.
   5. Passez le surnageant à travers une colonne de 5 ml d'acide Ni-nitrilotriacétique (NTA) préalablement équilibrée avec DA tampon.
   6. Laver la colonne avec 30 ml de tampon DA supplémenté avec 45 mM d'imidazole. Éluer la protéine purifiée en utilisant 20 ml de tampon DA supplémenté avec 150 mM d'imidazole.
   7. Réduire la concentration d'urée dans l'échantillon de protéine à <1 mM, soit par l'une des méthodes suivantes données dans 3.1.7.1 3.1.7.2 ou:
      1. Dialyser la protéine dans du tampon DPBS (tableau 2) à 4 ° C pendant une nuit en utilisant des tubes avec <20 kDa coupure.
      2. Centrifugeuse purifié la protéine dans un 30 & #160; kDa colonne de centrifugation ultra-filtration à 2800 x g, 4 ° C jusqu'à ce que le volume est inférieur à 1 ml. Ajouter 14 ml de tampon DPBS à la colonne de diluer l'échantillon de protéine. Répétez la centrifugation / dilution étapes trois fois.
   8. Après l'échange de tampon, ajouter du dithiothréitol (DTT) à la protéine purifiée (finale 2 mM) et on concentre la protéine à ~ 100 mg / ml par centrifugation à travers une colonne de centrifugation ultra-filtration de 30 kDa à 2800 x g, 4 ° C.
   9. Aliquoter la protéine concentré et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation.
2. Purification de C et C-SH3 _lig (état natif)
   1. les culots de cellules de remettre en suspension dans du tampon B (pH 6,0) (Tableau 2) complété avec un inhibiteur de protéase 1x cocktail à 10 ml / g de culot humide. Utilisation tampon acide pour réduire au minimum la dégradation protéolytique de la protéine cible.
   2. Perturber suspension cellulaire par sonication comme décrit au paragraphe 3.1.2. Centrifuger les lysmangé à 16 000 g pendant 20 min à 4 ° C et garder le surnageant.
   3. Passer le lysat soluble à travers une colonne Ni-NTA de 5 ml équilibrée au préalable avec du tampon B.
   4. Laver la colonne avec du tampon B supplémenté avec 45 mM d'imidazole, et éluer la protéine cible dans 20 ml de tampon B supplémenté avec 150 mM d'imidazole.
   5. C, passez à l'étape 3.2.6. C-SH3 _lig, procéder à une étape de purification par échange d'ions supplémentaires pour éliminer la protéine partiellement dégradée comme indiqué dans les étapes 3.2.5.1 à 3.2.5.3
      1. Réduire la concentration de NaCl dans C-SH3 _lig <1 mM suivant la procédure décrite au point 3.1.7.
      2. Charger la protéine cible sur un échangeur d'anions ml perlé colonne de la matrice d'agarose à 5 préalablement équilibrée avec du tampon phosphate de sodium (50 mM, pH 7,0).
      3. Éluer la protéine cible à partir de la colonne par l'exécution d'un gradient à partir d'une solution contenant 10 mM Tris-HCl pH 8,0 buffer à une solution contenant le même tampon additionné de NaCl 1 M. Prélever des échantillons au cours de l'élution de la protéine et de mise en commun des échantillons avec la plus grande pureté sur la base de sodium dodécyl sulfate polyacrylamide L'électrophorèse sur gel (SDS-PAGE).
   6. Échanger le tampon de la protéine purifiée dans du tampon DPBS, comme décrit dans 3.1.7.
   7. Ajouter du DTT pour la protéine purifiée (concentration finale de 2 mM) et on concentre la protéine à ~ 100 mg / ml en utilisant une colonne de centrifugation ultra-filtration de 30 kDa comme décrit dans 3.1.8. Aliquote et magasin concentrés de protéines à -80 ° C jusqu'à utilisation.
3. La purification de la GFP-SH3
   1. culots cellulaires Remettre en suspension à l'aide d'un tampon A à 10 ml / g de culot humide.
   2. Perturber culot suspension par sonication comme décrit au paragraphe 3.1.2.
   3. Centrifuger le lysat à 16 000 x g pendant 20 min à 4 ° C et collecter le surnageant.
   4. Passer le surnageant (lysat soluble) à travers une colonne Ni-NTA de 5 ml équilibrée au préalable avecTampon A.
   5. Laver la colonne avec 30 ml de tampon A additionné de 45 mM d'imidazole. Éluer la protéine purifiée en utilisant 20 ml de tampon A additionné de 150 mM d'imidazole.
   6. Échanger le tampon de la protéine purifiée dans du tampon DPBS utilisant une approche similaire à celle décrite dans 3.1.7 et concentrer la protéine de ~ 150 mg / ml en utilisant une colonne de centrifugation ultra-filtration de 30 kDa comme décrit dans 3.1.8.
   7. Aliquote et magasin de protéines purifiées à -80 ° C jusqu'à utilisation.
4. Analyse SDS-PAGE des échantillons purifiés contenant ACTU
   1. Diluer chaque protéine purifiée dans de l'eau bidistillée pour réduire la concentration de NaCl à ~ 1 mM. A cette concentration de NaCl, la plupart des protéines ACTU trimères exploités en tant que monomères sur les gels SDS-PAGE.
   2. Mélanger les échantillons avec un tampon échantillon SDS 2x (0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 20% glycerol, 10% p / v de SDS, 0,1% p / v bromo-phénol bleu, 2% β-mercaptoéthanol), incubées à 95 ° C pendant 5 min.
   3. Chargez le samples sur un gel SDS-PAGE à 12%. Effectuer l'électrophorèse à une tension constante de 200 V pendant environ 50 min.
   4. Observer les protéines dans les gels par coloration au bleu brillant de Coomassie R250 suivant les protocoles standards (Figure 1C).

4. Hydrogel Formation

REMARQUE: les hydrogels échantillons effectuées dans cette étude contiennent 1,6 mM de chaque bloc de construction d'hydrogel, sauf indication contraire. Cette concentration de protéine donne un hydrogel souple et stable. ATTENTION: azide de sodium _(NaN3) est ajouté à l'hydrogel à une concentration finale de 0,5% p / v pour empêcher la contamination bactérienne. _NaN3 est très toxique et doit être manipulé avec un soin extrême, comme indiqué dans la fiche de données de sécurité.

1. Calculer le volume de chacune des protéines concentrées nécessaires pour atteindre une concentration finale de 1,6 mM dans un échantillon de 100 ul hydrogel. Par exemple:
   Concentration de N:100 mg / ml
   Poids moléculaire de N: 26,3 kDa (voir le tableau 1)
   Concentration 100 pi désiré: Volume désiré 1,6 mM
   
2. Pour faire un pi hydrogel 100 (1,6 mM), mélange C (x pi, volume calculé d'après 4,1) avec 5% de NaN ₃ (10 ul), 100 mM de DTT (5 de pi) et N (y ul, volume calculé d'après 4.1) à l'intérieur d'un flacon de 2 ml en verre.
3. Ajouter tampon DPBS ((85 - x - y) ul) dans le flacon pour obtenir un volume final de 100 ul, et mélanger tous les composants manuellement par l'intermédiaire d'un mouvement de tourbillonnement au moyen d'un embout de pipette. Remarque: La solution devient très visqueuse lors du mélange.
4. Centrifuger le mélange pendant 2 min à 8000 xg pour éliminer les bulles d'air.
5. Incuber le mélange à la chambretempérature pendant une nuit pour permettre à la réaction de trans-épissage d'intéine pour atteindre l'achèvement. Confirmez formation d'hydrogel en tournant le tube à l'envers. Les protéines ne seront pas versés si un hydrogel est formé.
6. Estimer le rendement de trans-épissage d'intéine en vérifiant des échantillons (0,5 pi chacun) prélevés avant et après l'étape 4.2 étape 4.5 sur un gel SDS-PAGE, tel que décrit au point 3.4 (figure 1C).

5. Immobilisation de la GFP via accueil Protein (DP) et station d'accueil pour Peptide (DSP) Interaction

1. Pour effectuer une 50 ul GFP-hydrogel fonctionnalisé (1,2 mM), combiner C-SH3 _lig (x pi, calculé selon 4.1) et SH3-GFP (y ul, calculé selon 4.1) à 1:01 dans un rapport molaire de 1,7 ml microtube et incuber le mélange à la température ambiante pendant 30 min.
2. Ajouter 5% _{de NaN3} (5 pi), 100 mM de DTT (2.5 pi), (42,5 - x - y) ul DPBS à la même tube. Ajouter N (y ul, calculé selon l'4,1) pour atteindre un rapport molaire de 1:1 de N et C-SH3 _lig. Mélanger l'échantillon en utilisant une pointe de pipette par un mouvement tourbillonnant.
3. Centrifuger le mélange à 8000 g pendant 2 min et laisser incuber le mélange à la température ambiante pendant une nuit dans l'obscurité. Un hydrogel encapsulation formes SH3-GFP pendant l'incubation.

6. L'utilisation de mM hydrogel 1.6 comme un échafaudage d'immobilisation pour la réaction enzymatique dans un solvant organique

1. Utiliser la HRP comme enzyme de modèle. Préparer une solution stock de HRP (28 mg / ml ou 0,63 mM) dans du DPBS.
2. Pour faire un hydrogel 30 ul (1,6 mM) piégeant HRP, combiner C (x pi, calculé selon 4.1) avec HRP (2 ul), 5% _{de NaN3} (3 pi) et du DTT (1,5 ul de 100 mM) dans un 1,7 ml tube de centrifugation.
3. Ajouter N (y </ Em> pi, calculé conformément au point 4.1) et DPBS (23,5 - x - y) ul. Mélanger avec une pointe de pipette avec un mouvement tourbillonnant.
4. Centrifuger le mélange à 8000 g pendant 2 min et incuber à température ambiante pendant une nuit.
   ATTENTION: les régents utilisés pour le dosage de l'activité suivante sont hautement toxiques. Utilisez les recommandations de sécurité spécifiques par les fiches de données de sécurité correspondantes.
5. Par réaction enzymatique, immerger l'hydrogel dans 1 ml de cocktail de réaction contenant du N, N-diméthyl-p-phénylène diamine (5,8 mM), du phénol (5,8 mM) et de l'hydroperoxyde de tert-butyle (2,9 mM) dans du n-heptane ^14. Perturber le gel manuellement en utilisant un embout de pipette pour augmenter la zone de surface de contact de l'hydrogel et le solvant.
6. Détecter la HRP produit, un colorant du type indophénol, par mesure de l'absorbance optique des échantillons prélevés à des moments différents à 546 nm dans un lecteur de plaque (Figure 5).

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Résultats

Un schéma pour la formation induite par une intéine de protéines d'hydrogel est présentée en figure 1A. Les blocs de construction de l'hydrogel sont la protéine copolymères ACTU-NpuN (N) et NpuC-S-ACTU (C) (figure 1A, tableau 1). NpuN / C sont les N-/C-fragments du DnaE naturellement intéine dissociée de Nostoc punctiforme (Npu). L'ACTU est une protéine trimérique stable de Pyrococcus horikoshii ^4,5. Le mélange purifié de N et de C, en prése...

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Discussion

Dans ce travail, nous avons démontré la synthèse d'un hydrogel de protéine induite par une intéine très stable. L'utilisation d'une fraction de l'hydrogel permet intéine être conditionnellement formée en réponse au mélange de deux composants en phase liquide. Plus précisément, la scission de façon covalente relie intéine deux blocs de construction en phase liquide par une réaction de trans-épissage, ce qui donne une unité de polypeptide flanqué par des unités de réticulation...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phusion High Fidelity DNA polymerase	New England BioLabs	M0530S
Competent Escherichia coli BL21 (DE3)	New England BioLabs	C2527I
Luria Bertani	VWR	90003-350
Bacto Agar Media	VWR
Kanamycin sulfate	VWR
IPTG	VWR	EM-5820
Imidazole	VWR	EM-5720
Urea	VWR	EM-9510
Dithiothreitol (DTT)	Fisher	BP172-5
Protease Inhibitor cocktail	Roche Applied Science	11836153001
DPBS	VWR	82020-066
Brilliant Blue R	Acros Organics	A0297990
Sodium Azide	Fisher	AC190380050	Caution, highly toxic
Horseradish peroxidase	Sigma	P8125-5KU
N,N-dimethyl-p-phenylene diamine	Fisher	AC408460250	Caution, highly toxic
phenol	Fisher	AC149340500	Caution, highly toxic
tert-butyl hydroperoxide	Fisher	AC180340050	Caution, highly toxic
n-heptane	Acros Organics	120340010
[header]
Shaker/Incubator	Fisher Scientific	Max Q 6000
Centrifuge	Sorvall	RC 6
Sonicator	QSonica	Misonix 200
Ultrafiltration Tubes	Amicon Ultra	UFC903024
Ni Sepharose High Performance HisTrap column	GE Healthcare Life Sciences	17-5248-01
HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column	GE Healthcare Life Sciences	17-5156-01
Plate reader	Molecular Devices	SpectraMax Gemini EM