Une méthode de perméabilisation de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons pour dosages de petites molécules activité

Résumé

Introduction de petites molécules à l'embryon de drosophile en développement offre un grand potentiel pour la caractérisation de l'activité biologique des nouveaux composés, des médicaments et des toxines ainsi que pour sonder les voies fondamentales de développement. Procédés décrits ici donnent un aperçu des mesures qui surmontent les barrières naturelles de cette approche, l'expansion de l'utilité du modèle de l'embryon de drosophile.

Résumé

L'embryon de drosophile a longtemps été un modèle de laboratoire puissant pour élucider les mécanismes moléculaires et génétiques qui contrôlent le développement. La facilité de manipulations génétiques avec ce modèle a supplanté les approches pharmacologiques qui sont monnaie courante dans d'autres modèles animaux et les tests cellulaires. Nous décrivons ici des progrès récents dans un protocole qui permet l'application de petites molécules à la mouche des fruits en développement embryonnaire. La méthode détails des mesures pour surmonter l'imperméabilité de la coquille tout en maintenant la viabilité des embryons. Coquille d'oeuf perméabilisation dans un large éventail de stades de développement est réalisée par application d'un embryon précédemment décrit d-limonène solvant perméabilisation (EPS ¹⁾ et par le vieillissement des embryons à température réduite (18 ° C) avant les traitements. En outre, on utilise un colorant rouge lointain (CY5) en tant qu'indicateur de perméabilisation est décrite, ce qui est compatible avec des applications en aval impliquant grippe rouge et vert standardcolorants orescent dans des préparations en direct et fixes. Ce protocole est applicable à des études utilisant des composés bioactifs pour sonder les mécanismes de développement ainsi que pour des études visant à évaluer l'activité tératogène ou pharmacologique de petites molécules non caractérisés.

Introduction

L'embryon de drosophile continue d'être un modèle de choix pour l'étude des mécanismes fondamentaux du développement ^2. Ce modèle puissant est supporté par un large éventail d'outils génétiques moléculaires qui permettent des manipulations de quasiment n'importe quel gène à n'importe quel point dans le temps et dans le développement de n'importe quel organe. La petite taille, le développement rapide et une caractérisation de la morphogenèse de l'embryon de drosophile en font un modèle de choix pour les écrans génétiques, dont beaucoup ont découvert voies fondamentales de développement ^3,4. De nombreux phénotypes dans l'embryon de drosophile ont été caractérisés et sont facilement interprétables, offrant souvent un moyen d'identifier les mécanismes génétiques moléculaires sous-jacents responsables d'un trait anormal.

Par le passé, un inconvénient du modèle d'embryon de mouche a été la difficulté d'introduire de petites molécules à des tissus embryonnaires. Cet obstacle a posé des limites à: 1) nousment connus petites molécules bioactives comme sondes d'interroger les mécanismes de développement et 2) l'utilisation de ce modèle mis en place pour évaluer l'activité tératogène ou pharmacologique de petites molécules non caractérisés. En conséquence, le potentiel de dépistage de l'embryon de mouche a été sous-utilisé dans la caractérisation de l'activité de petites molécules.

Livraison de petites molécules à l'embryon à la mouche peut être réalisé selon deux méthodes: 1) perméabilisation de la coquille d'oeuf et 2) la micro-injection. Cet article présente les progrès de la méthode de perméabilisation qui sont faciles à exécuter dans le cadre d'un laboratoire de Drosophila classique. Il convient de noter que les progrès récents dans les méthodes de micro-injection avec la technologie microfluidique contribue également à des méthodes d'introduction de composés de ^5,6 sur l'embryon. Introduire des molécules de l'embryon est empêché par une couche de cire de la coquille ^7. La coquille drosophile se compose de cinq couches. À partir del'intérieur vers l'extérieur, ils sont: la membrane vitelline, la couche de cire, la couche intérieure chorionique, la endochorion et la exochorion ^8. Les trois couches choriales extérieures peuvent être éliminées par une brève émersion de l'embryon dans la javel, une étape appelée dechorionation. La couche cireuse exposé peut ensuite être compromise par l'exposition à des solvants organiques, tels que l'heptane et l'octane ^7,9, ce qui rend l'embryon dechorionated perméable, alors qu'il reste enfermé dans la membrane vitelline sous-jacent. Cependant, l'utilisation de ces solvants introduit des complications en raison de leur toxicité et de la difficulté à réglementer leur action de perméabilisation forte, qui ont tous deux des effets négatifs sur la viabilité des embryons Stark ^9,10.

Une méthode de perméabilisation utilisant une composition appelé embryon perméabilisation solvant (EPS) a été décrit précédemment ^1. Ce solvant est constitué de d-limonène et les tensioactifs d'origine végétale qui permettent au solvant d'être miscible avec des tampons aqueux. La faible toxicité du d-limonène et de la capacité de diluer le solvant à des concentrations désirées a donné une méthode efficace pour générer des embryons perméables avec ^une viabilité élevée. Cependant, deux facteurs endogènes ont continué à apporter des limitations à l'application. Tout d'abord, les embryons montrent l'hétérogénéité de la perméabilité après le traitement EPS, même lorsque l'on prend soin de maintenir la mise en scène de développement à proximité. Deuxièmement, des embryons âgés de plus de huit heures environ se sont avérés difficiles à perméabiliser, conformément à un durcissement de la coquille qui se produit après la ponte ^11.

Décrit ici sont les progrès de la méthode EPS que: 1) aider à identifier et analyser les embryons quasi-identique perméabilisées, même après fixation et immunomarquage étapes ont été exécutées et 2) permettre la perméabilisation des embryons à la fin des points de temps de développement (> 8 h, stade 12 ans et plus). Plus précisément, l'application d'un colorant rouge lointain,CY5 acide carboxylique, est décrite qui sert d'indicateur de la perméabilité, qui persiste dans l'embryon au cours du développement et de formaldéhyde, après fixation. En outre, il est démontré que l'élevage des embryons à 18 ° C maintient la coquille dans un état sensible EPS, permettant perméabilisation des embryons à un stade avancé (stades 12-16).

Ces progrès surmonter les limitations mentionnées ci-dessus à la méthodologie des EPS. Cette application va donc fournir aux enquêteurs un moyen d'introduire de petites molécules d'intérêt à l'embryon à des moments distincts de développement tout en maintenant la viabilité.

Protocole

1. Préparation des cultures Fly, Solutions et périphériques embryon de manutention

1. Préparer une culture de la cage de la drosophile. Placez 500 vol + accouplement de la souche souhaitée dans une cage de la population équipée d'une plaque de raisin-agar 10 cm et une tache de pâte de levure. Maintenir la culture dans un incubateur à 25 ° C contrôlée d'humidité. Remarque:   cultures Cage besoin un jour ou deux de conditionnement pour obtenir des motifs de l'embryon pose cohérentes. plaques de raisin avec de la pâte de levure sont changés une fois le matin et une fois le soir au cours du conditionnement.
2. Préparer EPS. Solutions chaudes de tensioactifs (cocamide DEA et d'alcool éthoxylé) à 37 ° C. Introduire à la pipette 18 ml de d-limonène à un flacon à scintillation en verre équipé d'un petit barreau d'agitation. Introduire à la pipette 1 ml de chacun des deux agents tensio-actifs (à 5% de concentration finale de chaque) à la d-limonène. Mélanger soigneusement et enlever une barre d'agitation. NOTE: Cette solution mère de EPS est bon pour environ 2 mois à température ambiante. La solutiondoit être réchauffé à 37 ° C et tourbillonné pour solubiliser entièrement les tensioactifs avant l'utilisation. EPS et le d-limonène doivent être stockés dans un récipient en verre où ils se dissoudront au cours du temps certains plastiques.
3. Préparer la solution embryon dechorionation, médiums d'incubation, colorant et solutions médicamenteuses. Mélanger 25 ml d'eau de Javel avec 25 ml H ₂ O et le placer dans un plat peu profond. Préparer milieu modifié de base d'incubation (MBIM) et MBIM-T selon la recette avant ^{de 1,12.} Préparer Shields et Sang M3 milieu de culture cellulaire et PBS selon le protocole du fabricant (voir liste matériaux). Préparer une solution stock de perméabilisation colorant à 10 mM dans le DMSO concentration.
4. Assembler les appareils et fournitures embryon de manutention:
   1. Préparer dechorionation et panier de traitement des EPS (voir la figure 1A). Coupez une section de 3 cm d'un 50 ml polypropylène centrifugeuse / tube de culture jetable avec une scie à dents fines. Rendre la surface soudage chasse par le frottement de la section de tube sur du papier de verre colléà une surface de paillasse. Souder la section de tube à mailles de nylon Nitex par fusion de la jante de la section de tube à la flamme et en appuyant sur le maillage sur une plaque de verre. Laisser refroidir et couper en maille supplémentaire. REMARQUE: Les parois verticales et le fond permettent de rinçage rapide et complète de l'eau de Javel et EPS résiduelle aux étapes respectives. Les étapes de soudage doivent être effectuées sous une hotte.
   2. Préparer un panier de développement. Couper la partie supérieure d'une centrifugeuse / tube de culture de 50 ml en affleurement avec le bord de la calotte. Retirer le bouchon et modifier par découpe d'une ouverture centrale et des encoches le long de la jante comme sur la figure 1B. Visser le bouchon sur le maillage et sur les filets de la section de tube coupé et couper maille supplémentaire. NOTE: Le capuchon comporte des encoches dans le bord qui permet la diffusion dans le milieu en vrac lorsqu'il est positionné dans le réservoir de lave de 60 mm (figure 1B).
   3. Préparation des pièces d'une chambre de lame. Coupez un carré de membrane DO qui est plus grand quela chambre ouverture de diapositives. Appliquer une fine couche de graisse à vide à l'intérieur de la lèvre de l'ouverture. Fixez la membrane DO dans l'ouverture qu'il étanchéité contre la graisse avec la bague de retenue. Coupez membrane DO excès en le coupant de retour près de l'anneau de retenue. REMARQUE:. Spécifications pour la chambre de coulissement peuvent être trouvés dans Kiehart et al ¹³ Cette chambre n'est pas disponible dans le commerce et nécessite la fabrication sur mesure par un atelier d'usinage.

2. Staging, dechorionation, et le traitement des embryons EPS

1. Mise en scène embryons par collection chronométré. Définir une plaque raisin / levure fraîche à la volée culture cage dans l'AM. Permettre embryons à poser pendant 1 heure à 25 ° C. Jeter cette plaque et la remplacer par une plaque raisin / levure fraîche pour un embryon pose ultérieure de 2 heures à 25 ° C. Recueillir cette plaque et le lieu dans 18 ° C incubateur pour de plus amples mise en scène du développement. REMARQUE: 1 heure de développement à 25 ° C est égale à 2 h du développementà 18 ° C. L'effet du vieillissement à 18 ° C contre 25 ° C sur le maintien de perméabilisation EPS dans des embryons de stade tardif peut être vu sur la figure 2.
2. Dechorionation. Rincer délicatement les embryons hors de la plaque de raisin dans le panier de la maille à 25 ° C l'eau du robinet et un pinceau. Rincer excès de levure à partir des embryons dans le panier sous un léger courant d'eau du robinet. Plongez le panier dans l'eau de Javel à 50% pendant 2 min. Laver soigneusement les embryons sous un courant d'eau du robinet. REMARQUE: gicler doucement solution d'eau de Javel sur les embryons par intermittence en utilisant une pipette en plastique. Alors que 2 minutes est généralement suffisant pour dechorionation complète, ce temps d'incubation doit être vérifiée par examen direct et ajusté en conséquence. Maintenir embryons dechorionated dans le panier immergé dans l'eau du robinet et de procéder immédiatement à l'étape EPS.
3. Traitement EPS
   1. Préparer six plats de 60 mm avec environ 10 ml de PBS dans chaque. Préparer la dilution EPS en dissolvant 75 EPS ul dans 2,925 ml MBIM (01h40) dans un bécher de 50 ml en verre avec tourbillonnant. Note: blanc forme une émulsion du mélange.
   2. Éponger l'eau en excès à partir du fond du panier à mailles avec une lingette laboratoire. Plongez panier en EPS diluées dans le bécher et agiter de se disperser immédiatement embryons dans la solution EPS dans le fond du panier. Continuer mouvement tourbillonnant pendant 30 sec. REMARQUE: dilutions EPS et des temps d'exposition peuvent être modifiées pour contrôler la perméabilité. Il est recommandé que les dilutions optimales de SPE et les temps de traitement sont établies de façon empirique avec des souches de mouches utilisés. L'augmentation du temps d'exposition à 60-90 sec est favorable pour l'étape 12 et embryons âgés.
   3. Retirer le panier, efface loin EPS excès avec un laboratoire essuyer. Procéder à six lavages successifs dans 10 ml de PBS dans les boîtes de 60 mm. Utiliser une pipette en matière plastique à injecter embryons doucement avec du PBS dans chacun des six lavages. Passez à teindre et les étapes de traitement de la toxicomanie. Remarque: EPS peuvent être jetés dans l'évier.

3. Dye et traitement de la toxicomanie de perméabilisées embryons

1. Traitement colorant
   1. Ajouter 5 ul de 10 mM CY5 colorant acide carboxylique * à 1 ml de MBIM-T (50 uM de concentration finale) dans un tube à centrifuger de 1,5 ml et vortex pour mélanger. NOTE: * Choix du colorant dépend de l'analyse en aval. Acide carboxylique CY5 est efficace pour des analyses ultérieures utilisant fixation et immunologique. Rhodamine B est utile pour l'analyse des embryons vivants. L'émission rouge de la rhodamine B, et l'émission dans le vert de ses métabolites ^1, peuvent présenter des complications avec des applications en aval par fluorescence. Médicament ou une toxine peuvent être ajoutés à la solution de colorant pour initier un traitement à ce stade, ou pour limiter le traitement de médicament / de la toxine à une impulsion à ce stade. Des précautions doivent être prises pour gérer et disposer de médicaments et de toxines selon la fiche signalétique et des normes de sécurité environnementale.
   2. Transférer les embryons dans le panier grillagé de la solution de colorant à l'aide d'un pinceau. Boucher le tube et inverser plusieurs fois pour assurer laembryons flottent librement en suspension dans la solution de colorant. Placer le tube sur une bascule de nutation pendant 15 min à température ambiante.
   3. Retirer le tube du nutator et permettent de régler les embryons. Retirer la solution de colorant avec une pipette fine et la remplacer par 1 ml de MBIM-T à laver. Inverser le tube pour remettre en suspension les embryons complètement. Laissez embryons à s'établir et à répéter avec trois lavages MBIM-T. Retirez tous les MBIM-T de rinçage final et passer à l'étape d'incubation.
2. Incubation de l'embryon développement
   1. Transfert d'embryons à l'une des deux chambres: Le panier de développement ou la chambre de coulissement. REMARQUE: Le panier de développement est préféré pour des périodes de développement plus longs, et est nécessaire si fixation et immunomarquage étapes suivantes sont à exécuter. La chambre de coulissement est optimal pour une résolution plus élevée imagerie time-lapse et est plus efficace pour de courtes périodes de développement (par exemple, les événements embryonnaires). Médicament ou une toxine peuvent être ajoutées au milieu à différentes concentrations et d embryonéveloppement peut être contrôlé en temps réel avec des embryons vivants ou à un point de terminaison à l'aide de fixation standard et immunohistochimique protocoles.
   2. Développement dans Paniers
      1. Nettoyer un panier de développement en injectant 70% d'éthanol, rincer abondamment avec de l'eau déminéralisée et sécher avec laboratoire essuyer. Préparer 6 ml de milieu d'incubation à une concentration souhaitée du médicament ou une toxine. Placez le panier de développement en moyenne 60 mm prise de plat soin de ne pas de bulles d'air piège sous le sommier. REMARQUE: Deux médias sont couramment utilisés: MBIM seul, ou MBIM/M3 dans un mélange 50:50, ce dernier étant plus efficace pour des périodes de développement plus longs.
      2. Transfert d'embryons perméabilisées à maille surface dans la base de panier avec un pinceau. Gicler doucement les embryons avec les médias du réservoir environnante. Disperser les embryons avec le pinceau de sorte qu'ils se trouvent dans une monocouche sur le maillage. Remarque: Passez à l'imagerie microscopique et évaluer les caractéristiques de perméabilisation et la viabilité de la pra séparation (voir l'étape 4).
   3. Développement à la Chambre de diapositives
      1. Inverser chambre de coulissement et appliquer un petit cordon de graisse à vide sur le pourtour de l'ouverture. Placez 150 pi de milieu avec la quantité désirée de médicament ou une toxine sur la surface de la membrane DO dans l'ouverture. REMARQUE: Deux médias sont couramment utilisés: MBIM seul, ou MBIM/M3 dans un mélange 50:50, ce dernier étant plus efficace pour des périodes de développement plus longs.
      2. Transfert d'embryons perméabilisées à la baisse de médias avec un pinceau. Disperser les embryons rendant déposent sur la membrane dans la chute.
      3. Appliquer soigneusement une lamelle circulaire de 25 mm sur l'ouverture aplatissement ainsi le milieu. Presser doucement le long du périmètre de la lamelle couvre-objet pour former un joint avec la graisse. Remarque: Procéder à la microscopie imagerie pour évaluer les caractéristiques de perméabilisation et la viabilité de la préparation (voir l'étape 4).

4. Identition de perméabilisées embryons viables

1. Identifier les embryons perméabilisées. Observer les embryons sous épifluorescence avec un microscope équipé d'une caméra numérique. Acquérir les images (dans la longueur d'onde bleue de déterminer le profil jaune autofluorescence) de plusieurs domaines à l'aide de microscope fixe et réglages de l'appareil.
2. Déterminer la perméabilisation des embryons sur la base de l'intensité de fluorescence relative. Utiliser un microscope stéréoscopique avec une grande distance de travail pour accueillir le panier et pour permettre les manipulations des embryons. Le microscope doit être équipé d'une platine XYZ programmable, un éclairage à épifluorescence et d'une caméra numérique. L'image des embryons en prenant soin d'enregistrer l'exposition et les paramètres de position de scène de chaque image de l'embryon pour permettre la réévaluation des mêmes embryons à un moment ultérieur (voir résultat représentatif de la figure 3). Remarque: Les schémas de la montée du colorant peut varier en fonction du colorant utilisé, la durée de l'exposition et de l'âge de l'embryon. Une large gammede l'absorption de colorant à travers une seule préparation est typique et reflète la variation du degré de perméabilisation.
3. Identifier les embryons viables. Après la position d'embryons perméabilisées marquage, continuer avec le développement de l'embryon à la température ambiante ou 25 ° C. Panier ou chambre de coulissement Retour à microscope. Observer en fluorescence du canal de bleu et d'acquérir l'image de jaune autofluorescence dans les embryons perméabilisées précédemment identifiés. Évaluer la viabilité selon la progression normale de la distribution de jaune (voir Rand et al. ¹ et résultat représentatif de la figure 3). Remarque: D'autres caractéristiques morphologiques de l'embryon observé en microscopie en fond clair peuvent être utilisées pour évaluer la viabilité. Il est recommandé d'établir le niveau de perméabilité qui est compatible avec la viabilité être déterminée de manière empirique avec chaque colorant et de la souche de mouche utilisée.
4. Évaluer les effets de la drogue ou à toxines dans les embryons viables perméabilisées.
5. Embryons procéduressed avec le protocole ci-dessus sont prêts pour un certain nombre de classiques analyses découlant à la drogue ou l'exposition aux toxines. Plusieurs des différents types d'analyses sont pris en compte dans la discussion ci-dessous et comprennent l'observation directe de la morphogenèse des embryons vivants ainsi que des analyses post-fixation immunologique. Ces deux approches sont renforcées par l'utilisation de colorants vitaux (par exemple, GFP) qui révèlent des profils d'expression de gènes et la lignée cellulaire et les profils de morphologie.

Résultats

dispositifs de manipulation de l'embryon sont illustrés à la figure 1 pour aider à visualiser les dispositifs de "home-made" pour la manipulation dans les protocoles ci-dessus. Résultats observés dans la figure 2 illustrent l'effet robuste de l'élevage des embryons à 18 ° C sur leur capacité à être perméabilisées par EPS à des stades tardifs de développement. Cette condition est appliquée dans l'étape de protocole 2.1. L'efficacité de la t...

Discussion

Le procédé ci-dessus décrit un moyen d'obtenir des embryons de drosophile viables qui sont accessibles aux petits soins de molécules dans un large éventail de développement. Cette méthode présente le roman et simple constatation que le vieillissement des embryons à 18 ° C permet la perméabilisation des embryons à un stade avancé avec la même efficacité que vu précédemment que dans les embryons à un stade précoce. En outre, l'utilisation de la CY5 colorant rouge lointain acide carboxyl...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fly Cage	Flystuff.com	59-101	http://flystuff.com/general.php
Cocamide DEA [Ninol 11-CM]	Stepan Chemical	call for special order	http://www.stepan.com/
Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7]	Stepan Chemical	call for special order	http://www.stepan.com/
d-limonene (Ultra high purity grade)	Florida Chemical Co.	call for special order	http://www.floridachemical.com/
Sodium hypochlorite	Fisher	SS290-4	http://www.fishersci.com/
Tween-20	Fisher	BP337	http://www.fishersci.com/
PBS powder	Sigma	56064C	http://www.sigmaaldrich.com/
Rhodamine B	Sigma	R6626	http://www.sigmaaldrich.com/
CY5 carboxylic acid	Lumiprobe	#23090	http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid
DMSO	Sigma	472310-100	http://www.sigmaaldrich.com/
Shields and Sang M3 medium	Sigma	S8398	http://www.sigmaaldrich.com/
Nitex Nylon mesh	Flystuff.com	57-102	http://flystuff.com/misc.php
Dissolved oxygen (DO) membrane	YSI	#5793	http://www.ysireagents.com/search.php
25 mm circular no.1 cover slip	VWR	48380-080	https://us.vwr.com/
Grape-agar plate mix	Flystuff.com	47-102	http://flystuff.com/media.php
Nutator	VWR	82007-202	https://us.vwr.com/