In Vitro agrégation essais utilisant la protéine tau hyperphosphorylée

Résumé

Protéines tau non modifiées et hyperphosphorylées ont été utilisés dans deux des essais in vitro de l'agrégation de révéler la cinétique d'agrégation rapide hyperphosphorylation-dépendante. Ces dosages ouvrent la voie à de futurs écrans composés qui peuvent moduler la propension de la protéine tau hyperphosphorylée pour former des fibrilles qui sous-tendent la progression de la maladie d'Alzheimer.

Résumé

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

Introduction

La maladie d'Alzheimer (MA) est une d'une grande collection de maladies neurodégénératives appelées tauopathies. La quintessence tauopathie pathologie sous-jacente est les enchevêtrements neurofibrillaires, NFT, dans les neurones, les astrocytes et la microglie ^1-4. La densité NFT corrélation avec déficience cognitive ^3,5 et neurone perte ^{de 6.} NFT contient la protéine tau hyperphosphorylée principalement (dénommé «p-tau" désormais) qui forme des filaments hélicoïdaux appariés ou droites (NP) de ^7,8. Tau est une protéine associée aux microtubules pensé pour faciliter le transport axonal qui est essentiel pour la signalisation neuronale et le trafic ^9,10. Chaque molécule de tau contient 2-3 phosphates dans le cerveau normal, mais le contenu phosphoryle augmente de plusieurs plis chez les patients tauopathie ^11. Kinases multiples sont susceptibles de contribuer à l'hyperphosphorylation de tau y compris GSK3ß (glycogène synthase kinase 3β) et CDK5 (cycline-dekinase pendant 5) ^12,13, mais la détente directe pour la phosphorylation pathologique reste insaisissable ^14. Phosphorylation anormale dans ou à proximité des motifs de liaison aux microtubules se dissocie de la protéine tau des microtubules ^15, et provoque une mauvaise localisation tau dans le compartiment somato-dendritique, où p-tau oligomérise en filaments hélicoïdaux appariés droites ou qui peuvent éventuellement se polymériser en inclusions NFT. Le lien étroit entre l'hyperphosphorylation de tau, la formation NFT, et la neurodégénérescence conduit à une hypothèse répandue que les enchevêtrements p-tau provoquent des réponses cytotoxiques apoptotiques et autres, et est donc la cause sous-jacente de la neurodégénérescence tauopathie ^16,17. écrans de médicaments et de tests cliniques précoces basés sur cette prémisse ont été lancés ^18. Cependant, cette hypothèse doit relever des défis ^19,20. Par exemple, SantaCruz et al. Ont montré que les fonctions cognitives des souris transgéniques peuvent être améliorées par la suppression de l'expression d'un mutanttau humaine, même si NFT continué à se former à partir de molécules tau existants ^21. Dans un modèle chez la drosophile, NFT a été montré pour séquestrer la protéine tau cytosolique toxique pour protéger les cellules neuronales ^22,23 sous-jacentes. De toute évidence, le rôle de la pathogenèse des NFT, le cas échéant, aura un grand impact la direction du développement des thérapies tauopathie.

À des concentrations élevées, la protéine tau recombinante cerveau ou normal spontanément, mais lentement polymérise en une structure analogue à PHF in vitro, comme indiqué par la liaison de plusieurs feuilles β colorants fluorescents préférés, microscopie électronique, spectroscopie de diffusion de lumière et ^{de 24 à 27.} Ajout de l'héparine ou de l'acide arachidonique, un acide gras abondant dans le cerveau humain, accélère considérablement la formation de PHF et en tau isoform- inducteur concentration-dépendante manières ^28-32. Curieusement, tau hyperphosphorylée purifié à partir de cerveaux AD ou préparé par exhaustive dans les réactions de phosphorylation in vitro uneggregates rapidement et plus efficacement ^26,33-35. Ces résultats sont en excellent accord avec les rôles pathologiques de p-tau. Un système in vitro basée sur l'agrégation des p-tau peut donc servir comme un outil puissant pour le dépistage de la drogue AD.

Étant donné l'association étroite entre l'agrégation de la protéine tau et de la neurodégénérescence progressive de la MA, ainsi que le récent échec dans le développement de médicaments ciblant la plaque Aß, un autre marqueur histologique clé de AD ^36-38, l'intérêt pour la découverte de médicaments qui contrôlent l'agrégation de la protéine tau est en hausse. En effet, plusieurs groupes ont déjà commencé écrans de drogue au débit différente, en utilisant dans les réactions d'agrégation de tau in vitro que le test primaire. Un certain nombre de produits chimiques ont été trouvés à exposer activités inhibitrices ou inversion sur l'agrégation de la protéine tau in vitro ^39-42. Cependant, tous les écrans actuels de régulation de l'agrégation de la protéine tau utilisent tau non modifiée qui rate la marque pathologique clé de phosphoreylation, soulevant une préoccupation pour la spécificité et l'efficacité de l'utilisation de ces composés dans le traitement de la MA.

Un des obstacles majeurs de développement de tests d'agrégation pour la caractérisation biochimique et le dépistage des drogues AD est la production de quantités suffisantes de la protéine tau hyperphosphorylée pathophysiologiquement pertinente. Utilisation du système de catalyse Zippers-assistée dans lequel l'isoforme de la protéine tau et 1N4R la kinase GSK-3β sont co-exprimées dans E. coli comme protéines de fusion de glissière à leucine, nous avons surmonté ce défi (. Sui et al, soumis; voir la figure 1 pour les produits finaux de la protéine tau et p-tau; voir aussi ⁴³ pour préliminaire spectrométrie de masse caractérisation de p-tau). D'un panel de neuf anticorps spécifiques des différents sites de phosphorylation de la protéine tau, des signaux positifs ont été observés dans huit positions (données non présentées). Ci-dessous, nous décrivons les protocoles et instrumentations qui peuvent se différencier l'agrégation d cinétiqueifferences entre la protéine tau non modifié et des espèces de p-tau. Ces essais ont été modifiés par des protocoles publiés qui ont mesuré l'augmentation de la fluorescence de la thioflavine T (THT) ou la thioflavine S (SAT) sur amyloïdes (agrégats de tau) contraignant ^26. Dans le premier "terminal", approche sans colorant, les réactions d'agrégation sont assemblés et mis en incubation en l'absence du colorant amyloïde. A différents points dans le temps, une partie aliquote de chaque réaction est enlevé et mélangé avec un volume égal du tampon THT-contenant et pour empêcher l'agrégation ThT permettre de lier des agrégats de la protéine tau. La fluorescence est mesurée par un IAP FluoroMax-2 fluoromètre. Dans le second "avec colorant" test de surveillance continue, ThT ou ThS est inclus dans les réactions d'agrégation. Fluorescence peut être mesurée en continu tout au long de toute l'expérience manuellement ou en utilisant un lecteur multi-plaque. En outre, nous décrivons un essai qui utilise une concentration quasi-physiologique de la protéine tau et la protéine tau de p-agrégation dans le mo de mesure continuellede. L'effet de la phosphorylation reste facilement détectable. Ci-dessous, nous allons décrire les procédures étape par étape opération, et de montrer des résultats représentatifs de ces essais. Discussion de certains des avantages et inconvénients de chaque approche, ainsi que les applications potentielles de dépistage de drogue suivront.

À une concentration élevée, tau agrégats d'amyloïde dans les structures en forme spontanément. Toutefois, dans le laboratoire, tau fibrilles est généralement accélérée par ces inducteurs comme l'héparine (poids moléculaire moyen, 6000 g / mol) et l'acide arachidonique. Des exemples indiqués ici comprennent 30 uM héparine. La formation d'agrégats amyloïdes tau est contrôlée par la fluorescence résultant de la liaison de thioflavine T (ThT) ou la thioflavine S (SAT) amyloïde. Lors de la liaison à des agrégats de tau, ThT présente un décalage vers le rouge de la fluorescence (excitation: 450 nm; le pic d'émission: 485 nm). ThS, d'autre part, a faible émission à 510 nm (excitation à 450 nm) avant de se lier amyloïde, mais cette fluorescence augmente de façon significative en présence d'une protéine amyloïde tels que le tau agrégée ^44. Les deux colorants fonctionnent bien dans la détection de l'agrégation de la protéine tau et p-tau. En raison de la forte pointe d'émission relativement large et de ThT (voir la figure 2), il n'y a qu'une réduction de 30% dans l'unité de fluorescence à 510 nm. Pour plus de commodité, nous utilisons la même combinaison de longueurs d'onde d'excitation / émission (ce est à dire, 450 nm / 510 nm) pour surveiller l'agrégation de la protéine tau en utilisant soit colorant.

l'agrégation de tau peut être effectuée en présence ou en l'absence du colorant, en fonction du but de l'essai et de la disponibilité de la protéine tau. Les deux modes de réactions sont présentés ci-dessous. En outre, nous démontrons l'exploitation de deux instruments différents - un seul échantillon fluoromètre (ISA-SPEX FluoroMax-2) et un lecteur multi-plaque (SpectraMax M2). Les lecteurs devraient être en mesure d'adapter ces protocoles pour répondre à leurs besoins spécifiques et de la disponibilité de l'instrument.

Protocole

1. Préparation des réactifs

1. Préparer du tampon de regroupement (20 mM de Tris, pH 7,4, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM). Stocker à température ambiante, stable pendant des mois. Supplément 1 mM de dithiothréitol (DTT) avant utilisation.
   REMARQUE: un tampon à base d'HEPES (10 mM HEPES, pH 7,5, EDTA 0,1 mM, DTT 5 mM) produit également des résultats similaires dans l'agrégation de tau.
2. Préparer thioflavine T ou thioflavine solution stock S (3 mM, dissous dans un tampon d'agrégation), et un filtre de 0,22 um unité de filtration stérile. Conserver à -20 ° C dans un tube couvert par une feuille d'aluminium, stable pendant des mois.
3. Préparer la solution héparine de stock (300 um, dissous dans un tampon d'agrégation). Conserver à -20 ° C, stable pendant des mois.
4. Préparer dithiothréitol (DTT) stock (1 M, dissous dans l'eau). Aliquote dans 1,5 ml tubes. Stocker à -20 ° C. Avant essais d'agrégation, décongeler la solution 1 M à température ambiante. De cette 1,000x mère, préparer une aliquote de 100 mM de travail avec de l'eau déminéralisée. Laisser sur la glaceavant d'être prêt.
5. Retirer tau de -80 ° C congélateur. Décongeler sur la glace. Ajuster tau à une concentration prédéterminée avec le tampon d'agrégation. Centrifuger dans une microcentrifugeuse à 20 800 xg pendant 10 min à 4 ° C pour éliminer les gros agrégats préformés. Cette étape de pré-filage augmente la cohérence de la mesure de la fluorescence de chaque lot ultérieur de la préparation de protéine. Transférer le surnageant dans un autre tube; laisser sur la glace jusqu'au moment d'assembler la réaction d'agrégation.

2. Non-dye, Assay Terminal

REMARQUE: La réaction d'agrégation de ce dosage est effectué en l'absence du colorant fluorescent. Après avoir mélangé tous les composants, la réaction est laissée se dérouler à des points de temps prédéterminés. Aliquotes sont ensuite sortis de la réaction de l'agrégation et mélangés avec ThT ou ThS pour la liaison avant lecture de fluorescence amyloïde. Le volume initial de la réaction d'agrégation dépend du nombre de points de temps nécessaires. Cette approche peut REQUIRE une grande quantité de la protéine tau, mais est rapide, simple, et peut être fait dans un fluoromètre ou un lecteur de plaque multi-puits (voir Discussion). Ci-dessous est l'opération étape par étape, avec l'ISA SPEX FluoroMax-2 spectrofluorimètre compacte pour la fluorescence quantification.

1. Mettre en place le mélange dans 1,5 ml agrégation des tubes Eppendorf comme dans le tableau 1. Chaque colonne représente les ingrédients nécessaires pour une réaction de 100 ul, ce qui est suffisant pour une mesure de temps de consigne. Ajustez la quantité pour l'ensemble du mélange d'agrégation sur la base des points de temps nécessaire à l'expérience particulière. Ajouter supplémentaire de 10% de chaque composant pour donner de la place pour le pipetage erreur. Le mélange réactionnel contenant de l'héparine typique représenté ici peut être remplacé par l'acide arachidonique ou un tampon d'agrégation. Ajouter du DTT à 1 mM dans le mélange réactionnel. Si la totalité de la réaction dure plus d'une journée, compléter frais TNT quotidienne (1 mM) pour assurer un environnement réducteur.
2. Inverser le tube quelques fois pour mélanger. PlaCE chaque réaction dans un incubateur ou un bain d'eau à 37 ° C. L'agitation ne est pas nécessaire pour l'agrégation de tau.
3. Avant de mesurer la fluorescence, allumer le spectrofluorimètre (lampe, puis ordinateur).
   REMARQUE: La lampe à arc au xénon qui peut être utilisé immédiatement. Cependant, pour de meilleurs résultats permettent à la machine de se réchauffer pendant environ 10 minutes avant de lire la fluorescence.
4. Démarrez le logiciel sur l'ordinateur.
   1. Choisissez Temps réel mode Affichage en Instrument Control Center, définissez d'onde d'excitation à 450 nm (fente à 2 nm) et d'onde d'émission à 510 nm (fente à 5 nm). Fermer Temps réel fenêtre du mode d'affichage pour revenir au Centre de contrôle Instrument.
   2. Choisissez Analyse longueur d'onde, appuyez sur Ajouter >> touche Constant dans le cadre supérieur d'ajouter des longueurs d'onde ensembles. Régler les paramètres d'acquisition d'erreur standard à 1 et essais maximum à 3, puis cliquez sur Ajouter. Cliquez sur Go! Pour ouvrir l'affichage de donnéesfenêtre.
   3. Dans la fenêtre d'affichage de données, cliquez sur Démarrer Acq pour ouvrir la boîte de dialogue Nouvelle échantillon. Choisissez "inconnu" pour le type de l'échantillon.
5. Pour chaque mélange de 100 ul d'agrégation, ajouter 98 ul de tampon d'agrégation et 2 pi 3 mM thioflavine T. Pipeter plusieurs fois pour mélanger.
6. Transférer la totalité du mélange dans une cuvette (FCA3, dimension extérieure, lx L xh = 12,5 mm x 12,5 mm x 45 mm). Placez la cuve dans le porte-échantillon de l'échantillon compartiments et fermer le couvercle. Cliquez sur Exécuter pour recueillir les données de fluorescence. Enregistrer les données.
7. Retirer la cuvette et décanter la solution. Rincer la cuvette d'eau distillée par trois fois. Sec par soufflage d'air à l'intérieur et l'extérieur de la cuvette.

3. Avec-dye, mode continue Assay sur un lecteur de plaque SpectraMax M2

REMARQUE: Cet essai diffère du précédent en ce que le colorant fluorescent ou ThT ThS est inclus dans le totalisationréaction de tion. Ceci permet la mesure en continu de la même série de réactions. En raison de l'utilisation répétitive de la réaction, ce procédé est mieux fait avec un lecteur automatique de plaque multi-puits (voir ci-dessous le fonctionnement du SpectraMax M2). Fluoromètre ordinaire fonctionne également, mais la fréquence de mesure des réactions d'agrégation rapide est quelque peu limitée en raison de la nature de l'opération manuelle.

1. Mettre en place le mélange d'agrégation dans une plaque de 96 puits (96 puits plaque noire solide, bien volume 360 pi, fond plat) comme dans le tableau 2. Chaque colonne représente les ingrédients nécessaires pour une réaction de 200 pi, ce qui est suffisant pour un temps de mesure point. Mélangez bien à la pipette plusieurs fois. Supplément frais DTT 1 mM chaque jour tout au long du cours d'expériences.
2. Incuber la plaque à 96 puits à 37 ° C.
3. A chaque point de temps avant la mesure de la fluorescence, allumer le lecteur de microplaques multi-mode et l'ordinateur. Prévoyez suffisamment de temps pour la MAchine à stabiliser, à environ 10 min.
4. Démarrez le logiciel sur l'ordinateur. Réglez la température à 37 ° C et choisissez le mode Intensité de fluorescence (FI-Top Lire), réglez la longueur d'onde d'excitation à 450 nm et d'onde d'émission à 510 nm.
5. Insérez la plaque de 96 puits dans le tiroir et appuyez sur la touche READ pour démarrer la mesure.
6. Après avoir lu, retirez la plaque et le retourner à la 37 ° C incubateur. Copiez les données et coller dans un tableur Excel pour l'analyse des données et de traçage.

4. Avec-dye, mode continue Assay sur une Spectrofluorometer Compact

1. Mettre en place le mélange dans 1,5 ml agrégation des tubes Eppendorf comme dans le tableau 3. Chaque colonne représente les ingrédients nécessaires pour une réaction de 200 ul, ce qui est suffisant pour une mesure de temps de consigne.
2. Inverser le tube quelques fois pour mélanger.
3. Allumez le spectrofluorimètre et configurer le logiciel comme dans les étapes 2.3 et 2.4.
4. Transférer le mélange tout l'étécuvette oa. Placez la cuve dans le porte-échantillon de l'échantillon compartiments et fermer le couvercle. Cliquez sur Exécuter pour recueillir les données de fluorescence. Enregistrer les données.
5. Continuer la lecture à des intervalles appropriés en cliquant sur ​​Exécuter et enregistrer les données. Si l'agrégation doit être surveillé à une fréquence élevée (par exemple, tous les 30 ou 60 secondes), laissez la réaction dans la cuve et dans la machine jusqu'à ce que la mesure est terminée, ou quand il ya suffisamment de temps pour échanger des réactions ou des cuvettes.
6. Retirer la cuvette et décanter la solution. Rincer la cuvette d'eau distillée par trois fois. Sec par soufflage d'air à l'intérieur et l'extérieur de la cuvette.

Résultats

Utilisation recombinant tau et p-tau (Figure 1), nous avons établi deux protocoles différents pour comparer la cinétique de l'agrégation de la protéine tau et p-tau, en profitant de la forte émission de fluorescence de ThT et ThS lors de la liaison à amyloïde agrégats de protéines, y compris la protéine tau et p-tau (Figure 2). Avec ou sans le colorant fluorescent dans la réaction d'agrégation, nous avons observé l'amélioration constante de l'agrégation d...

Discussion

Ce protocole démontre différentes conditions et les instruments qui détectent les tau rapide cinétique d'agrégation de phosphorylation dépendante dosage. Dans l'essai du terminal, la fluorescence ThT colorant est ajouté à une partie de la réaction présente dans le mélange maître à chaque point de temps. Amyloïde liaison induite par fluorescence est ensuite mesurée ^26. Dans le second, avec le mode de colorant, l'agrégation de la protéine tau est effectuée en présence de ThT ou Th...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizma base	Sigma	T1503
NaCl	Macron Fine Chemicals	MAL-7581-06
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)	Invitrogen	15576-028
Thioflavin T	Sigma	T3516	Stored in dark
Thioflavin S	Sigma	T1892	Stored in dark
heparin	Sigma	H3393
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D9779	Stored at 4 °C
96-well plate	Corning	3917
ISA SPEX FluoroMax-2	Horiba
SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader	Molecular Devices
Mouse Anti-Tau Monoclonal Antibody	R&D Systems	MAB3494	Stored at –80 °C