Évaluation de la régénération vasculaire dans le SNC Utilisation de la rétine de souris

Résumé

La rétine de rongeur a depuis longtemps été reconnue comme une fenêtre accessible au cerveau. Dans ce document technique que nous fournissons un protocole qui utilise le modèle de souris de la rétinopathie induite par l'oxygène d'étudier les mécanismes qui conduisent à l'échec de la régénération vasculaire dans le système nerveux central après lésion ischémique. Le système décrit peut également être mise à profit pour explorer des stratégies pour favoriser la repousse des vaisseaux sanguins fonctionnels au sein de la rétine et du système nerveux central.

Résumé

La rétine de rongeurs est peut-être le système de mammifère la plus accessible qui pour enquêter interaction neurovasculaire dans le système nerveux central (SNC). Il est de plus en plus reconnu que plusieurs maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer, la sclérose en plaques, sclérose en plaques et éléments présents latérale amyotrophique de compromis vasculaire. En outre, les causes les plus importantes de cécité chez les populations pédiatriques et en âge de travailler (rétinopathie du prématuré et de la rétinopathie diabétique, respectivement) sont caractérisées par une dégénérescence vasculaire et l'échec de la repousse vasculaire physiologique. Le but de ce document technique est de fournir un protocole détaillé pour étudier la régénération du SNC vasculaire dans la rétine. Le procédé peut être utilisé pour élucider les mécanismes moléculaires qui conduisent à une défaillance de la croissance vasculaire après une lésion ischémique. En outre, les modalités thérapeutiques potentiels pour accélérer et restaurer plexus vasculaires sains peuvent être explorées. Les résultats obtained en utilisant l'approche décrite peut fournir des pistes thérapeutiques pour les rétinopathies ischémiques telles que celle du diabète ou de prématurité et de bénéficier éventuellement d'autres troubles vasculaires du SNC.

Introduction

Tout au long de développement du système nerveux central, des nerfs, des cellules immunitaires et des vaisseaux sanguins établir des réseaux remarquablement couplés pour assurer une perfusion tissulaire suffisante et permettre la transmission de l'information sensorielle ^5.1. La ventilation des résultats des systèmes vasculaires de l'oxygénation insuffisante des tissus et de l'offre de compromis métabolique et est de plus en plus reconnu comme un facteur important dans la pathogenèse des maladies neurodégénératives ^6. Abandon vasculaire et la détérioration de l'unité neurovasculaire dans le cerveau, par exemple, est associé à la démence vasculaire, lésions vasculaires de la substance blanche du cerveau ⁷ et la maladie d'Alzheimer avec une sténose des artérioles et des petits vaisseaux ^8. En outre, la fonction vasculaire altération de la barrière est pensé pour contribuer sclérose en plaques ⁹ et la sclérose latérale amyotrophique ^10.

Un intérêt direct pour le modèle de la rétine décrite dans ce protocole, aveuglantedes maladies telles que la rétinopathie diabétique et la rétinopathie de la ¹¹ prématurité ^{12, 13} sont caractérisés par une phase de dégénérescence vasculaire précoce. La contrainte ischémique qui a suivi sur la rétine neuro-vasculaire déclenche une deuxième phase de la néovascularisation excessive et pathologique qui provient probablement comme une réponse compensatoire de rétablir la oxygène et de l'énergie ^14-16. Une stratégie intéressante pour surmonter le stress ischémique qui est au cœur de la progression de la maladie est de rétablir les réseaux vasculaires fonctionnelles en particulier dans les zones ischémiques du neuro-rétine (figures 2 et 3). Provoquer une réponse angiogénique contrôlée peut apparaître comme contre-intuitif pour une condition dans laquelle les traitements anti-angiogéniques tels que des anti-VEGF sont considérés comme des traitements adaptés. Pourtant, la preuve de la validité de cette approche est de montage. Par exemple, l'amélioration de la repousse vasculaire "physiologique-like" dans ischemrétinopathies ic a été élégamment démontré par l'introduction de précurseurs de cellules endothéliales ^17, l'inhibition de Müller VEGF exprimés cellule-régulation négative induite par d'autres facteurs angiogéniques ^18, l'injection de progéniteurs myéloïdes ^19, l'inhibition de la NADPH oxydase induite par l'apoptose ^20, ce qui augmente l'alimentation ω-3 gras polyinsaturé l'apport d'acide ^21, le traitement avec un fragment carboxy-terminal de tryptophane ²² ARNt synthétase, et l'administration directe de VEGF ou le FGF-2, pour la protection des cellules gliales ^23. De plus, nous avons démontré que la modulation de signaux de guidage neuronales classiques tels que Sémaphorines ou Nétrines dans les rétinopathies ischémiques vasculaire accélère la régénération des vaisseaux sains à l'intérieur de la rétine et réduit l'angiogenèse pathologique ^{24, 25} en conséquence. De pertinence clinique directe, plusieurs des études sur les animaux mentionnés ci-dessus fournissent des preuves que la promotion de re vasculairegénération pendant la phase ischémique précoce des rétinopathies peut réduire considérablement menaçant la vue néovascularisation pré-rétinienne ^{19, 23, 24, 26,} probablement grâce à la réduction de la charge ischémique.

L'élaboration de stratégies thérapeutiques qui stimulent la régénération des vaisseaux fonctionnels demeure un défi important pour les biologistes vasculaires. Ici, nous décrivons un système expérimental qui utilise le modèle de souris de rétinopathie induite par l'oxygène (OIR) pour explorer des stratégies pour moduler la repousse vasculaire dans la rétine. Développé par Smith et al., En 1994 ^27, ce modèle sert de proxy pour les rétinopathies prolifératives humaines et consiste à exposer les petits P7 de souris à 75% d'O ₂ jusqu'à P12, puis réintroduire les chiots à la salle ambiante O _2-tension (Figure 1). Ce paradigme imite vaguement un scénario où un enfant prématuré est ventiléavec O _2. L'exposition des souriceaux à hyperoxie provoque la dégénérescence des capillaires rétiniens et microvasculaire, et donne une zone de reproduction de vaso-oblitération (VO) généralement évalué à la sortie de O ₂ à P12, même si la superficie maximale de VO est atteinte à 48 h (P9) après exposition à O ₂ ^28. Chez la souris, les zones de VO avasculaires régénérer spontanément au cours de la semaine suivant la réintroduction de l'air ambiant et, éventuellement, des zones VO sont complètement re-vascularisées (figure 2). Réintroduction de l'air ambiant de souris soumises à OIR provoque également la néovascularisation pré-rétinienne (NV) (maximale à P17) qui est généralement évaluée afin de déterminer l'efficacité des paradigmes de traitement anti-angiogéniques. Dans sa forme la plus pure, le modèle de ROC est un outil hautement reproductible et quantifiable pour évaluer la dégénérescence vasculaire induite par l'oxygène et de déterminer l'étendue de la destruction néovascularisation pré-rétinienne ^29-31.

Divers paradigmes de traitement exploratoires qui modulent la régénération du SNC vasculaire peut être étudiée en utilisant le modèle de ROC y compris l'utilisation de composés pharmacologiques, thérapie génique, une délétion du gène et plus. La propension d'une approche donné pour influencer la repousse vasculaire est évaluée par étapes dans la fenêtre entre P12 (VO maximale après la sortie de l'hyperoxie) et P17 (de NV maximale). Évaluation des résultats du traitement sur ​​NV pathologique peut être rapidement et facilement déterminée en parallèle et a été décrite en détail par Stahl et ses collègues ^{30, 31.} Ici, nous fournissons une procédure simple étape par étape pour étudier la modulation de revascularisation physiologique dans la rétine neurale par des composés pharmacologiques, thérapeutiques potentiels, vecteurs viraux ou d'étudier l'influence de gènes candidats chez des souris transgéniques ou knock-out.

Protocole

Déclaration éthique: Tout l'expérimentation animale est conforme aux directives de protection des animaux établies par l'Association pour la recherche en vision et en ophtalmologie (ARVO) Déclaration pour l'utilisation d'animaux dans ophtalmique et Vision Research et le Conseil canadien de protection des animaux.

1. Oxygène induit la rétinopathie (OIR)

1. Enregistrer la date de naissance de souriceaux que P0.
2. Enregistrer tous les poids des animaux lors de l'entrée en O ₂ pour assurer une gamme de poids adéquat. Remarque: Pour C57BL / 6 à P17, le poids corporel doit être comprise entre 5 et 7,5 g pour NV maximale ^32. Afin de maintenir la cohérence de l'environnement, il est recommandé d'utiliser la même portée que le contrôle (pour les souris génétiquement modifiées ainsi que les souris recevant des traitements expérimentaux). Lors de l'évaluation des effets d'un vecteur viral, il faut considérer le tropisme du virus et laisser suffisamment de temps pour la pleine expression de transgènes d'origine virale livrés. Viral exprimant rapidementvecteurs tels que les lentivirus 3 ^e génération ^{24, 25, 33} sont recommandés.
3. Chiots Lieu de souris à P7 (C57BL / 6 ou souhaité souche) et CD1 favoriser mère dans une chambre à oxygène fixé à 75% d'O ₂ pendant 5 jours ^27. L'humidité ambiante et la température ont été maintenues constantes tout au long de l'exposition O _2. Remarque: Les installations de recherche équipés d'une source centrale d'O ₂ sont idéales et limitent le remplacement lourde de vide O ₂ réservoirs. Si l'on travaille avec des souris transgéniques ou knock-out, il est important de veiller à ce que le contrôle et les souris expérimentales sont acquis auprès du même fournisseur de limiter les dérives génétiques dans les mêmes souches ^{30, 29.}
4. À P12, les souris retirer de la chambre de l'oxygène et de revenir à la température ambiante animaux O _2.

2. Injection intravitréenne de livraison des composés de la rétine interne (WhEffets en Évaluation d'un composé pharmacologique ou protéine recombinante)

1. À P14, anesthésier les souris avec 2% d'isoflurane dans de l'oxygène de 2 L / min (ou à la protection des animaux anesthésique de choix comité approuvé). Afin de vérifier l'efficacité de l'anesthésie, pincer successivement la queue, pied arrière et l'oreille avec une pince.
2. Placez la souris sur le ventre.
3. L'utilisation d'un 10 ul seringue stérile munie d'une aiguille tirée verre biseauté, effectuer une injection d'un volume maximal de 1 pl de solution contenant le composé objet de l'enquête ou du véhicule (solution saline physiologique) au niveau du limbe postérieur de l'oeil, avec un 45 ° angle d'éviter la lentille. Remarque: Le verre-aiguille tirée est fixée à la seringue en utilisant une goutte de résine époxy.
4. Appliquer une goutte de pommade ophtalmique lubrifiant (de préférence avec un antibiotique) avec un tampon à l'oeil de la souris.
5. Retour de la souris vers la cage avec la promotion de la mère. Les souris sont ensuite soigneusement surveillés jusqu'à recouverte et entièrement ambulatoire.

3. Évaluation de la perfusion du navire et de la fonction barrière (intégrité) par angiographie à la fluorescéine

1. Anesthésier les souris avec 2% d'isoflurane dans de l'oxygène de 2 L / min (ou à la protection des animaux anesthésique de choix comité approuvé). Afin de vérifier l'efficacité de l'anesthésie, pincer successivement la queue, pied arrière et l'oreille avec une pince. Note: Ceci est généralement effectuée au P17 lorsque la régénération est évaluée. Porter-out également l'analyse à P19 et P21 pour déterminer si l'intégrité vasculaire est conservé au fil du temps.
2. Une fois anesthésié, peser la souris.
3. Faire une incision médiane de l'abdomen avec des ciseaux de dissection. Remarque: Instruments de dissection doivent être régulièrement vérifiés et affûtés.
4. Couper les côtes latéralement et soulever la cage thoracique à l'aide d'une pince. Remarque: Il est nécessaire de couper que latéralement que possible pour éviter des dommages au coeur.
5. Après avoir retiré peripheral tissus du coeur, pince l'aorte descendante avec des pinces hémostatiques.
6. Injecter lentement la fluorescéine-dextran dans le ventricule gauche à l'aide d'une aiguille G 25. Remarque: Si la fonction de barrière vasculaire est étudiée, 70 kDa fluorescéine-dextran est utilisé comme il fuira des navires lorsque l'intégrité du navire est compromise. Si l'enquêteur veut jeter les vaisseaux sanguins, 2 Mda fluorescéine-dextran est utilisé. Les étapes critiques: 1) Pour assurer une répartition homogène, centrifugeuse fluorescéine-dextran et injecter le surnageant, 2) Afin de prévenir la constriction des vaisseaux, injecter la solution de fluorescéine-dextran réchauffé, 3) Le temps de circulation ne devraient pas l'excès de 4 min.
7. Décapiter souris 2 min après l'injection avec des ciseaux d'exploitation.

4. Énucléation des yeux et de fixation

Remarque: Lors de l'évaluation des taux de régénération vasculaire, d'abord recueillir des rétines à P12 et P14 et en outre au P17. Augmenter le nombre de point de temps échantillonnés pour une détermination plus précise des taux de revascularisation ^24.

1. Incliner la tête de la souris et placez-le sur le côté.
2. Enlever la peau et les paupières couvrant l'œil en utilisant des ciseaux de dissection.
3. Placez la pince courbes ci-dessous l'oeil et tirez-le doucement jusqu'à ce que le nerf optique est coupée.
4. Tournez la tête de la souris sur son autre côté et effectuer les mêmes étapes (étapes 4.2 et 4.3).
5. Afin d'assurer une meilleure pénétration de fixateur, percer un trou dans la chambre antérieure de l'oeil en utilisant aiguille G 30.
6. Transfert yeux dans un tube contenant 4% de paraformaldéhyde (PFA) et le fixer pendant 1 heure à température ambiante.
7. Retirer PFA et laver les yeux 4 fois avec une solution de PBS glacé.

5. Dissection de la rétine

1. Placez les yeux de souris dans une boîte de Pétri contenant du PBS froid et effectuer la dissection des rétines sous un stéréomicroscope.
2. Retirez la graisse supplémentaire / tissu entourant l'oeil avec micro-dissection sciencessors.
3. Coupez la cornée avec des ciseaux micro-dissection.
4. L'utilisation de deux paires de pinces, éplucher minutieusement la sclérotique loin de la périphérie vers le nerf optique et jeter.
5. Pincez la lentille (boule blanchâtre en dessous de la cornée) avec une pince et l'extraire de l'œilleton. Utilisez une paire de pinces comme un support, et l'autre pour saisir et soulever soigneusement et retirez l'objectif.
6. Détachez les navires hyaloïde de la face interne de la rétine à l'aide de petites brosses (taille 0) et des pinces.
7. Retirer des faisceaux de vaisseaux hyaloïde connectés au disque optique en utilisant une pince.
8. Transfert disséqué rétines à 2 tubes ml à centrifuger contenant du PBS et placer sur la glace avant de commencer la procédure de coloration.

6. Vasculaire rétinienne coloration

1. Incuber les rétines disséqués pendant une nuit sous agitation douce à 4 ° C dans une solution de fluorescence couplée-isolectine B4 (rhodamine-lectine ou autre) dans du PBS contenant 1 mM CaCl _2, (1:100 dilution d'une solution à 2 mg / ml isolectine B4 est recommandé). Au cours de la procédure de coloration ensemble, couvrir tubes avec du papier d'aluminium ou une feuille opaque pour protéger de la lumière.
2. Le lendemain, éliminer la solution colorante et laver rétines 3x dans du PBS pendant 10 min à température ambiante.

7. Préparation de la rétine Flatmounts

1. Transfert rétines, photorécepteur côté vers le bas, sur une lame de microscope et faire quatre incisions radiales équidistantes profondes à l'aide d'un scalpel pour diviser la rétine en quatre quadrants de taille égale. Au cours des incisions, de bloquer la rétine avec une brosse de sorte qu'il ne se déplace pas.
2. L'utilisation de deux brosses trempées dans du PBS, aplatissez soigneusement quadrants photorécepteur tête en bas et plonger la rétine en milieu de montage pour empêcher photo-blanchiment. Ensuite, placer soigneusement une lamelle sur la surface de la rétine monté sans pression et faire en sorte que les bulles d'air ne s'accumulent pas sous la lamelle.

8. Imagerie et la quantification des Vasoobliteration (VO) et la néovascularisation (NV) comme décrit précédemment ³¹

1. Prenez des photos de toute montés rétines avec un microscope à épifluorescence à un grossissement de 10X.
2. Ouvrez l'image rétinienne au logiciel de retouche photo, assembler et mesurer la superficie total de la rétine, et la zone avasculaire. Zone peut être exprimée en pixels.
3. Déterminer l'étendue de VO en divisant le nombre de pixels dans la zone avasculaire par le nombre de pixels dans la zone de la rétine totale.
4. Déterminer l'étendue de la SA en divisant le nombre de pixels de NV par le nombre de pixels dans la zone de la rétine totale comme décrit ^31.

Résultats

Le modèle de ROC est largement utilisée pour étudier la dégénérescence vasculaire induite par l'oxygène et l'ischémie induite par la néovascularisation pathologique dans la rétine et a joué un rôle dans le développement de traitements anti-angiogéniques actuellement utilisés pour les maladies oculaires ^{27, 29, 30.} Les résultats obtenus à l'aide de ce modèle peuvent être plus ou moins extrapolés à rétinopathies ischémiques telles que la rétinopathie diabétique proliférante...

Discussion

Quel est le moyen le plus efficace pour stimuler la croissance de nouveaux vaisseaux sains dans les tissus nerveux ischémique? Est-il thérapeutique valable pour intervenir et accélérer naturels repousse vasculaire? Dans les pathologies neuro-ischémiques telles que les rétinopathies ischémiques ou accident vasculaire cérébral, la dégénérescence vasculaire est associée à la fonction neuronale réduite ^35-38. Par conséquent, pour contrer blessure précoce, rétablir la micro-circulation régionale...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6 mice (Other strains may be used; angiogenic response varies from one strain to the other)
CD1 nursing mothers	Vendor of choice
Operating Scissors straight	World Precision Instruments	14192
Dissecting Scissors straight	World Precision Instruments	14393
Vannas Eye Scissors	Harvard Apparatus	72-8483
Iris Forceps, curved, serrated	World Precision Instruments	15915
Brushes 362R size 0	Dynasty
Dumont Forceps #3; straight	World Precision Instruments	500338
Surgical Blade, size 10	Bard-Parker	371110
Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I	Vector Laboratories, Inc	RL-1102
Microscope slides	VWR	16004-368
Fluoromount G	Electron Microscopy Sciences	17984-25
Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Phase and Fluorescence Microscope	Zeiss
Leica MZ9.5 Stereomicroscope	Leica
Fluorescein isothicyanate-dextran, 70000	Sigma-Aldrich	46945