Trois Cultures dimensionnelles: un outil pour étudier l'architecture normale Acinaire vs transformation maligne des cellules mammaires

Résumé

Trois culture tridimensionnelle de cellules épithéliales mammaires sur une membrane basale reconstituée est un procédé utile de rappeler l'architecture in vivo du sein bénigne, et pour différencier le phénotype malin du phénotype bénignes du sein. Surtout, ce système peut être appliqué pour étudier les carcinomes invasifs dans d'autres tissus.

Résumé

Les carcinomes du sein invasifs sont un groupe de tumeurs épithéliales malignes caractérisé par l'invasion des tissus adjacents et la propension à former des métastases. L'interaction des signaux entre les cellules cancéreuses et leur microenvironnement exerce une forte influence sur la croissance du cancer du sein et le comportement biologique ^1. Cependant, la plupart de ces signaux de la matrice extracellulaire sont perdus ou leur pertinence est sous-lorsque les cellules sont cultivées dans deux cultures dimensions (2D) en monocouche. Au cours des dernières années, en trois dimensions (3D) de la culture sur une membrane basale reconstituée a émergé comme une méthode de choix pour récapituler l'architecture tissulaire de cellules bénignes et malignes du sein. Les cellules cultivées en 3D conservent les signaux importants de la matrice extracellulaire et fournissent un système ex vivo ^2,3 physiologiquement pertinent. Fait à noter, il existe des preuves de plus en plus ce qui suggère que les cellules se comportent différemment lorsqu'ils sont cultivés en 3D par rapport à la 2D ^4. Culture 3Dpeut être efficacement utilisé comme un moyen pour différencier le phénotype malin du phénotype bénigne du sein et de la signalisation cellulaire qui sous-tend moléculaire impliqué et ^3. L'une des caractéristiques distinctives des cellules épithéliales bénignes, c'est qu'ils sont polarisés de telle sorte que le cytoplasme apical est vers le lumen et le cytoplasme basal repose sur la membrane basale. Cette polarité apico-basale est perdue dans les carcinomes du sein invasifs, qui sont caractérisées par une désorganisation cellulaire et la formation de l'anastomose et de ramification tubules qui s'infiltre au hasard le stroma environnant. Ces différences histopathologiques entre glande bénigne et le carcinome invasif peuvent être reproduits en 3D ^6,7. Utilisation des lecture-out appropriées comme la quantification de simples structures acineuses rondes, ou l'expression différentielle des marqueurs moléculaires validées pour la prolifération cellulaire, la polarité et l'apoptose en combinaison avec d'autres techniques de biologie moléculaire et cellulaire, cultur 3De peut fournir un outil important pour mieux comprendre les changements cellulaires au cours de la transformation maligne et de la délimitation de la signalisation responsable.

Introduction

Trois culture tridimensionnelle (3D) de cellules épithéliales mammaires sur la membrane basale reconstituée est un important système modèle pour étudier le phénotype et le complexe de signalisation associée sein normal et le cancer du sein ^2,3. L'unité fonctionnelle du sein est l'unité lobulaire conduit terminal (TDLU) qui se compose d'un petit conduit qui se ramifie en acini. Les acini sont des structures hautement organisées, composées de deux couches de cellules, les cellules épithéliales et myoépithéliales, qui sont entourés par une membrane basale ^5. Les caractéristiques les plus distinctives des acini normaux sont polarisation cellulaire, l'attachement à la membrane basale sous-jacente et les contacts cellule-cellule spécialisés. Cette organisation complexe est perturbé dans les carcinomes invasifs. Les cultures 2D largement utilisés, où les cellules sont cultivées en monocouche, ne permettent pas la formation d'acini. Ainsi, la culture monocouche manque en proposant un système pour capturer la relation complexe entre les cellules épithélialesdans le sein normal et leur dérégulation dans le cancer du sein. Cultures épithéliales monotypique fonctionnelles des cellules mammaires ont été développés dans plusieurs laboratoires ^2,3. Culture 3D implique la croissance des cellules mammaires sur Matrigel, qui est un extrait solubilisé dérivé de cellules de sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm et est disponible dans le commerce. D'autres substrats 3D comme le collagène I sont également utilisés. Les cellules du sein peuvent être cultivées en 3D 3D par dosage incorporé, où les cellules sont mises en culture dans du Matrigel embarqué ^2. Alternativement, les cellules peuvent être cultivées en 3D sur test, aussi appelé test de superposition 3D, qui est rentable car elle nécessite moins de volume de Matrigel et facilite la surveillance en temps de déchéance de la formation de colonies par imagerie à contraste de phase et est idéal pour l'imagerie in situ ^{2 -3.} Le 3D-dessus essai a été utilisé pour définir la corrélation entre le phénotype et acineuses profil d'expression génique ^7.

Culture 3D peut être effectively utilisé pour distinguer les cellules normales et bénignes de cancer invasif. Les cellules normales et bénignes du sein constituent croissance arrêté structures polarisées avec une lumière bien définis dans le centre sur Matrigel tandis que les cellules de carcinome invasif poussent abondamment et au hasard sans compensation de la lumière. E6/E7 immortalisé des cellules épithéliales mammaires humaines et lignée cellulaire MCF10A, qui est une lignée cellulaire immortalisée spontanément isolée d'un patient de 36 ans avec des changements fibrokystique, ont été utilisés avec succès pour retrouver le phénotype bénigne du sein en 3D et ^3,8 ont servi un système modèle pour étudier la fonction de suppresseur de tumeur oncogène et de plusieurs molécules ^8,9. Ces cellules bénignes peuvent être conçues pour manipuler gène (s) d'intérêt par la mise en place de lentivirus / rétrovirus. Si le gène (s) d'intérêt est un gène suppresseur de tumeur, shRNA knockdown médié va conduire à une transformation maligne alors que si le gène d'intérêt est une surexpression de l'oncogène dans des cellules bénignesdevrait montrer un phénotype malin. Dans les deux cas, les structures acineuses formées en 3D peuvent capturer la transformation maligne.

Cellules individuelles bénignes plaqués en 3D commencent à proliférer et former autour des structures sphériques. 5-8 jours par cet agrégat sphérique de cellules se différencier en une couche entourant polarisée de cellules qui est en contact avec le Matrigel, et une masse interne de cellules polarisées moins, qui manquent de contact avec le Matrigel. Dans les 10-15 prochains jours les cellules internes vont commencer à mourir par apoptose formant une lumière claire. Les cellules malignes se développeront perdre au hasard de leur polarité. Cellules hautement malignes forment habituellement structures de branchement. Ces différences dans le phénotype peuvent être capturés par temps imagerie en contraste de phase de déchéance et in situ par immunomarquage avec des marqueurs moléculaires pertinents. Les marqueurs les plus couramment utilisés sont les alpha 6-intégrine, un marqueur de la polarité de la base, en combinaison avec le marqueur de prolifération phospho-histone 3 et la apoptotmarqueur ic caspase-3. Ce dernier point est important de déterminer si il ya formation lumen dans le centre de la acini, une caractéristique des cellules normales et bénignes du sein. D'autres marqueurs de polarité et de contact cellule-cellule comprennent GM130, la laminine, ERM, la E-cadhérine. Alternativement les lignées cellulaires de cancer du sein peuvent être conçues pour manipuler le gène d'intérêt. Dans ce cas, le retour à un phénotype plus bénin arrêté la croissance peut être utilisé comme une lecture à distinguer du phénotype du cancer.

Culture 3D peut également être utilisée avec précaution pour délimiter les voies de signalisation impliquées dans la transformation maligne ^{de 10 à 11.} Utilisation de l'mentionnés ci-dessus se lit en inhibiteurs pharmacologiques, des anticorps bloquants ou des protéines recombinantes peut être utilisé être identifier à la signalisation moléculaire conduisant à la transformation maligne. Avec la poursuite des efforts de différents laboratoires, il est possible d'extraire les cellules de la 3D à isoler l'ARN et également préparer des lysats pour immuno et immuniténoprecipitation. Ces stratégies sont décrites dans un pas à pas et de manière détaillée dans le protocole.

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Protocole

1. Préparation du matériel et de la culture des médias

1. Facteur de croissance dégel réduite (GFR) Matrigel à 4 ° CO / N.
2. Réchauffez médias complètes pour la lignée cellulaire nécessaire à 37 ° C. MCF10A-ATCC spécifié médias; F-12 du milieu de HME-Ham supplémenté avec 5% de sérum de veau fœtal, 1 ug / ml d'hydrocortisone, 5 ng / ml d'insuline, 10 ng / ml de facteur de croissance épidermique, et la toxine du choléra 100 ng / ml; F-12 les médias SUM 149-Ham additionné de 5% de FBS, 2 pg / ml d'hydrocortisone et 5 ug / ml d'insuline; et MDA-MB-231-10% FBS-DMEM
3. Prérefroidir une chambre diapositive 8 de bien sur la glace.
4. Préparer tissu capot et fournitures culture.

2. Trois dimensions de la culture en Chambre de 8 puits diaporama

1. Manteau de chaque puits de la diapositive 8 puits avec 40 pi de GFR Matrigel. Ajouter le Matrigel dans le centre de la diapositive et s'est ensuite propagée à l'aide d'une pipette P200. Essayez de répartir aussi équitablement que possible, en évitant les bulles et, étalée qui peut conduire àformation de ménisque.
2. Incuber les lames à 37 ° C sous 5% de CO _2. Alors que le Matrigel se solidifie, trypsiniser les cellules, recueillir et tourner à 150 xg dans le tissu de la culture centrifugeuse pendant 4 min.
3. Compter les cellules et diluer à 12 500 cellules / ml dans du milieu complet de la ligne de cellule respective. Ajouter GFR Matrigel à 2% et ajouter 400 ul à chaque puits d'une lame de chambre de pré-revêtue de Matrigel.
4. Incuber les lames dans le CO ₂ incubateur. Donner de nouveaux changements de médias complets chaque 4 ^e jour jusqu'à 15 jours.
5. Le traitement avec des inhibiteurs pharmacologiques: Pour les études d'inhibiteur ajouter des inhibiteurs de petites molécules pour le milieu complet au moment de placage suivie par des changements fraîches de médias supplémenté avec les inhibiteurs de tous les trois jours, tandis que la croissance des cellules sur Matrigel GFR.
6. Le traitement avec la protéine purifiée:
   1. Plaquer les cellules suivant les étapes 2.1 à 2.3. Permettre aux cultures de se développer pendant 4 jours, puis par starvati sériquespendant 16 heures.
   2. Au jour 5, traiter les cellules avec une concentration appropriée de protéine purifiée dans 0,1% de FBS complété médias pour les cellules privées de sérum. Donnez changement de milieu frais avec la protéine purifiée après 2 jours.
   3. Au jour 10 de remplacer le milieu conditionné avec des milieux complets HME. Permettre aux cultures de croître pendant encore 5 jours.
7. Immunofluorescence des structures acineuses cultivées sur Matrigel:
   1. Préparer 2% de paraformaldehyde, 0,5% de Triton X-100 et de la glycine 100 mM dans 1 x PBS, pH 7,4. Préparer le tampon d'immunofluorescence (IF tampon) qui comprend de 1 x PBS contenant 0,1% d'albumine de sérum bovin, 0,2% de triton X-100, 0,05% de Tween-20.
   2. Utiliser un embout de pipette P200 pour aspirer soigneusement le milieu conditionné.
   3. Fixer les structures acineuses avec 2% de paraformaldehyde fraîchement préparé à la température ambiante (RT) pendant 20 min.
   4. Perméabiliser les cellules avec 0,5% de Triton X-100 pendant 10 min à 4 ° C.
   5. Laver la cultures trois fois avec 100 mM de glycine, de 10 à 15 min pour chaque lavage.
   6. Bloquer les cellules avec 10% de sérum de chèvre dans un tampon, appelé bloc primaire, pendant 1 heure à température ambiante.
   7. Incuber les cultures avec un anti-souris 20 pg / ml de chèvre F (ab ') _2, fragment dans un tampon de bloc primaire pendant 30 min. Cette étape est importante pour bloquer les espèces d'IgG de souris immunoréactives dans le Matrigel.
   8. Incuber avec l'anticorps primaire dans la seconde solution de blocage (bloc primaire 20 pg / ml d'anticorps de chèvre anti souris F (ab ') 2 fragment) O / N à 4 ° C.
   9. Laver trois fois avec un tampon IF pour 10-15 min chacun avec doux balancement.
   10. Incuber avec des anticorps secondaires conjugués fluorescents dans un tampon pour 45 min.
   11. Laver pendant 3x pendant 10 min chacun avec un tampon IF avec doux balancement.
   12. Monter les lames avec le réactif anti-fade contenant DAPI pour visualiser les noyaux.
   13. Laisser sécher les lames O / N à la température ambiante.
   14. acquisition de l'image: Acquérir les images confocale au km de la coloniedsection de cellules cultivées sur le dessus de Matrigel. Pour plus d'informations acquérir une série de sections optiques sur toute la longueur de la structure de cellules acineuses par Z empilage.

3. Trois dimensions de la culture dans 2 puits Chambre diapositives pour Immunoblotting

1. Prérefroidir une chambre diapositive 2 de bien sur la glace. Suivez les étapes 2.1-2.4 l'extension des réactifs pour la 2-bien diapositive par exemple manteau de chambre avec 160 ul de Matrigel et ajouter 1,6 ml de cellules / Matrigel mélanger dans chaque puits de la lame 2 puits.
2. Récolter les structures acineuses du Matrigel en utilisant le kit de récolte des cellules de culture 3D disponibles dans le commerce en suivant les instructions du fabricant.
3. Diluer le lavage de la cellule et de récolte de cellules tampons à 1x et prérefroidir à 4 ° C. Le lavage et le délogement de Matrigel doivent être effectuées sur de la glace.
4. Laver les structures acineuses 3x à l'aide du tampon de lavage des cellules.
5. Recueillir les acini en tubes de 15 ml à centrifuger en utilisant bu de récolte de cellulesffer suivie d'une incubation de 30 min sur un agitateur à 4 ° C. Mélangez bien avec une suspension pipette de 1 ml. Cela va rompre le Matrigel en petits morceaux et libérer la plupart des cellules dans le tampon de la récolte des cellules.
6. Sédimenter les cellules à 200 xg dans une centrifugeuse de culture. Retirer la couche flottante d'hydrogel de le culot cellulaire avec une pointe de pipette P200.
7. Remettre en suspension les lysats dans un tampon d'échantillon SDS fournies avec le kit. Tampon de lyse RIPA peut également être utilisé.

4. Quantification de vs malin phénotype du sein bénigne

1. Cultiver les cellules en triple pour chaque ensemble de traitement suivant les étapes 2.1 à 2.4.
2. Prendre des images de contraste de phase des structures acineuses de chaque puits à 5X ou 10X résolution en utilisant un microscope à contraste de phase fixée à un levier de vitesses de glissement et un ordinateur. Prendre les images en déplaçant le coulisseau d'une trame à l'autre et couvrant la totalité du puits de la lame ainsi chambré.
3. Compter le nombre total de structures acineuses,le nombre de simple acini plat rond et le nombre de structures multiacinar ou des structures de plus en plus au hasard manquent d'organisation et de processus de branchement qui en découlent.
4. Calculer le pourcentage de simples structures acineuses plat rond vs structures malignes et l'intrigue que le graphique de la colonne. Calculer la signification par le test t de Student.

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Résultats

Culture 3D peut être efficacement utilisé pour différencier le phénotype malin des cellules épithéliales mammaires humaines du sein bénigne. Cellules bénignes simples plaqués sur Matrigel poussent comme des structures sphériques organisés qui peuvent facilement être imagés comme unique acini plat rond dans un plan en utilisant l'imagerie de contraste de phase. Les cellules malignes simples plaqués sur Matrigel poussent au hasard, montrent très haut indice de réfraction et sont difficiles à l'ima...

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Discussion

Nous avons décrit ici la culture tridimensionnelle de cellules épithéliales mammaires sur une membrane basale reconstituée, et l'utilité de ce système par rapport à la différence entre le phénotype malin bénigne du sein. Ce système peut également être utilisé pour la culture de différents types à partir d'autres tissus glandulaires cellulaires et a été rapporté comme ayant été utilisé avec succès pour la culture épithéliale prostatique, l'épithélium bronchique, et les cellules épi...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth Factor Reduced Matrigel	BD Biosciences	354230	Avoid repeat freeze thaw
Lab-Tek glass hamber slides 8-well	Thermo Fisher Scientific	177402	Precool on ice
Lab-Tek glass chamber slides 2-well	Thermo Fisher Scientific	177380	Precool on ice
Goat anti mouse F(ab´)2 fragment	Jackson Immunoresearch	115-006-006
Normal goat serum	Jackson Immunoresearch	005-000-121
Fluorescent conjugated Alexa antibodies	Molecular Probes		Please look at molecular probes website
Prolong gold antifade reagent with DAPI	Molecular Probes	P36935
3D Culture Cell Harvesting kit	Trevigen	3448-020-k
Anti-Apha-6-integrin	Fisher Scientific	MAB1378	1:100 dilution for IF
Anti-GM130	BD Biosciences	610822	1:100 dilution for IF
Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated	Fisher Scientific	16-222	1:100 dilution for IF
Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175)	Cell Signaling	9661s	1:50 dilution for IF
Anti-E-cadherin	BD Biosciences	610181	1:200 dilution for IF