Electroporateur pour livraison séquentielle moléculaire microscopique assistée Vortex-

Résumé

Un tourbillon microfluidique plate-forme d'électroporation assistée a été développé pour la livraison séquentielle de plusieurs molécules dans des populations de cellules identiques avec contrôle de dosage précis et indépendant. Basé sur la taille de l'étape de purification de la cellule cible de l'électroporation précédentes du système aidé à améliorer l'efficacité d'administration moléculaire et la viabilité des cellules traitées.

Résumé

L'électroporation a reçu une attention croissante au cours des dernières années, car il s'agit d'une technique très puissante pour l'introduction de sondes moléculaires exogènes physiquement non par pénétration dans les cellules. Ce travail présente la plate-forme d'électroporation microfluidique capable d'effectuer la livraison de molécule multiple de cellules de mammifères avec contrôle des paramètres précis et moléculaire dépendant. La capacité du système à isoler les cellules avec une distribution uniforme de la taille permet une moindre variation de l'efficacité d'électroporation par l'intensité du champ électrique donné; donc amélioré viabilité de l'échantillon. Par ailleurs, sa fonction de visualisation de processus permet l'observation du processus d'absorption moléculaire fluorescent en temps réel, ce qui permet des ajustements de paramètres moléculaires rapides de délivrance in situ pour l'amélioration de l'efficacité. Pour montrer les vastes capacités de la plate-forme signalé, macromolécules de différentes tailles et des charges électriques (par exemple, Dextran avec MW de 3000 et 70 000 Da) étaientdélivré à des cellules de cancer du sein métastatique avec des rendements élevés de distribution (> 70%) pour toutes les molécules testées. La plate-forme développée a prouvé son potentiel d'utilisation dans l'expansion des domaines de recherche où sur puce techniques d'électroporation peuvent être bénéfiques.

Introduction

Au cours des dernières années, l'utilisation d'impulsions électriques pour faciliter la délivrance cytosolique des molécules extracellulaires est devenue un moyen attrayant de la manipulation de cellules de mammifères. ¹ Ce processus, également appelé électroporation, perméabilise la membrane cellulaire de façon réversible, ce qui permet de façon inhérente des molécules membranaires imperméables à accéder au milieu intracellulaire des cellules. Étant donné que pratiquement n'importe quelle molécule peut être introduit dans le cytosol par les pores créés temporaires dans la membrane de n'importe quel type de cellules en utilisant l'électroporation, la technique a été rapporté comme étant plus reproductible, universellement applicable, et plus efficace que d'autres méthodes, y compris le virus à médiation chimique et les approches optiques ^3.2. Cette technique a été utilisée pour introduire des molécules fluorescentes, ^quatre médicaments et des acides nucléiques ^{5 7.6} tout en conservant les cellules intactes et viables. Compte tenu de ces avantages, l'électroporation a été adopté comme un travail communtoire technique de l'ADN pour la transfection in vivo du gène thérapeutique et ^huit études de vaccination cellulaire. Il est cependant toujours difficile pour les systèmes classiques d'électroporation pour réaliser simultanément l'efficacité pratique et la viabilité des échantillons avec une grande hétérogénéité de taille car l'intensité du champ électrique nécessaire pour l'électroporation est en étroite corrélation avec succès le diamètre de la cellule. En outre, ces systèmes ne permettent pas un contrôle précis des quantités moléculaires multiples livré à cause du besoin en vrac processus moléculaire stochastique de livraison. ⁹ Afin de répondre à ces questions, de nombreux groupes ont développé des plates-formes d'électroporation microfluidiques, offrant l'avantage de tensions de poration inférieurs, meilleure efficacité de la transfection, une réduction importante de la mortalité cellulaire, et la capacité de fournir de multiples molécules. ^10-13 Ces avantages ont été rendus possibles grâce aux petites empreintes de systèmes d'électroporation à micro-électrode dont la hauteurlongueurs sont des sous-millimètres, ce qui diminue considérablement les tensions nécessaires à la livraison réussie. De plus, ces systèmes à micro-électroporation peut obtenir une répartition uniforme du champ électrique et rapidement se dissiper la chaleur générée, ce qui donne une réduction de la mortalité cellulaire, tout en améliorant l'efficacité d'administration. L'utilisation de matériaux transparents pour ces puces électroniques supplémentaires permettant l'observation in situ du procédé d'électroporation pour des modifications de paramètres d'invite. ^2,12 Toutefois, le contrôle du dosage précis et un contrôle de paramètres molecular- et cellulaire dépendante, nécessaires à la recherche et des applications thérapeutiques, ^{6 émergente, 14-16} restent encore en suspens.

Ce travail présente un système microfluidique d'électroporation assistée vortex, capable de délivrer de manière séquentielle de multiples molécules dans une population identique pré-sélectionnée de cellules cibles. Les cellules dont la distribution de taille uniforme sont isolés avant l'électroporation en utilisant si antérieurementMécanisme de ze-sélectif piégeage. ^17-18 En ayant une distribution uniforme de la taille, moins la variation de l'efficacité de l'électroporation et la viabilité accrue par la force du champ électrique donné ont été obtenues. ¹⁹ En outre, l'agitation continue des cellules piégées à l'aide de tourbillons microscopique a permis de distribution uniforme de molécules à travers la toute cytosol, en accord avec les résultats précédemment déclaré utiliser une autre plate-forme d'électroporation assisté vortex. ²⁰ Pour démontrer que ce système serait applicable à un large éventail de molécules couramment utilisées dans les applications biologiques, macromolécules avec une large gamme de poids moléculaires ont été livrés à cellules de cancer du sein métastatique. En outre, à l'aide de la surveillance des processus en temps réel, ce travail fournit plus de preuves pour mettre fin au débat de longue date en ce qui concerne le mécanisme de livraison moléculaire au cours electrporation, étant essentiellement électrophorèse médiée par rapport à la diffusion médiation. ¹⁴ Contrairement à d'autres systèmes d'électroporation, cette plate-forme permet de façon unique les avantages combinés de la distribution précise de plusieurs molécule, une haute efficacité de distribution moléculaire, la mortalité cellulaire minimal, pour une vaste gamme de dimensions et charges de molécules délivrées, ainsi que la visualisation en temps réel de l'électroporation processus. Compte tenu de ces capacités, le système d'électroporation développé a un potentiel pratique comme un outil polyvalent pour les études de reprogrammation cellulaire, les applications d'administration de médicaments ^{6,14,21-22 10,19} et pour les applications nécessitant une compréhension en profondeur des mécanismes de prestation moléculaires d'électroporation.

Protocole

1 Préparation des cellules

1. Planche 1 × 10 ⁵ cellules / ml de la lignée cellulaire de cancer du sein métastatique MDA-MB-231 dans un volume de 10 ml par culture de tissus T75 ballon en milieu L-15 de Leibovitz supplémenté avec 10% (v / v) de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine.
2. Incuber les cellules MDA-MB-231 cellules dans un incubateur humidifié à 37 ° C avec 0% de CO ₂ environnement.
3. Récolte des cellules pour les expériences 2 jours après l'ensemencement des cellules par traitement avec 0,25% de trypsine-EDTA pendant 2 min et inactiver l'activité enzymatique de la trypsine en ajoutant 8 ml de milieu de croissance.
4. un culot de cellules par centrifugation pendant 5 min à 200 x g et remise en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS, 1x sans Ca ^{2 +} et Mg ^{2 +)} à une concentration finale de 5 x 10 ⁵ cellules / ml.

2. Dispositif Conception et fabrication

REMARQUE: Le masque, fabrications maître de moisissure et laprocessus d'enceinte de microcanaux doivent être menées à l'intérieur d'une salle blanche tandis que le polydiméthylsiloxane (PDMS) procédé de coulée de microcanaux peut être effectuée sur une paillasse de laboratoire régulière.

1. Conception d'un dispositif microfluidique, comme illustré sur la figure 1 avec AutoCAD. Le dispositif devrait être composé d'une entrée avec des ports d'injection multiples, filtres grossiers et deux inertie en se concentrant canaux rectangulaires droites parallèles (L = 7 mm, W = 40 um, et H = 70 pm). Chaîne droite individuelle se compose de cinq chambres d'électroporation, qui sont placés en dehors de 800 um _(C = W 400 um) avec deux trous d'interconnexion des électrodes d'aluminium. Deux chambres d'électroporation transversalement adjacents partagent le trou de l'électrode négative. Deux chaînes droites fusionnent en une sortie à l'aval de la région d'électroporation.
2. Convertir le fichier CAO avec des micro-modèles dans un fichier GDSII utilisant LinkCAD. Ecrire les micro-motifs sur un 5 "x 5" photomasqueavec un graveur de masque laser. Développer le masque en suivant le protocole du fabricant. REMARQUE: Le processus de développement de masque comprend résine photosensible développement, la gravure de chrome et résister à l'enlèvement. Sinon, micro-motifs imprimés sur un transparent à haute résolution (> 20 000 ppp) peut être acheté auprès d'un fabricant tiers et utilisé comme un masque photographique. Fonctions à micro-finales sur un photomasque devraient être transparentes pour correspondre à la polarité d'une résine photosensible négative.
3. Fabriquer le moule de coulée de la conception du dispositif en utilisant des techniques classiques de lithographie douce ²³ avec une couche photosensible négative filé sur une tranche de silicium de 4 pouces à 2000 tours par minute pour avoir l'épaisseur finale de 70 pm.
4. Précuites la plaquette de résine photosensible négative pendant 20 min à 95 ° C.
5. Contacter le masque avec la tranche et exposer à une source d'UV (17,4 mJ / cm ²⁾ pendant 80 secondes en utilisant un aligneur de masque.
6. Développer la tranche exposée pendant 4 minutes dans un révélateur SU-8.
7. Mesurer l'l'épaisseur de la résine photosensible développée en utilisant un profilomètre de surface.
8. Rigoureusement mélanger un ratio de 10: 1 en élastomère à l'agent (kit d'élastomère de silicone) le durcissement et versez le mélange sur le moule pour produire des répliques PDMS. Dégazer l'élastomère de coulée pendant 30 minutes et traiter le moule de coulée d'élastomère dégazé dans une étuve à 70 ° C pendant 2 heures.
9. Décoller guéri réplique PDMS avec des motifs de microcanaux du moule et percer des trous pour les entrées, sorties et électrodes insertions en utilisant un étau broches. Remarque: le diamètre de bord de coupe normale de l'étau de la broche doit être de 0,76 mm, suffisante pour maintenir fermement un tube en PEEK (OD de 1/32 ") et des électrodes en aluminium (DO de 0,029") à la place.
10. Créer des canaux microfluidiques fermés par collage PDMS répliques sur une lame de verre traitée dans un nettoyeur à plasma d'oxygène pendant 7 secondes à une puissance et pression partielle d'oxygène de 75 W et 500 mTorr, respectivement fréquence radio.

3. Expériences de débit

1. Insérerdes électrodes d'aluminium (0,029 ") de diamètre extérieur et un tube de sortie de PEEK (1/32" DO) en des endroits désignés par l'intermédiaire de trous dans les microcanaux (voir la figure 3B).
2. Brancher l'équipement électrique ¹⁸ responsable de la production à haute tension de courtes impulsions rectangulaires aux électrodes d'aluminium (voir la figure 3C) qui sont en contact avec des solutions qui coule dans le moule PDMS. REMARQUE: L'équipement devrait être composé d'un générateur d'impulsions et d'un amplificateur de haute tension dans la maison construite ^18.
3. Préparer 50 ml de quatre tubes à centrifugation contenant individuellement DPBS, des solutions avec des cellules et des biomolécules, et fixer chaque tube à son support de flacon respectif connecté au système de commande d'écoulement pneumatique (voir la figure 3A) ^18.
4. Connecter le tuyau d'PEEK entrée des détenteurs des flacons dans les trous d'entrée respectives dans le dispositif microfluidique.
5. Réglez l'amplitude d'impulsions rectangulaires, V, 100 V afin d'avoir la FIE électriquerésistance à ld, E = V / _e L, à travers la chambre d'électroporation être équivalent à 0,7 kV / cm. NOTE: Ici, L _e est la distance entre deux points où les électrodes positive et négative sont en contact avec la solution qui s'écoule (voir figure 1).
6. Régler le régulateur de pression de 40 psi. REMARQUE:. Une source d'azote réglable manuellement unique est utilisé pour mettre sous pression de manière uniforme tous les flacons d'échantillon et un collecteur à haute vitesse est utilisé pour activer en temps opportun des ports individuels de la solution en utilisant le logiciel LabVIEW intégré personnalisé ¹⁸
7. Pour le contrôle de la vanne, ouvrir le logiciel intégré de LabVIEW personnalisé appelé Valve Runner, et cliquez sur Exécuter dans le menu déroulant intitulé fonctionnent.
8. Ouvrir les robinets en cliquant sur l'icône de chaque soupape correspondant. REMARQUE: L'icône de la vanne doit devenir vert quand il est activé. Cliquez sur l'icône active désactiver et fermer la vanne. L'icône de la vanne fermée devrait devenir gris.
9. Ouvrez la vanne du réservoir DPBS (c.-à-., la solution de lavage) pour amorcer la vitesse d'écoulement stable nécessaire à la cellule de piégeage de génération de vortex pendant 1,5 min.
10. Mettre l'orifice de solution active à partir de la solution de lavage à la solution de cellules à piéger les cellules dans la chambre d'électroporation de 30 secondes (à savoir, l'étape de piégeage de cellule).
11. Circuler dans les deux solutions de lavage et de cellule à travers le dispositif pendant 10 secondes à la fois, avant l'étape de piégeage de cellule à assurer un écoulement sans perturbation pendant l'étape de mise en solution. REMARQUE: Cette étape co-courant bref doit être répété à chaque étape de solution de commutation.
12. Tournez sur le port de lavage et rincer l'appareil pendant 20 secondes afin d'éliminer les cellules contaminantes non piégés.
13. Injecter la solution contenant la première molécule d'intérêt (0,2 mg / ml de 3.000 Da molécules de dextran neutre et anionique ou 1,5 mg / ml de 70 000 Da neutre molécule de dextran) dans le dispositif.
14. Appliquer cinq impulsions courtes (At = 30 ms avec 2 secondes d'intervalle) rapidement après l'injection de lasolution moléculaire et contrôler l'amplitude et la durée des impulsions électriques appliquées en temps réel à l'aide d'un oscilloscope.
15. Répétez l'étape 3.10 autant de fois que le nombre de molécules supplémentaires pour être livré. Pour chaque livraison moléculaire, incuber les cellules pour 100 s dans la solution moléculaire puis rincer l'appareil avec la solution de lavage pour 100 s pour éliminer les molécules excédentaires.
16. Libérer les cellules dans une plaque à 96 puits pour l'analyse en aval en réduisant la pression de fonctionnement inférieure à 5 psi. REMARQUE: Environ 100 pi de solution avec 100 cellules est prélevé sur chaque version.
17. Exécutez l'expérimental étapes 3.9 par 3.16 trois fois de recueillir suffisamment de cellules pour la cytométrie de flux.
18. Centrifuger la plaque de 96 puits contenant des cellules traitées pendant 5 min à 228 x g.
19. Eliminer le surnageant qui contient des molécules fluorescentes excès.
20. Remettre en suspension les cellules dans du DPBS pour cytométrie de flux.
21. Les cellules de charge dans le cytomètre de flux pour u moléculaireptake analyse de l'efficacité.

Résultats

Le électroporateur microfluidique parallèle développé livré macromolécules avec des tailles variées et des charges électriques dans les cellules de cancer du sein métastatique vivre. Livraison réussie moléculaire a été déterminée qualitativement par des changements dans l'intensité de fluorescence des cellules par électroporation en orbite autour de la surveillance in situ et confirmée par des mesures quantitatives par analyse de cytométrie en flux. Figure 4A montre que 9...

Discussion

Avec la nouvelle plate-forme d'électroporation parallélisée, l'amélioration de 10 fois le débit et l'efficacité de la livraison multi-molécule qui a été accompli en plus de tous les avantages que le système unique de la chambre précédemment développé fournit. ¹⁸ mérite Auparavant disponibles incluent (i) pré-purification de des cellules cibles avec une distribution uniforme de la taille de l'amélioration de la viabilité, (ii) un contrôle précis et dosage individuel molécul...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
MDA-MB-231 cancer cell line	American Type Culture Collection (ATCC)	HTB-26
Leibovitz’s L-15 Medium	Cellgro, Mediatech, Inc.	10-045-CV
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco, Life Technologies	16000-044
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Cellgro, Mediatech, Inc.	21-030
Trypsin	Gibco, Life Technologies	25200-056
Flow Cytometer easyCyte HT	Millipore	0500-4008
Oxygen Plasma Cleaner	Technics Micro-RIE
Dektak 6M surface profiler	Veeco
KMPR 1050	Microchem
SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT	Dow Corning
Compressed Nitrogen gas	Airgas	NI 300
High Pressure Regulator	McMaster-Carr	6162K22
Downstream regulator	McMaster-Carr	4000K563
High-speed 3/2way-8 valve manifold	Festo
Inline Check Valve	Idex Health and Science	CV3320
5/32" OD x 3/32" ID Polyurethan tubes	Pneumadyne	PU-156F-0
1/4" OD X 0.17" ID Polyurethan tubes	Pneumadyne	PU-250PB-4
1/16" PEEK tubings	Festo	P1533
1/32" PEEK tubings	Idex Health and Science	P1569
PEEK tubing unions	Idex Health and Science	P881
Pulse Generator	HP	8110A
Aluminum Wire	Bob Martin Company	6061 ALUM
Oscilloscope	Agilent	DSO3062A
50 ml centrifuge tubes	VWR	21008-178
15 ml centrifuge tube	VWR	21008-216
T75 culture flask	VWR	82050-862
Dextran, Tetramethylrhodamine, 3,000 MW, Anionic	Gibco, Life Technologies	D3307
Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral	Gibco, Life Technologies	D1819
Dextran, Texas Red, 3,000 MW, Neutral	Gibco, Life Technologies	D3329