Sonication facilitée immunofluorescence de phase tardive embryonnaire et larvaire<em&gt; Drosophila</em&gt; tissus<em&gt; In Situ</em

Résumé

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

Résumé

Les études réalisées chez Drosophila melanogaster embryons et des larves donnent un aperçu essentiel dans les processus de développement tels que la spécification du destin cellulaire et l'organogenèse. Immunomarquage permet la visualisation de tissus et organes en développement. Cependant, une cuticule protectrice qui se forme à la fin de l'embryogenèse empêche la pénétration des anticorps dans des embryons à un stade avancé et des larves. Bien que la dissection avant immunomarquage est régulièrement utilisé pour analyser les tissus des larves de drosophile, il s'avère inefficace pour certaines analyses parce que les petits tissus peuvent être difficiles à localiser et isoler. Le traitement par ultrasons offre une alternative à la dissection dans les protocoles de larves de drosophile immunomarquage. Il permet d'obtenir rapidement un traitement simultané d'un grand nombre d'embryons à un stade avancé et des larves et maintient la morphologie situ. Après fixation dans le formol, un échantillon est soumis à une sonication. L'échantillon est ensuite soumis à une coloration immunologique spécifique de l'antigène avec ant primaireet ibodies Anticorps secondaires marqués par fluorescence pour visualiser types de cellules cibles spécifiques et des protéines par microscopie de fluorescence. Au cours du processus de sonication, une mise en place correcte de la sonde de sonication ci-dessus de l'échantillon, ainsi que la durée et l'intensité de la sonification, est critique. Modifications mineures supplementaires aux protocoles d'immunomarquage standard peuvent être nécessaires pour les taches de haute qualité. Pour les anticorps ayant un faible rapport signal à bruit, de plus longs temps d'incubation sont typiquement nécessaires. Comme une preuve de concept pour ce protocole de traitement par ultrasons facilitée, nous montrons immunomarquages ​​de trois types de tissus (testicules, ovaires, et des tissus neuronaux) à une série de stades de développement.

Introduction

Embryons de drosophile et les larves fournissent un excellent modèle pour étudier les processus de développement dans de nombreux organes et tissus. L'imagerie de cellules individuelles est souvent nécessaire dans ces études afin de déterminer les milieux complexes dans lesquelles les cellules se développent. La visualisation des cellules dans les tissus peut être réalisée par coloration immunologique. Bien décrits immunomarquage protocoles existent pour les tissus embryonnaires de drosophile <17 h après la ponte (AEL) ^1-3. Cependant, une protection formes de la cuticule vers la fin de l'embryogenèse, empêchant la pénétration d....

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Protocole

1: Préparation d'une cage de collecte

1. Anesthésier les jeunes, les mouches fertiles avec du CO _2. Transfert mouches anesthésiés dans une cage. Pour obtenir un rendement optimal, utilisez 100-120 mouches adultes allant de 2-7 jours d'âge à un ratio de 4: 1 femmes-hommes. Laisser vol une période d'acclimatation appropriée, ~ 24 heures avant d'obtenir l'échantillon pour la fixation. Si la cage a été mis en place avec des femelles vierges accouplées à des mâles, une utilisation de 36 - période d'acclimatation de 48 h.
2. Sur l'extrémité ouverte de la cage, placer une plaque de gélose de jus de pommes préalablement p....

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Résultats

Pour démontrer l'efficacité de l'immunomarquage base ultrasons dans l'analyse de l'embryon à un stade avancé et les tissus des larves in situ, les embryons de type sauvage et des larves ont été traitées pour immunomarquage des testicules, des ovaires, et le tissu neural. Les échantillons ont été imagées par microscopie à foyer commun et les résultats représentatifs sont présentés (figure 1 et figure 2). Les résultats montrent que le protocole d?.......

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Discussion

Ce protocole fournit un procédé pour cibler avec succès immunocoloration embryonnaire de Drosophila et tissus larvaires in situ, ce qui élimine la nécessité d'une dissection. Selon les protocoles antérieurs pour la coloration des embryons précoces ^1,2,3, la membrane chorionique est éliminé en utilisant 50% de javel (NaOCl). Les échantillons sont fixés dans du formol et du méthanol. Parce que la cuticule des larves provoque échantillon âgé de flotter, la totalité de l'.......

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1: Reagents and Buffers
Phosphate buffer Triton X-100 (PBTx)			For 5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Store at RT.
Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X)			For 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4. Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 °C.
Triton 10%			For 50 ml: 5 ml of Triton, 5 ml of PBS 10X, 45 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT.
PEMS			0.1 M Pipes (pH 6.9), 2.0 mM MgSO4, 1.0 mM EGTA. Store at RT.
Pipes			For a 400 ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH. Dissolve Pipes in 300 ml dH2O and then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 ml with dH2O and autoclave. Store at RT.
Formaldehyde			37% formaldehyde by weight in methanol. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Heptane		CAS 142-82-5	n-Heptane. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Methanol		CAS 67-56-1	Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Phosphate buffer Tween (PBTw)			To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filter sterilize after adding all components. Store at 4 °C.
Tween 10%			For 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml of PBS 10X, 40 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT.
Bovine serum albumin/phosphate buffer Tween (BBTw)			To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g Bovine Serum Albumin (BSA). Add BSA then sterilize using a 0.2 μm vacuum filter unit. Store at 4 °C.
Normal goat serum (NGS)	ackson ImmunoResearch Laboratories	005-000-121	To make 10 ml: Normal goat serum 10 ml ddH2O. Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 μm syrninge filter. Store aliquots at -20 °C.
1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)		CAS: 281-57-9	To make 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), 2.5 g of DABCO solid, 3.5 ml 6N HCl, 250 μl 10N NaOH, 70 ml glycerol. In 250 ml beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10N NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 °C.
DABCO + p-phenylenediamine (PPD) solution			1.765 ml NaHCO3, 0.353 Na2CO3, 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 μl of PPD solution to 500 μl of DABCO. Store aliquots at -20 °C.
Apple juice plates			To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g granulated sugar (store bought), 500 ml apple juice (store bought), 15 ml Tegosept 10%, 1.5 ml ddH2O. Add agar to ddH2O in 4 L flask then autoclave for 30 min. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10 ml volumes into 35 mm petri dishes and let stand at RT to solidify. Store at 4 °C.
Tegosept 10%			To make 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml ethanol. Store aliquots at -20 °C.
Yeast paste			~50 g dry active yeast. Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 °C.
Table 2: Staining Materials
DAPI	Invitrogen	D3571	1:1000, stock at 5 mg/ml.
Rabbit anti-Vasa			1:250, a gift from Ruth Lehmann.
Mouse anti-Fasciclin III	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7G10	1:10
Mouse anti-1B1	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1	1:4
Guniea pig anti-Traffic Jam			1:2500, a gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003).
Mouse anti-Prospero	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Prospero MR1A	1:10
Rat anti-Elav	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7EBA10	1:30
mouse anti-Repo	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	8D12	1:10
Goat anti-rabbit Alexa546	Invitrogen	A11010	1:500
Goat anti-mouse Alexa488	Invitrogen	A11029	1:500
Goat anti-guniea pig Alexa633	Invitrogen	A21105	1:500
Goat anti-rat Alexa488	Invitrogen	A11006	1:500
Table 3: Materials and Equipment
Fly Cages	Hand-made; Genesee Scientific Corporation	Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101	Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.
Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier	Branson	Model: Branson Digital Sonifier 250
Sonicator probe	Branson	Model #: 102C (CE)	EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658
Syringe filter	Nalgene	190-25-20	0.2 μm cellulose, acetate membrane filter
Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software	Microscope: Olympus, Light source: Lumen Dynamics, Camera: Q-Imaging, Imaging Software: Intelligent Imaging Inc.		Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc, Light source: X-Cite 120Q, Camera: RETIGA-SRV, Imaging Software: Slidebook 5.0
Vacuum filter unit	Nalgene	450-0020	0.2 μm cellulose nitrate membrane filter