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Résumé

En combinant natif et réticulation immunoprécipitation de la chromatine à haute résolution de spectrométrie de masse, l'approche ChroP permet de disséquer l'architecture protéomique composite de modifications des histones, des variantes et des protéines non-histoniques synergie au domaines de la chromatine fonctionnellement distinctes.

Résumé

La chromatine est un complexe de nucléoprotéine hautement dynamique faite de l'ADN et des protéines qui contrôle divers procédés d'ADN-dépendante. la structure de la chromatine et de la fonction à des régions spécifiques est régie par l'enrichissement local du histones modifications post-traductionnelles (hPTMs) et variantes, les protéines de la chromatine de liaison, y compris les facteurs de transcription, et méthylation de l'ADN. La caractérisation protéomique de la composition de la chromatine au niveau des régions fonctionnelles distinctes a été jusqu'ici entravé par le manque de protocoles efficaces pour enrichir ces domaines à la pureté et la quantité appropriée pour l'analyse en profondeur ultérieure par spectrométrie de masse (MS). Nous décrivons ici une stratégie de protéomique de la chromatine nouvellement conçu, nommé ChroP (Chro matin P roteomics), dans lequel une immunoprécipitation de la chromatine préparative est utilisée pour isoler les régions de la chromatine distincts dont les caractéristiques, en termes de hPTMs, variantes et co-associés protéines non histoniques, sont analysés par MS. Nous illustrons ilre la mise en place de ChroP pour l'enrichissement et l'analyse des régions d'hétérochromatine transcriptionnellement silencieux, marqué par la présence de tri-méthylation de la lysine 9 sur l'histone H3. Les résultats obtenus démontrent le potentiel de ChroP pour caractériser complètement le protéome de l'hétérochromatine et prouver comme une stratégie analytique puissant pour comprendre comment les déterminants de protéines distinctes de la chromatine et interagissent en synergie pour établir les configurations structurelles et fonctionnelles spécifiques de locus.

Introduction

La chromatine est un complexe nucléoprotéine très dynamique qui est impliqué en tant que modèle primaire pour tous les processus médiés par ADN. Le nucléosome est l'unité répétée de base de la chromatine et est constitué d'un noyau protéique octamère contenant deux molécules de chaque histone H2A canonique, H2B, H3 et H4, autour de laquelle 147 pb d'ADN sont enroulées 1,2. Tous les histones sont structurées comme un domaine globulaire et une "queue" N-terminal flexible qui fait saillie à l'extérieur du nucléosome. L'un des principaux mécanismes de régulation de la structure de la chromatine et la dynamique est basé sur covalentes modifications post-traductionnelles (PTM), qui se produisent principalement sur ​​l'extrémité N-terminales des histones 3,4. modifications des histones peuvent fonctionner soit en modifiant la structure de la chromatine afin supérieur, en changeant les contacts entre les histones-ADN ou entre nucléosomes, et de contrôler ainsi l'accessibilité des protéines de liaison à l'ADN (mécanismes cis), ou en agissant comme DockInsites g de protéines de régulation, soit comme des unités simples ou intégrés dans des complexes multimériques. De telles protéines de régulation peuvent exercer leur fonction de différentes façons: en modulant directement l'expression du gène (à savoir les protéines TAF), ou en modifiant le positionnement des nucléosomes (c'est à dire le remodelage de la chromatine des complexes) ou en modifiant d'autres résidus d'histones (par exemple des protéines avec des méthyl-transférase ou l'acétyl- transférase) (mécanismes trans) 5. L'observation que distincte grappe des modèles PTM à la chromatine locus spécifique conduit à l'élaboration de l'hypothèse que les différentes modifications dans des sites distincts en synergie pour générer un code moléculaire médiation de l'état fonctionnel de l'ADN sous-jacente. Le "code histone hypothèse" a acquis un large consensus dans les années, mais sa vérification expérimentale a été freinée par des contraintes techniques 6,7.

Protéomique à base de spectrométrie de masse (MS) a émergé comme unoutil puissant pour cartographier la distribution de modification des histones et de caractériser les protéines de la chromatine liaison 8. MS détecte une modification comme une Δmass spécifique entre la masse expérimentale et théorique d'un peptide. Au niveau des histones individuelles, MS fournit une méthode objective et globale de la carte MEA, permettant la détection de nouvelles modifications s'enchaînant révélateurs parmi eux 9-14.

Au cours des dernières années, un certain nombre de stratégies ont été développées pour disséquer la composition de la chromatine protéomique, y compris la caractérisation de chromosomes intacts mitotiques, 15 l'identification de protéines solubles de liaison à Hptm 16-18 et l'isolement et l'analyse des régions spécifiques de la chromatine (par exemple télomères) 19,20. Toutefois, l'enquête des synergies spécifiques de locus entre MEA histones, les variants et les protéines de la chromatine associée est encore incomplète. Ici, nous décrivons une nouvelle approche, appelée ChroP (Chro roteomics matin P) 21, que nous avons développés pour caractériser efficacement les domaines de la chromatine fonctionnellement distinctes. Cette approche s'adapte immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), un protocole bien établi, utilisé dans la recherche en épigénétique, pour l'analyse protéomique MS efficace de l'échantillon enrichi. Nous avons mis au point deux protocoles différents, en fonction du type de la chromatine utilisée comme entrée et l'interrogation adressée par MS; en particulier: 1) morceau de la chromatine native non fixée digéré avec MNase est utilisé pour purifier mono-nucléosomes et à disséquer les hPTMs co-associant (N-ChroP); 2) à puce de la chromatine réticulée fragmenté par ultrasons est utilisé en combinaison avec un interactomique stratégie basée sur SILAC à caractériser toutes les protéines (X-ChroP) contraignant la chromatine co-enrichissement. Nous illustrons ici la combinaison de N-et X-ChroP pour enrichir et d'étudier l'hétérochromatine, en utilisant H3K9me3 comme appât pour les étapes d'immunoprécipitation. L'utilisation de ChroP peut être étendud'étudier soit des régions distinctes sur la chromatine, ou des changements dans la composition de la chromatine dans la même région au cours de la transition à un état fonctionnel différent, ouvrant ainsi la voie à de nombreuses applications dans l'épigénétique.

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Protocole

1. Culture cellulaire

  1. Milieu standard pour la puce native
    1. Cultiver des cellules HeLa en Eagle modifié du milieu de Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 1% de glutamine, 1% de Pen / Strep et de 10 mM d'HEPES pH 7,5.
  2. étiquetage SILAC de réticulation ChIP
    1. Cultiver des cellules HeLa dans du milieu DMEM, SILAC appauvri de la lysine et de l'arginine, complété avec 10% de FBS dialyse, 1% de glutamine, 1% de Pen / Strep, 10 mM HEPES pH 7,5 et, soit la lumière L-lysine (Lys 0) et L- arginine (Arg 0) ou leurs homologues lourds, L-lysine (Lys 8) et de la L-arginine (Arg 10) (tableau Materials), aux concentrations finales de 73 mg / L et 42 mg / L, respectivement.
    2. Cultiver des cellules pour jusqu'à huit générations en milieu SILAC pour assurer complets acides aminés d'isotopes codé incorporation. Passez cellules tous les deux jours, quand ils atteignent une densité de 1,0-1,5 x 10 6 cellules / ml, en les ensemençant à aconcentration de 3 x 10 5 cellules / ml.
    3. Évaluer la croissance des cellules et la viabilité à moyen SILAC à individualiser une éventuelle altération de la physiologie qui pourraient résulter de la composition plus pauvres du milieu SILAC; Pour ce faire:
      1. Inspecter visuellement les cellules au microscope morphologie des tous les jours pendant l'étiquetage.
      2. Compter les cellules et les courbes de croissance de l'intrigue de la croissance des cellules dans un milieu standard SILAC contre.

2. Natif immunoprécipitation de la chromatine (N-Chip)

  1. Préparation des noyaux de cellules en culture
    1. Utilisez 1-2 x 10 8 cellules non marquées HeLaS3 par expérience. cellules de récolte, font partie aliquote de 50 x 10 6 cellules en tubes de 50 ml et centrifuger à 340 g pendant 10 min à 4 ° C, les laver avec du PBS glacé.
    2. Remettre en suspension chaque culot cellulaire dans 8 ml de tampon de lyse (tableau 1) et incuber pendant 10 min à 4 ° C sur une roue rotative. Verser cachaque lysat cellulaire refully sur un coussin de saccharose (Tableau 1) et centrifugation dans un rotor pivotant, à 3270 xg pendant 20 min à 4 ° C, pour séparer les noyaux de cytoplasme.
    3. Jeter surnageants, garder pastilles nucléaires et les laver deux fois dans du PBS glacé par centrifugation, éliminer le surnageant à chaque lavage.
  2. Micrococcique nucléase (MNase) digestion (à petite échelle) et contrôle de la qualité de la chromatine après digestion
    1. Reprendre le culot nucléaire lavé dans 1 ml de tampon de digestion (tableau 1); diviser en deux aliquotes de 500 pi et garder sur la glace.
    2. Mesurer la densité optique (DO) à 260 nm d'une portion aliquote, dilué à 1:200 dans 0,2% de dodécylsulfate de sodium (SDS). Remarque: OD = 1 correspond à environ 50 pg / ml d'ADN de la chromatine. Typiquement, à partir de 2 x 10 8 cellules, la densité optique est de l'ordre de 40 à 60.
    3. Prendre 1% de noyaux, ajouter MNase enzyme à une concentration finale de 0.005 U d'enzyme / pi de noyaux et incuber à 37 ° C pour différents laps de temps (0, 10, 20, 40, 60 min).
    4. A chaque point de temps, de recueillir 4 pi de noyaux digérés et ajouter 1 mM EDTA pour arrêter la réaction MNase. Garder sur la glace.
    5. Extraire des échantillons d'ADN par PCR purification kit et éluer les dans 50 ul de tampon TE (tableau 1).
    6. Prendre 20 pl de chaque échantillon d'ADN, ajouter 10 ul de tampon de charge (tableau 1) et les charger sur des échantillons de 1% (p / v) de gel d'agarose contenant du bromure d'éthidium, avec marqueur PCR comme un contrôle de la taille.
    7. Vérifiez la digestion évaluer l'échelle nucléosome chromatine produite par MNase incubation.
    8. Choisir le moment optimal pour la digestion, en fonction de la prévalence de la mono-nucléosomes dans la préparation. . Typiquement, pour 0,005 U d'enzyme / pi de noyaux le moment optimal de MNase digestion est de 60 min (figure 1B, panneau de gauche) Remarque: Le MNase optimale concentration / temps de digestibilitéle peut être ajustée en fonction du type cellulaire souhaité et de la taille du tronçon nucléosomes.
  3. Large-scale/preparative MNase digestion et la récupération des fractions solubles de la chromatine
    1. Ajouter à chaque partie aliquote (voir 2.2.1) 5 pl MNase, correspondant à une concentration finale de 0,005 U d'enzyme / pl de noyaux; mélanger doucement et incuber à 37 ° C pendant 60 min (ou en général pour l'intervalle de temps optimisé, sur la base de l'essai à petite échelle).
    2. Ajouter 1 mM EDTA pour arrêter la réaction et garder sur la glace. Sédimenter les noyaux digérés par centrifugation à 7800 x g à 4 ° C pendant 10 min. Transférer les surnageants (fraction S1) dans un nouveau tube et stocker à 4 ° C. Note: S1 contient la première fraction soluble de la chromatine, comprenant des mono-nucléosomes. Ajouter les inhibiteurs de la protéase (tableau 1).
    3. Pastilles resuspendre délicatement dans 1 ml de tampon de dialyse (tableau 1) et dialyse pendant une nuit à 4 ° C (cut hors du tube de dialyse est de 3,5 kDa), dans 3 L de tampon de dialyse, avec une agitation modérée constante. Récupérer la matière dialysée et centrifuger à 7800 g pendant 10 min à 4 ° C. Transférer le surnageant (fraction S2) dans un nouveau tube Eppendorf et stocker à 4 ° C. Remarque: S2 comprend EPTA-nucléosomes, en fonction de la digestion mesure MNase di-à.
  4. Contrôle de la qualité de la chromatine avant immunoprécipitation
    1. Prélever une partie aliquote correspondant à 5 pg de S1 et S2 fractions de chromatine (quantifiée par mesure de la DO à 260 nm dans un système de NanoDrop). Extraire de l'ADN par le kit de purification de PCR et on élue dans 50 ul de tampon TE (tableau 1).
    2. Prenez 20 pi de S1 et S2 ADN, mélanger avec 10 pi Chargement tampon (tableau 1) et les charger sur 1% (p / v) de gel d'agarose. Vérifier la qualité et l'efficacité de la digestion MNase par inspection visuelle de l'échelle des nucléosomes. Remarque: Fraction S1 est trèsenrichi en mono-nucléosomes, tandis que la fraction S2 contient principalement des poly-nucléosomes (figure 1B, panneau de droite).
  5. L'incubation avec l'anticorps de la chromatine
    1. Conserver à -20 ° C 50 pi de fraction S1 pour analyse ultérieure de spectrométrie de masse.
    2. Ajouter 1 volume de tampon de dilution ChIP (Tableau 1) pour la fraction S1.
    3. Ajouter l'anticorps contre le Hptm (ou protéines) d'intérêt; incuber pendant la nuit sur ​​une roue tournant à 4 ° C. Remarque: En règle générale, utiliser 10 ug à 20 pg d'anticorps pour 2 x 10 8 cellules. Le rapport optimal entre la quantité d'anticorps et le nombre initial de cellules doit être réglée avec soin au cas par cas, en fonction de l'abondance du Hptm / protéine utilisée comme appât à l'intérieur de l'échantillon et sur l'efficacité de l'anticorps. L'optimisation est expérimental, sur la base des critères suivants:
      1. Comparer la quantité de Hptm / protéine d'intérêt entre l'entrée et passage (FT,voir 2.7.2) par Western Blot ou MS pour vérifier que l'immunoprécipitation enrichit une proportion significative de région spécifique de la chromatine. Remarque: Ceci est généralement obtenu lorsque au moins 50% de l'appât Hptm / protéine est épuisé dans le FT (figure 1C) .
      2. Vérifier que la protéine immunoprécipitée d'intérêt est détectable sur gel SDS-PAGE, ce qui assure qu'une quantité suffisante de matière est disponible pour l'analyse de MS. Remarque: La présence sur le gel des bandes correspondant aux quatre histones de noyau à la stoechiométrie correcte indique que le nucléosome intact a été immunoprécipitée par le N-ChroP (Figure 1D). Le manque de la stoechiométrie correcte est en fait représentatif d'une interruption partielle / déroulement du nucléosome.
    4. En parallèle, préparer les billes magnétiques G-couplé protéines (voir 2.6).
  6. Équilibrage et le blocage des billes de protéine G magnétiques couplés
    1. Equilibrer 100 pi de protéine G-billes magnétiques couplées suspension dans la solution de blocage (tableau 1), en lavant trois fois et en les incubant pendant la nuit à 4 ° C sur une roue rotative. Remarque: la suite de la capacité de liaison de perles, en utilisant 100 ul de suspension de 2-20 pg d'anticorps.
    2. Laver les billes bloqués une fois avec la solution de blocage, puis deux fois avec le tampon de dilution puce (tableau 1).
  7. Isolement de la chromatine en utilisant des billes magnétiques
    1. Ajouter 100 ul de billes bloquées à l'échantillon de chromatine S1 et incuber sur une roue en rotation à 4 ° C pendant 3 heures. Centrifuger à 340 g pendant 1 min à centrifuger l'échantillon du couvercle des conseils. Mettez dans un rack magnétique pour sédimenter les billes.
    2. Transférer le surnageant dans un nouveau tube Eppendorf. Ceci est le débit à travers (FT), à savoir la fraction de la chromatine qui ne s'est pas liée à l'anticorps.
    3. Laver les billes quatrefois dans du tampon de lavage (tableau 1) en augmentant la concentration en sel à chaque lavage (75, 125 et 175 mM NaCl).
    4. Pour éluer la chromatine immunoprécipitée, incuber les billes dans 30 pl de tampon d'échantillon LDS, complété avec 50 mM de dithiothréitol (DTT) pendant 5 min à 70 ° C. Séparer les protéines éluées sur un gel de gradient 4-12% de Bis-Tris acrylamide SDS-PAGE, préfabriqué et tacher le gel avec le kit de coloration au bleu de Coomassie colloïdal (figure 1D).

3. Réticulation immunoprécipitation de la chromatine (ChIP-X)

  1. Réticulation des cellules avec du formaldéhyde
    1. Ajouter 0,75% de formaldéhyde à des cellules SILAC marqué, mélanger brièvement et incuber pendant 10 min à température ambiante. Étancher le formaldéhyde par addition de glycine 125 mM et incuber pendant 5 minutes à température ambiante.
    2. Diviser les cellules dans 5 x 10 7 aliquotes; rincer trois fois avec du PBS glacé par centrifugation à 430x g pendant 5 min à 4 ° C et à rejeter les surnageants après chaque lavage. Au dernier lavage, éliminer le surnageant et garder le culot. Remarque: Une fois que les cellules sont réticulés, ils peuvent être stockés à -80 ° C s'il n'est pas utilisé immédiatement.
  2. Préparation des noyaux
    1. Remettre en suspension chaque culot cellulaire dans 10 ml de tampon de lyse (tableau 1). Incuber pendant 10 min à 4 ° C avec rotation. Centrifuger à 430 g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant; garder pastilles nucléaires.
    2. Reprendre chaque culot nucléaire dans 10 ml de tampon de lavage (tableau 1). Incuber à température ambiante pendant 10 min sur une roue rotative.
    3. Centrifuger à 430 g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et recueillir les granulés.
    4. Remettre en suspension chacun des pastilles nucléaires dans 3 ml ChIP tampon d 'incubation (tableau 1). Garder sur la glace.
  3. Chromatine ultrasons et contrôle de la qualité
    1. Soniquer ch. romatin à 200 W (cycles de 30 sec "sur" et 1 min "off"), dans un Bioruptor refroidi, à fragmenter la chromatine Remarque: le nombre de cycles et des intervalles de sonication dépend du type de cellule et sur ​​la durée moyenne de nucléosomique étirer souhaitée. Typiquement, 30 min de sonication sont nécessaires pour générer des fragments d'ADN de 300-500 paires de bases en longueur, correspondant à di-et tri-nucléosomes. Le choix de la taille des fragments dépend du type de domaine de chromatine à l'étude.
    2. Prendre 2% de l'apport total, inverser la réticulation par incubation à 65 ° C pendant un minimum de 1 heure dans la puce tampon d'incubation. Extraire l'ADN par PCR purification kit, éluer dans 50 ul de TE Buffer et charger l'ADN sur gel d'agarose pour vérifier la fragmentation de la chromatine.
  4. L'incubation avec l'anticorps de la chromatine
    1. Ajouter 1/10 de volume de 10% de Triton X-100 à la chromatine traitée aux ultrasons. Centrifuger à 12 000 g pendant 10 min à 4 ° C pour former un culot debris.
    2. Enregistrer 50 pi de l'entrée de la chromatine de cellules lourds pour tester le niveau de SILAC acides aminés d'incorporation dans les cellules marquées et pour la protéine profilage.
    3. Ajouter l'anticorps de choix pour la chromatine lourde et légère marqué restant soumis aux ultrasons et incuber une nuit à 4 ° C sur la roue tournante. Dans le canal de lumière, ajouter aussi une fois en excès du peptide soluble. Incuber pendant une nuit à 4 ° C sur une roue rotative Notes:. L'état optimal entre le pg d'anticorps et de la matière de départ de cellules est choisi au cas par cas, comme on le verra en 2.5.3. Le optimale excès d'un facteur molarité du peptide soluble dans le respect de l'anticorps doit être augmentée avec précaution au cas par cas.
  5. Isolement de la chromatine en utilisant des billes magnétiques
    1. Equilibrer et bloquer la protéine G billes magnétiques couplés en suivant les étapes décrites dans 2.6 et utilisant le morceau de tampon d'incubation.
    2. Ajouter 100 pi de b bloquéEADS échantillons de chromatine et incuber sur une roue en rotation pendant 3 heures à 4 ° C. Centrifuger à 340 g pendant 1 min à centrifuger l'échantillon du couvercle des conseils. Mettez dans un rack magnétique pour sédimenter les billes. Le surnageant est l'écoulement à travers (FT), contenant nucléosomes non liés. Laver quatre fois dans de perles de Tampon de lavage (tableau 1) avec l'augmentation de la concentration de sel (deux lavages à 150 mM et les deux à 300 mM de NaCl).
    3. Incuber perles dans 30 ul SDS-PAGE Chargement Sample Buffer (tableau 1) et pendant 25 minutes à 95 ° C à la fois élution et dé-réticulation des protéines immunoprécipitées. Protéines séparées sur 4-12% Bis-Tris acrylamide SDS-PAGE gels préfabriqués (figure 3D).

4. Préparation de l'échantillon Avant de MS

  1. En-Gel digestion des histones enrichies de N-ChIP
    Remarque: lors de la digestion des protéines et d'extraction de peptide étapes prennent soinpour minimiser les contaminations kératiniques qui interfèrent avec LC-MS/MS, comme décrit précédemment 22, 23.
    1. tranches de gel de coupe correspondant aux histones bandes (figure 1D). De-tacher les morceaux de gel avec 50% d'acétonitrile (ACN) dans le trou DDH 2 O, en alternance avec 100% d'ACN pour réduire le gel. Répétez jusqu'à ce que les gels morceaux sont complètement dé-tachés et les sécher dans une centrifugeuse sous vide.
    2. Ajouter D-6 anhydride acétique 01:09 (v / v) dans 1 M de bicarbonate d'ammonium (NH 4 HCO 3) (typiquement le volume final est de 60 à 100 ul) et 3 pl d'acétate de sodium (CH 3 COONa), en tant que catalyseur. Incuber pendant 3 heures à 37 ° C avec de fortes secousses. Remarque: L'échantillon peut générer des bulles dans les premières minutes après l'assemblage de la réaction: il est important de gérer avec prudence et libérer le gaz généré, ouverture de temps en temps les tubes au cours de l'incubation.
    3. Rincer les morceaux de gel à plusieurs reprises with NH 4 HCO 3, alternent avec ACN à accroître le pourcentage (de 50% à 100%), afin d'éliminer totalement les résidus de D-6 anhydride acétique.
    4. Rétrécir les morceaux de gel de 100% d'ACN; les sécher dans une centrifugeuse sous vide pour assurer l'hydratation complète de-. Réhydrater morceaux de gel avec de la glace-froid 100 ng / ul de solution de trypsine dans 50 mM de NH 4 HCO 3 et incuber pendant une nuit à 37 ° C. Remarque: La combinaison de la modification chimique des lysines en utilisant l'anhydride acétique deutéré et digestion par la trypsine génère un "Arg- C certainement "dans le modèle de la digestion de gel des histones 21,24.
    5. Jetez l'excès de solution et ajouter un volume de 50 mM NH 4 HCO 3 pour couvrir complètement les morceaux de gel; incuber une nuit à 37 ° C.
    6. Recueillir des peptides digérés solubles dans un nouveau tube Eppendorf. Lyophiliser peptides. Remettre en suspension dans 0,5% d'acide acétique de l'acide trifluoroacétique acid/0.1 de% (TFA). Dessaler et se concentrerpeptides sur une phase inverse C 18 / carbone "sandwich" et chromatographie échangeuse d'ions (SCX) sur microcolonnes faits à la main (StageTip) 25.
    7. Préparer les microcolonnes de StageTip en mettant disques de grillages en téflon contenant C immobilisé 18 / carbone («sandwich») et perles SCX dans un 200 conseils ul. Procurez-vous le "sandwich" en chargeant le C 18 Microcolonne sur une deuxième pointe chargé avec filtre à charbon. Remarque: Les peptides très courts, qui ne sont pas retenus sur le filtre C 18, passer dans le flux continu qui est chargé directement sur le Conseil de carbone, qui les capture généralement. StageTips SCX peuvent enrichir peptides spécifiques, tels que H3 (3-8) peptidiques, pas efficacement retenu par chromatographie en phase inverse.
    8. Charge de 50% de peptides sur la C 18 / carbone «sandwich StageTip" et 50% sur SCX StageTips. Les éluer des Conseils C 18 / carbone à l'aide de 80% ACN/0.5% ac acétiqueid et de la Conseils SCX avec 5% d'hydroxyde d'ammonium (NH 4 OH) / 30% de methanol. Après peptides lyophilisation, remettre en suspension dans 0,1% FA et analyser par LC-MS/MS.
  2. Digestion des protéines dans le gel immunopurifiés
    Digestion des protéines dans le gel est réalisée de la manière décrite précédemment 22, avec des modifications mineures.
    1. Couper chaque voie en dix tranches (figure 3D) et chaque tranche en petits cubes de 1 mm 3. De-tacher les morceaux de gel avec 50 mM de NH 4 HCO 3/50% d'éthanol et ajouter de l'éthanol absolu pour rétrécir les gels. Répétez jusqu'à ce que les gels sont complètement de-colorées.
    2. Ajouter un tampon de réduction (tableau 1) pour les morceaux de gel pendant 1 heure à 56 ° C, suivi par l'addition d'un tampon d'alkylation (tableau 1) pendant 45 min à température ambiante, dans l'obscurité. Laver et sécher les morceaux de gel dans la centrifugeuse sous vide.
    3. Réhydrater les morceaux de gel avec de la glace-froid 12,5 ng / ul trypsine solution dans 50 mM de NH 4 HCO 3 et incuber sur de la glace jusqu'à ce que la réhydratation complète des morceaux de gel. Retirer la trypsine en excès.
    4. Ajouter 50 mM NH 4 HCO 3 pour couvrir complètement les morceaux de gel. Incuber pendant une nuit à 37 ° C.
    5. Recueillir la partie liquide. Ajouter du tampon d'extraction (tableau 1) pour les morceaux de gel; incuber avec une forte agitation pendant 10 min à température ambiante. Répéter deux fois.
    6. Incuber les morceaux de gel dans de l'ACN pendant 10 min sous forte agitation. Répéter deux fois et en commun tous les surnageants.
    7. Lyophiliser les peptides. Reprendre peptides secs dans 0,5% d'acide acétique acid/0.1% de TFA.
    8. Dessaler et se concentrer peptides sur une phase inverse C 18 StageTip, comme décrit 26, 27.
    9. Éluer les peptides à partir de la StageTip C 18 en utilisant 80% d'acide acétique ACN/0.5%. Éliminer le solvant organique par évaporation dans une centrifugeuse sous vide et remise en suspension des peptides à 0,1% FA (typiquement de 5 à 10 et# 181; l), lorsqu'il est prêt à l'analyse de la MS.

5. LC-MS Analyse

  1. Une analyse par Chromatographie liquide
    1. Emballer la colonne analytique à un 15 cm condensé émetteur de silice (75 um de diamètre intérieur, de 350 pm de diamètre extérieur), en utilisant en phase inverse (RP) en C 18, 3 résine um dans le méthanol, à une pression d'hélium constante (50 bar) en utilisant un dispositif bombe-chargeur, comme décrit précédemment 28.
    2. Couple l'émetteur emballé (C 18 sur une colonne de RP) directement à la sortie de la vanne 6-port de la HPLC à travers un long (diamètre intérieur de 25 um) de 20 cm de la silice fondue, sans utiliser de pré-colonne ou un dispositif partagé.
    3. Chargez les peptides digérés à C 18 colonne de RP au débit de 500 nl / min phase mobile A (0,1% FA / 5% d'ACN dans le trou DDH 2 O).
    4. Après chargement de l'échantillon, séparer les peptides en utilisant les gradients suivants:
      1. Appliquer 0-40% de phase mobile B (0,1% FA/99% ACNdans le trou DDH 2 O) à 250 nl / min sur 90 min, suivi par un gradient de 40 à 60% en 10 min et de 60 à 80% sur 5 min, pour l'élution des peptides dérivant de histones (voir 2).
      2. Appliquer 0-36% de phase mobile B à 250 nl / min pendant 120 minutes, suivi par un gradient de 36 à 60% en 10 min et de 60 à 80% sur 5 min, pour l'élution des peptides dérivant de protéines immuno purifiés (voir 3).
  2. Analyse de spectrométrie de masse utilisant LTQ-FT-ICR-Ultra spectromètre de masse
    1. Fonctionner dans une acquisition de données dépendant Mode (DDA) pour commuter automatiquement entre les États membres et l'acquisition MSMS. MS spectres complets sont acquis, typiquement dans la gamme m / z de 200-1,650, est acquis à la résolution R = 100 000 à 400 m / z. Les cinq (Top 5) des ions les plus intenses sont isolés pour la fragmentation dans le piège à ions linéaire à l'aide d'une dissociation induite par collision (CID) à une valeur cible de 5000.
    2. Utilisez les paramètres énumérés dans le tableau 2 for le fichier d'acquisition "Tuning".
    3. Définissez les paramètres d'acquisition standards comme indiqué dans le tableau 2.

6. Analyse des données

  1. Étiqueter libre quantification des modifications des histones co-enrichis dans les domaines de la chromatine
    1. Convertir les fichiers brutes acquises aux fichiers mgf l'aide du logiciel Raw2msm (version 1.10) 29.
    2. Rechercher les modifications des histones en utilisant mascotte Deamon (version 2.2.2), le réglage des paramètres décrits dans le tableau 3.
    3. Sur la sortie liste de peptide mascotte, retirez peptides avec un score inférieur à 15 ou de plus de 5 MEA putatifs 29. Remarque: Pour chaque ID de peptide unique, sélectionnez le peptide avec le meilleur score Mascot et filtrer toutes les autres peptides redondants avec le même ID .
    4. Construire les chromatogrammes d'ions extraits (XIC) pour chaque précurseur correspondant à tous les peptides modifiés, based sur la valeur m / z, en utilisant la QualBrowser. Calculer l'aire sous la courbe (AUC) pour chaque pic (figure 2A).
    5. Validez chaque peptides identifiés contenant des modifications par inspection visuelle des spectres MS / MS en utilisant le QualBrowser (figure 2B).
    6. Calculer l'abondance relative de chaque peptide modifié. Calcul de l'enrichissement relatif de chaque modification dans le matériau ChIP-ed Remarque:. Abondance relative est calculée comme le rapport entre l'AUC de chaque peptide modifié spécifique sur la somme des AUC de toutes les formes modifiées et non modifiées de la même peptide, tandis que par rapport enrichissement en tant que rapport de l'abondance relative de la modification spécifique dans la puce au-dessus de l'entrée (figure 2C).
  2. Analyse protéomique quantitative des protéines co-associé dans les domaines de la chromatine
    1. Pour les protéines identification et la quantification utilisent le package MaxQuant(Http://www. Maxquant.org /) 30. Configurer le moteur de recherche intégré "Andromeda" en utilisant le AndromedaConfig.exe 31 et définir les paramètres de recherche répertoriés dans le tableau 3.
  3. essai de constitution
    1. Estimer le degré d'incorporation d'acides aminés dans les protéines lourds en entrée de la chromatine lourde marqué, en utilisant un logiciel MaxQuant, comme suit:
      1. Définissez les paramètres comme indiqué au point 6.2, mais de désactiver l'option re-quantifier.
      2. Calculer le pourcentage d'incorporation appliquant la formule suivante à des taux de peptide non redondants. Incorporation (en%) = rapport (H / L) / rapport (H / L) + 1 x 100 (figure 3B) Note: Accepter que si incorporation> 95 %.

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Résultats

Immunoprécipitation de la chromatine est une technique puissante utilisée pour le profil de la localisation d'une protéine ou d'une modification d'histone long du génome. Dans un protéomique équivalent, Chip est suivie par la protéomique MS pour identifier qualitativement et quantitativement les hPTMs, variants d'histones et des protéines de la chromatine de liaison qui sont immunoprécipités avec la modification ou de la protéine d'intérêt, utilisées comme «appât». Dans l'approch...

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Discussion

Nous avons récemment décrit ChroP, une stratégie pour la caractérisation quantitative à grande échelle des composants protéiques de la chromatine. ChroP combine deux approches complémentaires utilisés dans le domaine de l'épigénétique, la puce et MS, profitant de leurs points forts et de surmonter leurs limitations respectives. ChIP couplé à un séquençage profond (ChIP-Seq) permet la cartographie du génome de modifications des histones à la résolution de quelques nucléosomes 35. Bien a...

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

Cette recherche a été publié à l'origine dans Mol Cell Proteomics. Soldi M. et T. Bonaldi La protéomique enquête de la chromatine domaines fonctionnels Révèle nouveaux Synergismes entre Distinct hétérochromatine Composants MCP. 2013; 12: 64-80. © l'American Society for Biochemistry and Molecular Biology. Nous remercions Roberta Noberini (Institut Italien de Technologie et l'IEO, Italie) pour la lecture critique du manuscrit. travail de la tuberculose est soutenu par des subventions du-Armenise Harvard Programme Giovanni Fondation de développement de carrière, l'Association italienne pour la recherche du cancer et le ministère italien de la Santé. Travail MS a été soutenue par une bourse FIRC.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM LonzaBE12-614F
FBSInvitrogen10270-106
SILAC DMEMM-MedicalFA30E15086
Dialyzed FBSInvitrogen26400-044
Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine)Sigma AldrichL8662
Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine)Sigma AldrichA6969
Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine)Sigma Aldrich68041
Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine)Sigma Aldrich608033
Micrococcal NucleaseRoche10 107 921 001
Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail TabletsRoche04 693 132 001
Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot lengthSpectrumlabs132720
QIAquick PCR purification kitQIAGEN28104
Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP gradeAbcamab8898
Histone H3 peptide tri-methyl K9 Abcamab1773
Dynabeads Protein GInvitrogen100.04D
NuPAGE Novex 4-12%                            Bis-Tris Gel InvitrogenNP0335BOX
Colloidal Blue Staining KitInvitrogenLC6025
LDS Sample BufferInvitrogenNP0007
FormaldheydeSigma AldrichF8775
Aceti anhydride-d6Sigma Aldrich175641-1G
[header]
Formic AcidSigma Aldrich94318-50ML-F
Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystallineSigma AldrichI6125
DL-DithiothreitolSigma Aldrich43815
Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100 μg (5 × 20 μg)PromegaV5113
Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8 μm uncoated Pk 5Microcolumn SrlFS360-75-8-N-5-C15
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm   15% CDr. Maisch GmbHr13.aq.
Carbon extraction disk, 47 mmAgilent Technologies12145040
Cation extraction diskAgilent Technologies66889-U

Références

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